豬德?tīng)査跔畈《炯{米PCR檢測(cè)方法的建立

董志珍，張 霞，柴銘駿，陳小金，賈 赟，肇慧君，帥江冰

（1. 天津海關(guān)動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心，天津 300451；2. 大連海關(guān)技術(shù)中心，遼寧大連 116001；3. 杭州海關(guān)技術(shù)中心，浙江杭州 310007）

病毒性腹瀉是影響豬群生產(chǎn)的一種常見(jiàn)的多發(fā)性疾病，而引起腹瀉的病原多而復(fù)雜[1-2]。張志等[3]對(duì)我國(guó)5 省（自治區(qū)）的部分規(guī)模豬場(chǎng)開(kāi)展研究，發(fā)現(xiàn)豬場(chǎng)的腹瀉流行率達(dá)71.99%。2014 年，美國(guó)23 個(gè)州共暴發(fā)了2 692 起腹瀉疫情，其他國(guó)家如德國(guó)、法國(guó)、瑞士、意大利、韓國(guó)、泰國(guó)和越南等國(guó)也在近年來(lái)相繼暴發(fā)腹瀉疫情。疫情流行范圍廣，傳播迅速，造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[4-6]。其中，美國(guó)俄亥俄州豬場(chǎng)發(fā)生的疫情，臨床癥狀與豬流行性腹瀉相似，呈現(xiàn)水樣腹瀉并且死亡率達(dá)30%~40%。Wang 等[4]對(duì)該疫情進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有類冠狀病毒樣顆粒，最終確定病原為豬德?tīng)査跔畈《荆≒DCoV）。隨后該疫情迅速傳播到美國(guó)其他州和加拿大，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成明顯的經(jīng)濟(jì)損失[5]。Marthaler等[7]對(duì)美國(guó)部分地區(qū)豬場(chǎng)樣品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)PDCoV 陽(yáng)性率為30%，表明PDCoV 在美國(guó)中東部普遍存在。

隨著科技發(fā)展，納米技術(shù)滲透到各個(gè)領(lǐng)域，尤其是分子生物學(xué)領(lǐng)域，而納米技術(shù)與PCR 技術(shù)的交叉滲透更是值得關(guān)注。研究人員發(fā)現(xiàn)，將引物連接在納米粒子表面后，顯著提高了PCR 的特異性，改善了非特異性擴(kuò)增，并提高了擴(kuò)增效率[8-11]。

目前，針對(duì)PDCoV 的研究相對(duì)較少。雖有研究人員已建立了RT-PCR、探針?lè)晒釶CR、ELISA 等檢測(cè)方法，但未見(jiàn)PDCoV 納米PCR 檢測(cè)方法的相關(guān)報(bào)道。納米PCR 具有操作簡(jiǎn)便、成本低等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于基層實(shí)驗(yàn)室。本研究建立的納米PCR 檢測(cè)方法，旨在豐富PDCoV 檢測(cè)技術(shù)體系，為進(jìn)出境活豬病毒性腹瀉疫病檢測(cè)及防控、預(yù)警提供有力的技術(shù)手段，為防止外來(lái)重要?jiǎng)游镆卟魅胩峁┍Ｕ稀?/p>

1 材料與方法

1.1 病毒

試驗(yàn)中使用的病毒株包括：豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、豬輪狀病毒（porcine rotavirus，PoRV）、豬傳染性胃腸炎病毒（transmissible gastroenteritis virus，TGEV）。腹瀉三聯(lián)活苗分別為弱毒CV777 株、弱毒華毒株和NX 株，由哈爾濱維科生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司生產(chǎn)。

1.2 臨床樣品

2017 年收集的國(guó)內(nèi)部分省市（天津市、北京市、上海市、山西省、遼寧省、黑龍江省和浙江省等）豬場(chǎng)腹瀉糞便62 份，2017 年本實(shí)驗(yàn)室收集的由天津海關(guān)進(jìn)境的種豬糞拭子（源自加拿大和美國(guó)）268 份。

1.3 主要試劑和儀器

M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶、隨機(jī)引物，購(gòu)于Promega公司；Nano-taq 試劑盒，購(gòu)自山東大正生物有限公司；pUC19、DNA Marker、Premix ExTaq、Easy dillution，購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；RNA提取試劑盒，購(gòu)自上海捷瑞生物技術(shù)有限公司；Axygen DNA Gel Extraction Kit，購(gòu)自Axygen 公司。

旋渦震蕩器QL-861，購(gòu)自江蘇省海門市麒麟醫(yī)用儀器廠；潔凈工作臺(tái)SW-CJ-2D，購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備有限公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)Neofuge13R，購(gòu)自上海力申科學(xué)儀器有限公司；普通PCR 儀，購(gòu)自Bio-Rad 有限公司；金屬恒溫連接儀，購(gòu)自Eppendorf 公司。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成

根 據(jù)GenBank 中 登 錄 的PDCoV 毒 株（KP757891）基因序列，利用Primer premier 6.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，用于擴(kuò)增PDCoV M 基因全長(zhǎng)片段，預(yù)期擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度為654 bp。將PDCoV M 基因的完整編碼序列克隆到質(zhì)粒載體pUC-19 中作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，得到pUC-19-PDCoV-M 重組子；用試劑盒純化重組質(zhì)粒pUC-19-PDCoV-M，并用紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度；通過(guò)PCR和測(cè)序確認(rèn)重組子，并置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩ＴO(shè)計(jì)另外一組引物，擴(kuò)增PDCoV M 基因的部分保守序列用于納米PCR，預(yù)測(cè)擴(kuò)增長(zhǎng)度為536 bp。引物由上海捷瑞合成生物技術(shù)有限公司合成，特異性引物序列見(jiàn)表1。

1.5 病毒核酸提取和反轉(zhuǎn)錄

取500 mg 陽(yáng)性糞便樣品加入500 μL 滅菌生理鹽水，5 000 r/min 4 ℃離心30 min，棄沉淀保留上清；糞拭子采集完成后立即置于預(yù)先加有1 mL生理鹽水的15 mL 離心管中，振蕩洗滌并擠干，棄去拭子，5 000 r/min 4 ℃離心30 min，棄沉淀保留上清。取100 μL 上清，按試劑盒操作說(shuō)明提取RNA，收集RNA 置于-70 ℃保存。

表1 引物序列

以上述方法提取的RNA 為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆?。反?yīng)體系30 μL：隨機(jī)引物1.0 μL、5×RT Buffer 6.0 μL、dNTP 1.0 μL、Rnase Inhibitor 1.0 μL、M-MLV 反轉(zhuǎn) 錄 酶1.0 μL、RNA 12.0 μL，用ddH2O 補(bǔ) 至30 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?7 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min。

1.6 納米PCR 和常規(guī)PCR

使用引物組（M2F 和M2R）分別進(jìn)行PDCoV 納米PCR 和常規(guī)PCR 分析，擴(kuò)增預(yù)測(cè)長(zhǎng)度為536 bp 的PCR 產(chǎn)物。

納米PCR 反應(yīng)體系（12.0 μL）：2×納米緩沖 液6.0 μL，M2F 和M2R（10 μmol/ L）各0.5 μL，模板或標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒0.5 μL，TaqDNA 聚合酶（5 U/μL）0.1 μL，加ddH2O 至12.0 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s 和72 ℃ 15 s（30個(gè)循環(huán)）；72 ℃ 10 min。

常 規(guī)PCR 反 應(yīng) 體 系（25.0 μL）：ExTaq Premix 12.5 μL，M2F 和M2R（10 μmol/L）各1.0 μL，模板1.0 μL，ddH2O 9.5 μL。擴(kuò)增條件為：94℃ 5 min，94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s 和72 ℃30 s（30個(gè)循環(huán)）；72 ℃ 5 min。

1.7 納米PCR 反應(yīng)條件優(yōu)化

用M2F 和M2R 引物對(duì)、反轉(zhuǎn)錄的cDNA 模板進(jìn)行PDCoV 納米PCR 反應(yīng)，并優(yōu)化退火溫度、模板和引物體積等因素。Bio-Rad 熱循環(huán)儀的退火溫度范圍為52~60 ℃，模板體積范圍為0.5~2.0 μL，引物體積范圍為0.5~2.0 μL。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳后在凝膠成像儀上進(jìn)行分析。

1.8 納米PCR 敏感性

使 用Takara 的easy dillution，對(duì)pUC-19-PDCoV-M 質(zhì)粒進(jìn)行10 倍梯度稀釋（范圍為108~102copies/μL），將PDCoV 納 米PCR 測(cè) 定檢測(cè)的檢測(cè)下限與常規(guī)PCR 進(jìn)行比較，并使用ddH2O 作陰性對(duì)照，將PCR 產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。

1.9 納米PCR 特異性

對(duì)TGEV、PEDV 和PRoV 等 豬 腹 瀉 病 毒cDNA 進(jìn)行納米PCR 檢測(cè)，以確定本試驗(yàn)建立的方法是否對(duì)其他幾種常見(jiàn)腹瀉病毒有交叉反應(yīng)；將PCR 產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，觀察結(jié)果。

1.1 0 臨床樣本檢測(cè)

將2017 年收集的62 份糞便樣品及268 份進(jìn)境種豬糞拭子，按照1.5 所述方法提取RNA 并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行納米PCR 檢測(cè)，同時(shí)以上述樣品的cDNA 作為模板進(jìn)行常規(guī)PCR 檢測(cè)，對(duì)比這2 種方法的檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 納米PCR 反應(yīng)條件優(yōu)化

本研究比較了3 個(gè)長(zhǎng)度分別為536、300 和426 bp 的引物對(duì)。選擇引物對(duì)（M2F 和M2R）用于常規(guī)PCR 和納米PCR 測(cè)定（數(shù)據(jù)未顯示），擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1-A。納米PCR 檢測(cè)方法的優(yōu)化包括調(diào)整退火溫度、引物和模板體積。結(jié)果顯示，退火溫度為52 ℃時(shí)，擴(kuò)增效果最好（圖1-B）。使用該退火溫度，發(fā)現(xiàn)條帶密度為0.5 μL（10 μmol/L）的引物體積（圖1-C）和0.5 μL 的模板體積（圖1-D）時(shí)最大，擴(kuò)增效率最高。

基于PDCoV 納米PCR 測(cè)定的不同退火溫度、引物和模板體積獲得的結(jié)果，建立了最佳反應(yīng)體系：2×納米緩沖液6.0 μL，上游和下游引物（10 μmol/ L）各0.5 μL，模板或標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒0.5 μL，TaqDNA 聚合酶（5 U/μL）0.1 μL，加ddH2O 至 12 μL。反應(yīng)條件如下：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s 和72 ℃ 15 s（30 個(gè)循環(huán)）；72 ℃ 10 min。

2.2 納米PCR 敏感性

敏感性試驗(yàn)顯示，PDCoV 納米PCR 最低檢測(cè)限為102copies/μL，比常規(guī)PCR（103copies/μL）略高（圖2）。

2.3 納米PCR 特異性

瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，PDCoV 納米PCR測(cè)定與其他幾種相關(guān)病毒沒(méi)有交叉反應(yīng)（圖3）。

2.4 臨床樣品檢測(cè)

對(duì)臨床樣品同時(shí)進(jìn)行PDCoV 納米PCR 和常規(guī)PCR 檢測(cè)，糞便樣品的陽(yáng)性檢出數(shù)分別是20 份和16 份（表2），進(jìn)境種豬糞拭子樣品均呈陰性。與常規(guī)PCR 相比，納米PCR 的相對(duì)靈敏度更高。

3 討論

能夠引起豬腹瀉的病原有很多，包括細(xì)菌、病毒和寄生蟲(chóng)等，其中由病毒引起的腹瀉對(duì)仔豬影響最大。PDCoV 作為仔豬病毒性腹瀉新病原，為全球仔豬病毒性腹瀉防控工作帶來(lái)了新挑戰(zhàn)。因此，世界各國(guó)的研究人員針對(duì)PDCoV 開(kāi)展了一系列研究，包括病毒基因序列分析、蛋白功能研究、病毒分離培養(yǎng)以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、檢測(cè)方法等。本研究通過(guò)分析GenBank 上登錄的PDCoV 國(guó)內(nèi)外毒株基因序列，選擇編碼結(jié)構(gòu)蛋白的M 基因作為靶基因設(shè)計(jì)特異性引物，建立了PDCoV 納米PCR 檢測(cè)方法。試驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法具有較好的特異性，敏感性。但本方法對(duì)268 份進(jìn)境種豬糞拭子檢測(cè)結(jié)果均為陰性。這與Marthaler 等[7]的研究結(jié)果（陽(yáng)性率30%）存在一定的差異。產(chǎn)生這種情況的原因有兩個(gè)：一方面由于美國(guó)發(fā)生疫情后，原質(zhì)檢總局要求針對(duì)源自美國(guó)的生豬增加PDCoV 檢測(cè)項(xiàng)目，美國(guó)方面也在預(yù)檢時(shí)進(jìn)行PEDV 和PDCoV 檢測(cè)，故本實(shí)驗(yàn)收集的進(jìn)境種豬糞拭子檢測(cè)結(jié)果為陰性；另一方面就目前文獻(xiàn)資料報(bào)道，3 種腸道冠狀病毒致病致死的主要對(duì)象是仔豬，而成年豬（種豬、母豬）對(duì)這些病毒呈現(xiàn)一過(guò)性感染，本實(shí)驗(yàn)室收集的樣品均為種公豬，故檢測(cè)均為陰性，這符合實(shí)際情況。

圖1 納米 PCR 擴(kuò)增條件優(yōu)化結(jié)果

圖2 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

M. 100 bp DNA Ladder；1. PDCoV；2. TGEV；3. PED；4. PRoV；5. 陰性對(duì)照

表2 糞便樣品PDCoV 檢測(cè)結(jié)果 單位：份

圖3 納米PCR 特異性試驗(yàn)結(jié)果

納米PCR 技術(shù)是將納米顆粒的特殊性能應(yīng)用于PCR 反應(yīng)中的新技術(shù)，通過(guò)在反應(yīng)體系中添加納米顆粒，可顯著提高PCR 反應(yīng)的擴(kuò)增效率，同時(shí)提升方法的特異性和敏感性。本研究將納米PCR技術(shù)應(yīng)用于PDCoV 檢測(cè)，可實(shí)現(xiàn)快速、靈敏、特異的檢測(cè)目的，并且操作簡(jiǎn)單。同時(shí)所建立的納米PCR 檢測(cè)方法反應(yīng)體系僅為12 μL，因而大幅度節(jié)約了成本，適合大批量樣本檢測(cè)。該檢測(cè)方法的建立為防止外來(lái)重要?jiǎng)游镆卟魅胩峁┝擞辛Φ募夹g(shù)手段和保障，有助于進(jìn)一步完善生豬檢驗(yàn)檢疫體系。