陜西省榆林市口蹄疫免疫抗體檢測

王雅媛，白崇生，權(quán)富生，劉健鵬

（1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)，陜西楊凌 712100；2. 榆林市動物疫病預(yù)防控制中心，陜西榆林 719000）

口蹄疫（FMD）流行范圍廣，感染力強(qiáng)，四季均可發(fā)病，難以根除，對畜牧業(yè)影響極大。FMD 是我國強(qiáng)制免疫動物病種，疫苗免疫是控制和消滅FMD 最有效的手段之一。全球范圍內(nèi)，許多國家或地區(qū)將疫苗免疫作為FMD 防控的首選措施。已經(jīng)研發(fā)成功的FMD 疫苗種類主要包括常規(guī)滅活疫苗、基因工程疫苗、DNA 疫苗、合成肽疫苗、重組活載體疫苗、可飼疫苗等。目前，很多國家采用滅活疫苗進(jìn)行FMD 免疫預(yù)防[1]。為做好FMD防控工作，我國每年都要投入大量人力、財力實施FMD 強(qiáng)制免疫。同時，F(xiàn)MD 免疫后的監(jiān)測工作也尤為重要。FMD 病毒免疫原性弱，加之受其他因素影響，臨床常見免疫效果不理想甚至免疫失敗的例子[2]。

榆林市每年春秋各進(jìn)行一次FMD 強(qiáng)制免疫，對羊使用O 和Asia I 型二價疫苗免疫，對豬使用O 型單價疫苗免疫，對黃牛和肉牛使用O 和Asia I型二價疫苗免疫，對奶牛使用O、Asia I 和A 型三價疫苗免疫。通常，規(guī)模養(yǎng)殖場自主執(zhí)行程序化免疫，散養(yǎng)戶按國家強(qiáng)制免疫方案執(zhí)行。為評估FMD 免疫后抗體水平，對陜西省榆林市FMD 免疫效果進(jìn)行實驗室檢測，并對單次免疫和加強(qiáng)免疫后FMD 抗體水平和變化趨勢進(jìn)行分析，以期為制定科學(xué)規(guī)范免疫程序和進(jìn)一步做好口蹄疫防控工作提供技術(shù)支持。

1 試驗材料

1.1 血清樣品

血清樣品采自榆林市12 個縣市區(qū)。2017 年11 月，根據(jù)每個縣豬、牛、羊存欄量，隨機(jī)選擇1~2 個規(guī)?；驁?、1 個規(guī)?；i場、1 個規(guī)?；龊?0 個散養(yǎng)戶，每個規(guī)模場隨機(jī)采集樣品不少于30 份，每個散養(yǎng)戶不少于3 份。共采集規(guī)模場羊血清樣品480 份、豬血清樣品450 份、牛血清樣品360 份，采集散養(yǎng)戶羊血清樣品250 份、豬血清樣品185 份、牛血清樣品165 份。對采集的樣品進(jìn)行羊O 型、羊Asia I 型、豬O 型、牛O 型、牛Asia I 型和牛A 型FMD 免疫抗體檢測。

2018 年4 5 月，從所采樣品規(guī)模場中，選擇3 個羊場、2 個豬場和2 個牛場進(jìn)行加強(qiáng)免疫后抗體水平變化研究。每個場進(jìn)行2 次血樣采集：第1次于首免后30 d 采集（同時進(jìn)行第2 次免疫），第2 次于二免（加強(qiáng)免疫）后30 d 采集，每場每次采集血樣30 份，共采集樣品420 份。

所有血清樣品按常規(guī)方法分離后，置-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 檢測試劑

O、Asia I 型FMD 二 價 滅 活 疫 苗：批 號17262010，金宇保靈生物藥品有限公司生產(chǎn)；豬O型FMD 滅活疫苗：批號20170305，必威安泰生物科技有限公司生產(chǎn)；O、A、Asia I 型FMD 三價滅活疫苗：批號1703026，天康生物股份有限公司生產(chǎn)；O 型FMD 抗體液相阻斷 ELISA 檢測試劑盒：批號2017090701、2018031201，蘭州獸醫(yī)研究所生產(chǎn)；Asia I 型FMD 抗體液相阻斷 ELISA 檢測試劑盒：批號2017090301、2018030901，蘭州獸醫(yī)研究所生產(chǎn)；A 型FMD 抗體液相阻斷 ELISA 檢測試劑盒：批號2017091601、2018031501，蘭州獸醫(yī)研究所生產(chǎn)。

1.3 儀器

超純水機(jī)：型號1810B，重慶摩爾水處理設(shè)備有限公司生產(chǎn)；普通離心機(jī)：型號600A，北京白洋醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)；電熱恒溫培養(yǎng)箱：型號DHP-9080B，北京白洋醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)；自動洗板機(jī)：型號ELX50，美國伯騰（BioTe）儀器有限公司生產(chǎn)；微量振蕩器：型號ZW-A，金壇市科析儀器有限公司生產(chǎn)；FC 型酶標(biāo)儀：型號DHP-9080B，賽默飛世爾（上海）儀器有限公司生產(chǎn)。

2 檢測方法

按 照O 型FMD 液 相 阻 斷ELISA 試 劑 盒、Asia I 型FMD 液相阻斷ELISA 試劑盒產(chǎn)品和A 型FMD 液相阻斷ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行操作。

3 結(jié)果與分析

3.1 O 型

檢測結(jié)果（表1）顯示：榆林市規(guī)模場和散養(yǎng)戶牛、羊、豬平均O 型抗體合格率均低于70%，且規(guī)模場和散養(yǎng)戶間抗體合格率差異極顯著（P ≤0.01），牛羊與豬間抗體合格率差異顯著（P ≤0.05）。

3.2 Asia I 型

檢測結(jié)果（表2）顯示：榆林市規(guī)模場羊Asia I 型抗體合格率達(dá)到了70%的標(biāo)準(zhǔn)，而散養(yǎng)戶羊Asia I 型抗體合格率較低，兩者的抗體水平差異極顯著（P ≤0.01）；規(guī)模場和散養(yǎng)戶的牛Asia I 型抗體合格率均低于70%，但兩者之間差異極顯著（P ≤0.01）。羊Asia I 型綜合抗體合格率高于牛，兩者差異顯著（P ≤0.05），但均低于70%。

表1 O 型FMD 免疫抗體檢測結(jié)果

表2 Asia I 型FMD 免疫抗體水平檢測結(jié)果

3.3 A 型

檢測結(jié)果（表3）顯示：榆林市奶牛規(guī)模場和散養(yǎng)戶A 型抗體合格率均低于70%，兩者之間差異極顯著（P ≤0.01）。

3.4 加強(qiáng)免疫抗體檢測

檢測結(jié)果（表4）顯示：單次FMD 免疫30 d 后，羊、豬、牛所有血清型抗體合格率均低于70%，間隔1 個月進(jìn)行加強(qiáng)免疫30 d 后，均極顯著升高至80%以上（P ≤0.01）。

表3 奶牛A 型FMD 免疫抗體水平檢測結(jié)果

表4 FMD 加強(qiáng)免疫抗體變化

4 討論

FMD 侵入我國多年，并對我國畜牧業(yè)造成極大損害。疫苗免疫是所有FMD 防控措施中作用最佳的一種[3]。免疫后的抗體檢測是評價免疫效果的重要方式，加強(qiáng)免疫抗體監(jiān)測能夠及時發(fā)現(xiàn)動物免疫抗體變化情況，能夠提示養(yǎng)殖者在免疫抗體水平下降時及時補(bǔ)免，方便制定科學(xué)的免疫程序，有效提高群體抗感染能力[4]。我國動物強(qiáng)制免疫技術(shù)方案要求，F(xiàn)MD 免疫抗體合格率必須達(dá)到70%以上。本研究對榆林市12 個縣市區(qū)隨機(jī)采集的豬、牛、羊血清進(jìn)行O、Asia I 和A 型FMD 抗體水平檢測和分析。雖然在本研究結(jié)束時，Asia I 型FMD 已經(jīng)退出國家強(qiáng)制免疫計劃，但本次的Asia I 型檢測結(jié)果能夠為日后防范Asia I 型FMD 再次發(fā)生和徹底消滅Asia I 型FMD 提供技術(shù)參考。

4.1 榆林市FMD 免疫抗體水平普遍不高的原因

檢測發(fā)現(xiàn)，榆林市羊（O、Asia I）、豬（O）、牛（O、Asia I 和A）的FMD 綜合抗體水平均低于70%?？贵w水平偏低一般跟疫苗因素（免疫原性弱或種毒不理想）、疫苗運輸和保存條件不佳、免疫程序不合理、母源抗體高、免疫抑制、免疫方法不當(dāng)、免疫劑量不準(zhǔn)確以及采樣時間點不合理等多種因素有關(guān)[5]。強(qiáng)制免疫過程中，大多數(shù)養(yǎng)殖場戶的養(yǎng)殖檔案材料不全或無養(yǎng)殖檔案，免疫過程中對動物群體狀況不清，免疫程序不合理現(xiàn)象居多，也難以規(guī)避母源抗體和免疫抑制等因素的影響；防疫員在短時間內(nèi)完成大量動物群體的免疫工作，工作任務(wù)繁重，難免造成免疫劑量不準(zhǔn)或免疫方法不當(dāng)?shù)痊F(xiàn)象；冷藏設(shè)備條件差，尤其在散養(yǎng)戶免疫過程中，疫苗保存溫度過高可能導(dǎo)致疫苗效價下降；此外，監(jiān)測采樣過程中從事基層工作的業(yè)務(wù)人員不夠仔細(xì)，控制采樣時間點不合理也能造成抗體檢測結(jié)果偏低。結(jié)合加強(qiáng)免疫后FMD 抗體水平變化情況來分析，本次研究發(fā)現(xiàn)，造成榆林市O、Asia I 和A 型FMD 抗體水平普遍較低的主要原因應(yīng)該是疫苗因素導(dǎo)致的單次免疫不能產(chǎn)生較高水平的免疫抗體，達(dá)不到有效保護(hù)水平。

4.2 養(yǎng)殖場、散養(yǎng)戶和不同種屬間存在抗體差異的原因

從養(yǎng)殖場和散養(yǎng)戶FMD 抗體檢測結(jié)果差異對比來看，散養(yǎng)戶FMD 抗體水平普遍極顯著低于規(guī)模場抗體水平，與王建輝[6]的研究結(jié)果一致。造成該結(jié)果的原因：一方面是因為規(guī)模場防疫意識強(qiáng)，實行程序化免疫，并配備有專門的獸醫(yī)人員，免疫工作更加專業(yè)化；另一方面是因為散養(yǎng)戶養(yǎng)殖條件差、防疫意識不強(qiáng)、不執(zhí)行程序化免疫、免疫方式不當(dāng)、疫苗注射技術(shù)不夠?qū)I(yè)、疫苗保存不規(guī)范、用苗劑量不足，導(dǎo)致疫苗效價降低或失效等。從不同動物種屬來看，牛、羊免疫O 型FMD 疫苗后抗體水平無顯著差異，這可能是由于牛羊使用的疫苗（O、Asia I 型FMD 二價滅活疫苗）相同，都是反芻動物造成的；而牛和豬O 型FMD、羊和豬O 型FMD 抗體水平差異顯著，這種差異可能是因為疫苗不同、豬和牛羊的種屬完全不同造成的。

4.3 加強(qiáng)免疫對FMD 抗體水平的影響

不少文獻(xiàn)報道FMD 疫苗免疫動物群體一般在28~30 d 抗體達(dá)到峰值[7-8]。因此，本研究對FMD加強(qiáng)免疫抗體水平的檢測分別于首免和加強(qiáng)免疫后30 d 進(jìn)行。從檢測結(jié)果來看，試驗養(yǎng)殖場的羊O 型、羊Asia I 型、豬O 型、牛O 型、牛Asia I型和牛A 型FMD 抗體在首次免疫后30 d 都低于70%；加強(qiáng)免疫后30 d，所有FMD 抗體合格率都極顯著升高至80%以上，達(dá)到了有效保護(hù)水平。寧華杰等[9]研究也表明，豬FMD 單次免疫單倍量和雙倍量的免疫抗體合格率都不能達(dá)到70%，與本研究結(jié)果一致，說明家畜種屬差異與免疫抗體水平的高低無重要關(guān)聯(lián)，表明在FMD 免疫過程中，如果要通過FMD 滅活疫苗免疫來達(dá)到有效的免疫抗體保護(hù)水平，就必須在FMD 首免1 個月后進(jìn)行加強(qiáng)免疫。

5 結(jié)論

研究表明：陜西省榆林市規(guī)模場羊Asia I 型和豬O 型FMD 免疫效果較好，抗體合格率達(dá)到了70%以上，散養(yǎng)戶以及羊O型和牛的免疫效果較差，均低于70%；FMD 一次免疫不能達(dá)到有效的免疫抗體保護(hù)水平，應(yīng)在首免1 個月后進(jìn)行加強(qiáng)免疫。本研究為FMD 免疫程序制定和進(jìn)一步做好FMD防控工作提供了參考。