4 例禽戊型肝炎病例的實驗室診斷及ORF2 基因遺傳進化分析

張 翔，劉豐波，馬 冬，宋姍姍，劉 東，劉紅祥，李 彬，王群義，欒棟祖，劉 平，邵三敏

（青島易邦生物工程有限公司，山東青島 266000）

禽戊型肝炎病毒（avian hepatitis E virus，aHEV）屬于肝炎病毒科、正戊肝病毒屬B 種，是一種無囊膜的單股正鏈RNA 病毒，病毒顆粒呈圓球狀，為二十面體對稱結(jié)構(gòu)，直徑為27~32 nm[1]。世界范圍內(nèi)分離到的aHEV 主要流行4 個基因型：澳大利亞和韓國的基因1 型、美國的基因2 型、中國和歐洲的基因3 型、匈牙利和中國臺灣的基因4 型[2]。aHEV 基因組包含3 個開放閱讀框（open reading frame，ORF），分 別 為ORF1、ORF2 和ORF3。有研究指出，使用針對ORF2 設計的引物，擴增序列構(gòu)建的進化樹與全基因組序列構(gòu)建的進化樹一致[3]。

2018 年山東、遼寧、吉林、陜西的4 個產(chǎn)蛋期雞群發(fā)病，臨床表現(xiàn)為：大群精神良好，采食飲水正常，但持續(xù)出現(xiàn)打蔫，每天出現(xiàn)零星死淘，日死淘率為0.1%~0.2%，病程可持續(xù)1~2 個月，累計死亡率為5.0%~15.0%。采集病雞肝臟和脾臟提取RNA，利用RT-PCR 對aHEV-ORF2 基因進行擴增并測序，以期為aHEV 的診斷和深入研究提供分子生物學依據(jù)，為我國禽戊型肝炎防控措施的制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 采集自山東、遼寧、吉林、陜西4個地區(qū)雞場中疑似aHEV 感染的肝臟和脾臟樣品，無菌處理后，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑 RNAout 提取試劑盒：購自天恩澤生物公司；HiScript?II One Step RT-PCR Kit：購自諾唯贊生物公司；DL 2 000 bp DNA Marker：購于寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 參照GenBank 已公布的aHEV-ORF2 基因核苷酸序列，利用Oligo 6.0 引 物 設 計 軟 件，設 計 擴 增aHEV-ORF2 基因的特異性引物。上游引物：aHEV-ORF2-F:5'-F CCCAGCCGGAAGCAGGCGCGG-3；'下游引物：aHEVORF2-R：5'-GGGTGGTGAGGGGAATGTCCTAC-3'。引物由北京華大基因科技有限公司合成，預期擴增目的片段為1 700 bp。

1.2.2 核酸提取 按核酸提取試劑盒和核酸提取儀說明書提取組織RNA。

1.2.3 核酸擴增 用 RT-PCR 一步法試劑盒擴增cDNA：45 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min；94 ℃預變性3 min；94 ℃變性40 s；53 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min，共30 個循環(huán)，72 ℃再延伸10 min；4 ℃保存10 min。PCR 產(chǎn)物用1.0% 瓊脂糖凝膠進行電泳，置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。

1.2.4 序列分析 挑取陽性樣品產(chǎn)物送上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。用MegAlign 和Mega 6.0 軟件對測定的aHEV-ORF2基因序列與GenBank 中部分代表性毒株序列進行同源性比較和遺傳進化分析。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 統(tǒng)計不同地區(qū)發(fā)病雞群的品種、日齡、日死淘率以及檢測樣品的PCR 陽性率。

2 結(jié)果

2.1 病雞剖檢變化

剖檢病雞可見：肝臟腫大、出血、輕微黃染，有小的或斑狀的壞死點或壞死斑；肝臟易碎如泥，被膜下有凝血塊（圖1-A）。脾臟腫大，為正常的2~3 倍，破裂出血（圖1-B）。腹部出現(xiàn)卵黃性腹膜炎（圖1-C），卵泡萎縮、變形，有的呈“鐘擺狀”（圖1-D）。

圖1 臨床發(fā)病雞剖檢變化

2.2 RT-PCR 檢測

對送檢樣品處理后進行RT-PCR 檢測，發(fā)現(xiàn)送檢的4 份樣品檢測到的目的條帶大小均約1 700 bp，與目的片段大小一致（圖2）。將測序結(jié)果與GenBank 比對，結(jié)果均為aHEV 陽性。

圖2 分離株的RT-PCR 鑒定結(jié)果

2.3 統(tǒng)計分析

4 個地區(qū)的雞群均在產(chǎn)蛋期（196~480 d）發(fā)病，品種為蛋雞和肉種雞，日死淘數(shù)量為10~30只（表1）。

2.4 ORF2 核苷酸序列同源性分析

對4 個分離毒株的ORF2 核苷酸序列，利用MegAlign 進行同源性比較。結(jié)果（圖2）顯示，分離株間的ORF2 基因同源性為84.5%~94.5%，分離株與基因1 型的澳大利亞株和韓國株同源性為81.6%~82.8%，與基因2 型的美國原型株和無毒株同源性為80.9%~82.8%，與基因3 型的歐洲株和中國株同源性為80.8%~82.5%，與基因4 型的匈牙利株和中國臺灣株同源性為81.4%~82.6%。4 株分離毒株ORF2 核苷酸與已報道的4 個基因型同源性均較低（＜84%）。

表1 4 個地區(qū)發(fā)病雞群RT-PCR 檢測情況統(tǒng)計

2.5 ORF2 基因遺傳進化分析

利用Mega 6.0 對4 株分離株的ORF2 基因進行序列比較，繪制遺傳進化樹。結(jié)果（圖3）顯示：4 株aHEV 均屬于戊型肝炎B 種，形成獨立的基因分支，但不屬于已報道的4 個基因型。

3 討論

上世紀八九十年代開始，澳大利亞、美國、加拿大等陸續(xù)報道了雞的大肝大脾?。╞ig liver and spleen disease，BLS）或肝炎脾大綜合征（hepatitis-splenomegaly，HS）[4-5]，2001 年 分 離到病毒并將其命名為aHEV[6]。早在1994 年我國就有該病抗體陽性的報告，2010 年從肉種雞群中分離到aHEV[7]，2014 年從海蘭褐雞群中分離到基因3 型aHEV[8]。血清學調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國南方雞群aHEV 血清陽性率約為33.0%[9]，廣東、山東、黑龍江等地的雞群血清陽性率約為28.3%。這些血清學調(diào)查結(jié)果均顯示，我國已有aHEV 的廣泛流行[10]。但血清學調(diào)查結(jié)果只能反映雞群的抗體水平，無法確定雞群的帶毒情況。因病毒分離難度較大，而分子生物學方法操作簡單、結(jié)果直觀、敏感性高、特異性強、重復性好，已被廣泛應用于臨床檢測。ORF2 基因編碼蛋白是aHEV 的結(jié)構(gòu)蛋白，其擴增序列構(gòu)建的進化樹與全基因組序列構(gòu)建的進化樹一致，是目前國內(nèi)外主要的分型依據(jù)。

通過RT-PCR 方法，對山東、遼寧、吉林、陜西4 個地區(qū)發(fā)病雞群采集的肝臟和脾臟進行檢測，均檢測到aHEV 陽性，此疾病在蛋雞和肉種雞的產(chǎn)蛋期均易流行，持續(xù)時間較長，累計死淘率較高，應引起養(yǎng)雞企業(yè)的高度重視。

圖2 aHEV-ORF2 基因部分序列同源性分析結(jié)果

圖3 aHEV-ORF2 基因遺傳進化樹

測序分析發(fā)現(xiàn)，檢出的4 株aHEV 均屬于戊型肝炎B 種，不屬于現(xiàn)已報道的4 個基因型，為新亞型。核苷酸同源性比對分析發(fā)現(xiàn)，4 株aHEV與已報道的4 個基因型代表株同源性均較低（＜84%），4 株分離株之間同源性為84.55~94.5%。目前尚無關于aHEV 新亞型的相關報道，本研究為我國進一步的aHEV 研究提供了基礎和依據(jù)。

雖有報道稱，可采用免疫亞單位疫苗防控aHEV[11]，但目前尚無商品化疫苗可用，因此養(yǎng)雞場只能通過加強生物安全防止本病傳入。

4 結(jié)論

本研究確診了山東、遼寧、吉林、陜西4 個地區(qū)引起雞群異常死淘的病因為aHEV 感染；通過ORF2 基因序列比較，發(fā)現(xiàn)分離株均屬于戊型肝炎B 種，形成獨立的基因分支，為新亞型。本試驗為我國的aHEV 深入研究提供了基礎和依據(jù)。