葡萄SAP家族的鑒定與表達分析

丁蘭，顧寶，李培楹，舒欣，張劍俠

（西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點實驗室 陜西楊凌712100）

0 引言

【研究意義】葡萄（Vitis viniferaL.）是世界第三大水果，也是我國重要的果樹作物，但凍害一直是葡萄生產(chǎn)中存在的突出問題[1]，干旱、鹽堿等生長環(huán)境都給葡萄生產(chǎn)者和葡萄產(chǎn)業(yè)造成了不便和嚴重損失[2]。因此，研究逆境脅迫相關(guān)基因，有針對性地對葡萄進行基因改造，對提高葡萄的抗逆性具有重要意義[3]。SAP（Stress Associated Protein）蛋白家族是一類響應(yīng)和調(diào)控多種逆境脅迫的鋅指蛋白，在植物抵抗逆境脅迫中發(fā)揮著重要作用，開展葡萄SAP家族鑒定、生物信息學(xué)和表達分析，將為了解葡萄響應(yīng)逆境脅迫的分子機制奠定基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M展】鋅指蛋白是一類具有手指狀結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)控逆境相關(guān)基因，參與植物對生物和非生物脅迫的應(yīng)答反應(yīng)[4]。SAP家族具有AN1或A20保守結(jié)構(gòu)域，在動物中的研究較為成熟，現(xiàn)已研究得出位于蛋白N端的A20結(jié)構(gòu)域，由多個Cys2/Cys2鋅指基元組成，保守序列為 CX2-4CX11CX2C（X代表任意氨基酸），在免疫、發(fā)育和細胞增殖中都發(fā)揮了重要作用[5-6]。而對于C端的AN1結(jié)構(gòu)域，目前僅了解到它最早在編碼非洲爪蟾動物半球母體 RNA的蛋白中被發(fā)現(xiàn)，保守序列為CX2Cx9-12CXl-2CX4CX2HX5HXC，其具體功能并未明確[7]。在植物中，關(guān)于SAP家族的研究主要集中在水稻（Oryza sativa）[8]和擬南芥（Arabidopsis thaliana）[9]中，已分別鑒定出 18和 14個SAP家族基因，并已對其進行了較為系統(tǒng)的研究；在番茄（Solanum lycopersicum）[10]、棉花（Gossypium hirsutum）[4]、甘蔗（Saccharum officinarum）[11]、香蕉（Musa nanaL.）[12]、羊草（Leymus chinensis）[13]等植物中也對SAP有研究報道。目前在植物中鑒定出的SAP均響應(yīng)多種非生物脅迫，例如，水稻OsiSAP7負調(diào)控種子萌發(fā)早期對 ABA脅迫信號的響應(yīng)[14]，在水稻和煙草中過表達OsiSAP8可增強其對鹽堿、干旱、低溫脅迫的耐受性[15]，在水稻中過表達高粱SbSAP14可提高其耐鹽性[16]，過表達AlSAP可以提高旱地中水稻的產(chǎn)量[17]?！颈狙芯壳腥朦c】葡萄作為重要的經(jīng)濟果樹，迄今在葡萄中未有關(guān)于SAP的克隆和功能研究的報道，對于葡萄中SAP的數(shù)量、理化性質(zhì)和功能尚不清楚?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究通過SAP的保守結(jié)構(gòu)域，在NCBI數(shù)據(jù)庫和葡萄全基因組中搜索，鑒定SAP家族成員，分析基因理化性質(zhì)、染色體定位及系統(tǒng)發(fā)育等信息，同時研究葡萄SAP家族在多種逆境下的表達特征及生物節(jié)律特征，為進一步探究SAP功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

試驗于 2018年在西北農(nóng)林科技大學(xué)旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點實驗室進行。

1.1 試材與處理

前期對于葡萄寒脅迫下轉(zhuǎn)錄組分析所用試驗材料為山葡萄‘雙優(yōu)’（Vitis amurensiscv.Shuangyou）和歐洲葡萄‘紅地球’（Vitis viniferacv.Red Globe），保存于西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄種質(zhì)資源圃。本試驗所用試材為‘紅地球’試管苗，保存于本實驗室。2018年4月將生長情況一致的試管幼苗（長約12 cm）移栽至人工氣候室（條件設(shè)置為 25℃，200 μmol·m-2·s-1光照16 h，暗培養(yǎng)8 h）中培養(yǎng)3個月。對材料進行激素處理（50 μmol·L-1ABA、100 μmol·L-1SA）（等體積蒸餾水處理為對照），高鹽處理（400 mmol·L-1NaCl）和低溫處理（4℃）。具體步驟如下：在室溫下，將50 μmol·L-1ABA、100 μmol·L-1SA 和 400 mmol·L-1NaCl分別噴施在葡萄葉片上；低溫處理采用RXZ型人工氣候箱（條件設(shè)置為 4℃，200 μmol·m-2·s-1光照16 h，暗培養(yǎng)8 h）；每個處理設(shè)置3組重復(fù)，分別在0、0.5、1、2、4、8、12和24 h采集葉片，并分別于北京時間 0：00、3：00、6：00、9：00、12：00、15：00：18：00、21：00采集未處理的葡萄葉片用于晝夜節(jié)律分析。將采集的材料用液氮速凍后，保存于-80℃冰箱備用。

1.2 葡萄SAP家族成員鑒定

根據(jù)SAP家族的AN1和A20保守結(jié)構(gòu)域，在NCBI數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）和葡萄全基因組數(shù)據(jù)（http://www.genoscope.cns.fr/externe/GenomeBrowser/Vitis/）中查詢和確定葡萄中的SAP家族成員，手動去除重復(fù)序列，最終獲得葡萄中的SAP家族成員。

1.3 葡萄SAP家族的生物信息學(xué)分析

在Grape Genome Browser（http://www.genoscope.cns.fr/externe/GenomeBrowser/Vitis/） 中獲得葡萄SAP家族各基因的染色體位置、CDS編碼區(qū)序列及基因組DNA序列，利用在線軟件GSDS2.0（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php）繪制基因結(jié)構(gòu)示意圖[18]，并運用Adobe Illustrator軟件進行染色體定位作圖；利用在線網(wǎng)站 EXPASY（http://web.expasy.org/protparam/）中ProtParam工具對葡萄SAP家族所編碼蛋白的氨基酸組成、疏水性、等電點等理化性質(zhì)進行分析；利用WoLF PSORT（http://www.genscript.com/wolfpsort.html）在線軟件進行亞細胞定位預(yù)測[19]；利用在線網(wǎng)站（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）分析二級結(jié)構(gòu)；基序預(yù)測利用在線軟件 MEME（http://meme-suite.org/tools/meme）進行motif系列分析；利用本地軟件DNAMAN進行蛋白多序列比對；利用 MEGA6軟件，用最大似然法（Maximum likelihood）對已鑒定的葡萄、擬南芥和水稻SAP家族蛋白進行系統(tǒng)進化樹構(gòu)建，Bootstrap值設(shè)置為1 000。

1.4 葡萄SAP家族表達分析

根據(jù)基因序列設(shè)計實時熒光定量 PCR 特異引物（表1），以葡萄Actin（XM_002265440）作為內(nèi)參基因，采用OMEGA試劑公司的植物RNA提取試劑盒提取經(jīng)過處理后的葡萄葉片RNA，利用TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒 PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈，將cDNA稀釋到相同濃度后用作實時熒光定量 PCR的模板。qRT-PCR的反應(yīng)體系為20 μL，包括1 μL cDNA模板，上、下游引物分別0.8 μL，SYBR Green熒光染料為10 μL，ddH2O 7.4 μL。反應(yīng)程序為：95℃變性 1 min，95℃變性10 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，40個循環(huán)。每個處理設(shè)置3個重復(fù)，基因相對表達量采用2-ΔΔCt法進行分析。

2 結(jié)果

2.1 葡萄SAP家族鑒定及序列分析

從葡萄基因組和NCBI數(shù)據(jù)庫中共鑒定出15個SAP家族基因，根據(jù)其保守結(jié)構(gòu)域和在染色體上的位置，依次命名為VvSAP1-VvSAP15。15個VvSAPs（圖1）分別位于第1、2、6、7、8、13、14、16和18條染色體上，其中VvSAP5、VvSAP6和VvSAP14位于第 8條染色體，第2、6、13和16條染色體分別分布在兩個VvSAP。結(jié)果（表2）顯示，葡萄SAP家族基因編碼區(qū)長度為330—882 bp，編碼109—293個氨基酸，等電點為7.99—9.68，均為堿性蛋白。氨基酸序列的平均親水系數(shù)在-0.300—-0.904，均為負值，表明這些蛋白均為親水蛋白，但親水程度不同。對VvSAP家族基因進行亞細胞定位預(yù)測，結(jié)果顯示（表3）它們都存在于細胞核中，大部分存在于葉綠體和細胞骨架中，初步推測該家族主要存在于進行光合作用的器官中，并參與了細胞壁的形成。其中，只有VvSAP14和VvSAP15不存在于葉綠體和細胞骨架，VvSAP9、VvSAP10還定位于過氧化物酶體和細胞質(zhì)中。通過二級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明（表4），VvSAP二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲和α-螺旋結(jié)構(gòu)為主，拓展鏈結(jié)構(gòu)和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)所占比例較小，其中 VvSAP9、VvSAP14和VvSAP15的無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)所占比例最大，分別為60.13%、62.12%和73.02%；VvSAP1、VvSAP3和VvSAP10的α-螺旋結(jié)構(gòu)所占比例最大，分別為為30.26%、31.4%和34.87%。

表1 VvSAP家族表達分析的實時熒光定量引物Table1 qRT-PCR primers for expression on analysis of VvSAP

圖1 葡萄SAP家族在染色體上的位置Fig.1 The chromosome location of the SAP family in Vitis vinifera

表2 VvSAP家族成員蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)Table2 Physicochemical property of VvSAP proteins

表3 葡萄SAP家族亞細胞定位預(yù)測Table3 Subcellular location prediction of SAP family in Vitis vinifera

2.2 葡萄SAP家族motif和保守結(jié)構(gòu)域分析

利用 MEME在線工具預(yù)測 VvSAPs蛋白保守基序，由圖2可知，VvSAPs中含有8個保守基序，主要的保守基序有5個：VvSAP1—VvSAP10的N端均含有保守的motif1，VvSAP1—VvSAP13的C端均含有保守的motif2、3；VvSAP14和VvSAP15包含保守基序 motif7、8。除此之外，VvSAP3、VvSAP6和VvSAP8還包含保守基序motif5和motif6。

圖2 葡萄SAP家族的序列分析Fig.2 SAP family sequence analysis in Vitis vinifera

通過對15個VvSAP蛋白序列進行多序列比對（圖3），發(fā)現(xiàn)VvSAP1—VvSAP10蛋白序列都在N端含有1個由21個氨基酸LCXNXCGFXGX2ATXNXCXKC組成的A20保守結(jié)構(gòu)域，VvSAP1—VvSAP13蛋白序列在C端均含有1個由32個氨基酸CX2CX4GX2GFX3CG 2FCX2HRX4HXCX2DX組成的 AN1保守結(jié)構(gòu)域，VvSAP14、VvSAP15蛋白序列含有 2個 AN1結(jié)構(gòu)域，不含A20保守結(jié)構(gòu)域。多序列比對結(jié)果和motif分析結(jié)果基本吻合，進一步說明該基因家族序列高度保守，所有基因都含AN1保守結(jié)構(gòu)域，大部分基因含有A20保守結(jié)構(gòu)域，在葡萄體內(nèi)可能行使相似功能。

圖3 葡萄SAP氨基酸序列一致性分析Fig.3 Identify analysis of grape SAP proteins

表4 VvSAP蛋白的二級結(jié)構(gòu)Table4 The secondary structure of VvSAP

2.3 葡萄SAP家族基因結(jié)構(gòu)和進化樹分析

通過對VvSAP家族基因進行結(jié)構(gòu)分析，如圖4所示，發(fā)現(xiàn)VvSAP1—VvSAP12均無內(nèi)含子，VvSAP13—vSAP15均含有1個內(nèi)含子，說明該基因家族相對保守。

圖4 葡萄SAP家族進化樹及基因結(jié)構(gòu)Fig.4 The phylogenetic tree and gene structure of SAP family in Vitis vinifera

為了了解葡萄SAP成員間的親緣關(guān)系和進化特性，推測其生物功能，利用MEGA6軟件構(gòu)建擬南芥、水稻和葡萄SAP家族的系統(tǒng)進化樹（圖5）。結(jié)果表明，這3個物種的SAP成員相互嵌合在一起，形成3大分支（Class Ⅰ、Class Ⅱ和Class Ⅲ），表明植物SAP在進化過程中相對保守。其中，Class Ⅲ含有成員最多，共計21個，包括7個葡萄VvSAPs，5個擬南芥AtSAPs和9個水稻OsSAPs；Class Ⅱ所含成員最為保守，都具有A20/AN1保守結(jié)構(gòu)域，共計15個，包括葡萄中 6個（VvSAP3—VvSAP8），擬南芥中 5個（AtSAP2—AtSAP6）和4個水稻OsSAPs；Class Ⅰ包括2個葡萄VvSAPs，4個擬南芥AtSAPs和5個水稻OsSAPs，其成員保守結(jié)構(gòu)域為AN1/AN1-AN1/AN1-AN1-C2H2-2H2。在這些成員中VvSAP6—VvSAP8分別與AtSAP4和AtSAP6、AtSAP5、OsSAP4的親緣關(guān)系較近，VvSAP11—VvSAP15分別與AtSAP7、AtSAP8、AtSAP10、AtSAP14、AtSAP12的親緣關(guān)系較近，推測這些SAP可能具有類似的生物功能。

圖5 葡萄（●）、擬南芥和水稻SAP家族的系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of SAP gene family in V.vinifera（●）, A.thaliana and O.

2.4 葡萄SAP表達特征分析

為了明確葡萄SAP的生物鐘節(jié)律和在逆境脅迫下的表達模式，利用qRT-PCR技術(shù)對葡萄葉片中的SAP在不同時間點和不同處理下的相對表達量進行分析。結(jié)果顯示（圖6），VvSAP1和VvSAP9在各種處理下均表達非常低或不表達，初步預(yù)測VvSAP1和VvSAP9為假基因。

VvSAP7、VvSAP14、VvSAP15在0:00時，其相對表達量最高，VvSAP5、VvSAP10和VvSAP13在18:00時表達量較高，初步推斷葡萄葉片中的SAP在北京時間0:00、18:00相對表達量最高。

VvSAP家族受 50 μmol·L-1ABA、100 μmol·L-1SA、400 mmol·L-1NaCl和4℃低溫的誘導(dǎo)，各基因在各處理下表達量具有較顯著的差異。在50 μmol·L-1ABA處理條件下，VvSAP家族均呈現(xiàn)上調(diào)表達，VvSAP3、VvSAP5、VvSAP6和VvSAP15分別在處理后12 h、8 h、8 h、24 h相對表達量達到最高值；其余SAP相對表達量均在處理 24 h時達到最高值，其中VvSAP7、VvSAP10、VvSAP11、VvSAP12、VvSAP13和VvSAP14在處理24 h時分別是0 h的17.51、37.19、36.63、21.68、58.34和266.83倍，初步推測SAP家族受50 μmol·L-1ABA強烈誘導(dǎo)，且為中后期響應(yīng)，其中VvSAP14響應(yīng)最為劇烈。相比之下，100 μmol·L-1SA處理后的SAP家族中，VvSAP11、VvSAP13、VvSAP14在處理4 h內(nèi)，相對表達量明顯上調(diào)，表明這3個基因可以迅速響應(yīng)SA信號，其他基因在處理后期相對表達量較高。

圖6 葡萄SAP家族的生物鐘節(jié)律和在不同處理下的相對表達量Fig.6 Relative expression of SAPs under circadian and different treatments

NaCl鹽脅迫和 4℃低溫脅迫結(jié)果顯示，在 NaCl脅迫下，VvSAP10在0 h相對表達量最高，雖然在2 h、12 h時候表達量略微上升，但總體呈下調(diào)趨勢；其余SAP均受鹽脅迫誘導(dǎo)，VvSAP3、VvSAP4、VvSAP5、VvSAP6、VvSAP7、VvSAP12、VvSAP15的相對表達量均在處理后期達到最高值。4℃低溫處理下，VvSAP2、VvSAP3、VvSAP4、VvSAP5、VvSAP8、VvSAP10在處理4 h時相對表達量最高，VvSAP15在處理8 h時相對表達量達到最高，為0 h的35.90倍。初步推測葡萄中SAP家族基因?qū)}脅迫的響應(yīng)多在后期，其中，VvSAP11表達量上調(diào)最明顯；對低溫脅迫的響應(yīng)多在中期，其中，VvSAP15表達量上調(diào)最明顯。上述結(jié)果表明，VvSAP家族基因參與了葡萄的非生物脅迫應(yīng)答，且只有VvSAP10在鹽脅迫下表達受到抑制，其他基因在鹽脅迫和低溫脅迫下表達均受到誘導(dǎo)。

3 討論

葡萄的生長受多種非生物脅迫的影響，分子生物學(xué)的不斷發(fā)展為提高葡萄的抗逆性提供了一條嶄新途徑。迄今，已有一些抗逆性相關(guān)基因被從葡萄中克隆分離出來，但對葡萄抗逆相關(guān)基因的功能及響應(yīng)冷脅迫的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路仍然知之甚少[20-25]。SAP是一類含A20或AN1保守結(jié)構(gòu)域的C2H2雙鋅指蛋白，可直接參與植物對逆境脅迫的響應(yīng)。A20/AN1型蛋白在動物細胞凋亡、免疫、炎癥和植物響應(yīng)脅迫中都起著重要作用[26-30]。研究表明，A20/AN1蛋白是植物響應(yīng)逆境脅迫分子機制中的上游調(diào)控因子，通過抑制或激活信號傳遞相關(guān)蛋白進而調(diào)控下游基因表達[4]。

SAP家族成員已從多個物種中被分離鑒定出來，但不同物種中SAP家族成員數(shù)量不同。本研究利用葡萄基因組數(shù)據(jù)庫，共鑒定出VvSAP15個，比擬南芥(14個)[31]、番茄（13個）[10]中的成員數(shù)量均多，但少于水稻（18個）[31]和胡楊（18個）[32]。對VvSAP家族的保守結(jié)構(gòu)域進行分析，發(fā)現(xiàn)所有VvSAP都含有AN1保守結(jié)構(gòu)域，66.67%的VvSAP中含有A20和AN1兩個保守結(jié)構(gòu)域，這和其他物種中的 SAP家族特征相符。在低等生物釀酒酵母（Saccharomyces cerevisae）和煙曲霉（Aspergillus fumigatus）中僅發(fā)現(xiàn)了AN1蛋白，在植物SAP家族中僅發(fā)現(xiàn)OsSAP18只含有A20結(jié)構(gòu)域，因此預(yù)測AN1在進化上可能比A20更為古老[31]。通過分析葡萄、擬南芥和水稻的進化樹，發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)相似的SAP往往親緣關(guān)系較近，此規(guī)律在ClassⅡ類SAP中最為明顯，所有此類SAP均含A20/AN1結(jié)構(gòu)域。大片段重復(fù)和串聯(lián)重復(fù)是植物基因家族擴展的兩個主要原因[33]，為了更深入地了解葡萄SAP家族的擴張模式，本研究在植物基因組復(fù)制數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)SAP2和SAP10，SAP6和SAP8，SAP6和SAP12，SAP8和SAP12為片段復(fù)制基因，未發(fā)現(xiàn)串聯(lián)重復(fù)，因此初步推測大片段復(fù)制可能是葡萄SAP家族進化的主要動力。

外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)多樣性在基因家族進化中發(fā)揮著重要作用，可為系統(tǒng)發(fā)育分析提供依據(jù)[34-35]。SAP家族的一個重要特征是普遍缺乏內(nèi)含子，在水稻中，11個OsSAPs沒有內(nèi)含子，6個只有1個內(nèi)含子，只有一個成員（OsSAP8）有2個內(nèi)含子[31]。在擬南芥中，3個AtSAPs沒有內(nèi)含子，9個有 1個內(nèi)含子，只有AtSAP2和AtSAP14分別有2和3個內(nèi)含子。這些無內(nèi)含子的SAP可以減少轉(zhuǎn)錄后的加工，在非生物脅迫下可以被快速轉(zhuǎn)錄和翻譯[36-37]。然而，VvSAPs并不完全符合這一假設(shè)，VvSAP13—VvSAP15都包含1個內(nèi)含子，但它們在低溫、NaCl、SA和ABA處理下的響應(yīng)速度和表達變化與其他家族成員沒有明顯差別。

通過對VvSAPs表達模式進行分析，發(fā)現(xiàn)多數(shù)VvSAP都具有生物節(jié)律，且在0：00和18：00表達量較高，初步推測原因可能因為夜間的生長環(huán)境相比于白天較惡劣。所有VvSAPs均受ABA誘導(dǎo)，部分家族成員受 NaCl、SA和低溫誘導(dǎo)。其中，具有 A20和AN1兩個結(jié)構(gòu)域的Class Ⅱ亞族中的VvSAPs在ABA處理下表達量持續(xù)上升。VvSAP6、VvSAP8和OsSAP8[15]同源性較高，且均響應(yīng)鹽脅迫和低溫脅迫；VvSAP3、VvSAP5、VvSAP7和 OsSAP1[38]親緣關(guān)系較近，在 NaCl脅迫下的表達模式相似，相對表達量均為上升-下降-上升趨勢；VvSAP15和 AtSAP12在進化樹上屬于同一分枝，且都具有2個AN1保守結(jié)構(gòu)域，其相對表達量在低溫和鹽脅迫下均上調(diào)，根據(jù)現(xiàn)有研究，推測VvSAP15為一個氧化還原劑感應(yīng)器，在氧化還原劑的處理下，其構(gòu)象改變，與蛋白結(jié)合，激活或抑制調(diào)控信號傳遞[39]。根據(jù)SAP家族的進化樹分析和表達模式分析，推測SAP家族高度保守的結(jié)構(gòu)域使不同物種間親緣關(guān)系較近的SAP表達模式相似，但與所含A20和AN1蛋白的數(shù)量無明顯關(guān)聯(lián)。

4 結(jié)論

從葡萄基因組中鑒定出15個SAP，均含有SAP蛋白特有的A20或AN1保守結(jié)構(gòu)域，可分為3大類。除VvSAP13—VvSAP15含有1個內(nèi)含子外，其余成員均無內(nèi)含子。亞細胞定位預(yù)測顯示，葡萄SAP家族成員在細胞核中均存在。通過實時熒光定量PCR技術(shù)對葡萄SAP家族進行表達分析，結(jié)果表明VvSAP1和VvSAP9為假基因，其余VvSAP均具有生物節(jié)律，且在0：00和18：00相對表達量較高。在響應(yīng)不同時間、不同逆境脅迫時，不同的基因具有不同的表達模式。