長江中下游稻區(qū)不同水旱輪作模式和氮肥水平對稻田CH4排放的影響

劉少文，殷敏，褚光，徐春梅，王丹英，章秀福，陳松

（中國水稻研究所/水稻生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 311400）

0 引言

【研究意義】全球氣候變暖正日益影響著人類的生存環(huán)境和質(zhì)量[1]，而其發(fā)生與溫室氣體濃度的增加有關(guān)[2]。CH4作為主要的溫室氣體之一，其增溫效應(yīng)約占全部溫室氣體總效應(yīng)的 15%—20%，且每年以1.1%的速度增長[3]。研究發(fā)現(xiàn)農(nóng)田是大氣CH4的重要排放源，約17.9%的CH4排放來源于稻田[4]。水稻是中國重要的糧食作物，其種植面積約占世界水稻種植總面積的 23%[5]。深入研究稻田 CH4排放特點(diǎn)及其影響因素，并在此基礎(chǔ)上制定相應(yīng)的減排措施，對緩解全球增溫效應(yīng)意義重大?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】稻田CH4的產(chǎn)生是由產(chǎn)甲烷菌將土壤中有機(jī)物質(zhì)通過厭氧發(fā)酵轉(zhuǎn)化而成[6]，CH4從厭氧沉積層或淹水土壤向大氣傳輸主要經(jīng)由分子擴(kuò)散、氣泡迸發(fā)和通過植株排放[7]，其中超過90%的稻田CH4通過水稻植株排放到大氣[8]。對稻田CH4排放及相應(yīng)的減排措施已有大量研究。氣候條件、土壤特性、耕作方式以及田間管理是影響稻田CH4排放的重要因素[9-11]。一般認(rèn)為水旱輪作能夠改善土壤的理化性質(zhì)，降低土壤還原物質(zhì)含量，減少 CH4的產(chǎn)生[12]；而稻田持續(xù)淹水，會阻礙氧氣的擴(kuò)散，降低土壤氧化還原電位，易于產(chǎn)甲烷菌的快速繁殖，導(dǎo)致 CH4排放的增加[13]；中期烤田則能減少36%—65%以上的CH4排放[14-15]。此外，研究表明，秸稈添加能顯著增加稻田 CH4排放量，且排放總量和秸稈還田量呈正相關(guān)[16]。在生產(chǎn)上，水旱輪作過程中往往伴隨著冬季作物秸稈全量還田，長江中下游地區(qū)主要的水旱輪作包括稻麥、稻油、稻綠、稻閑等模式[17-18]，而近年來，秸稈覆蓋種植馬鈴薯也被廣泛推廣[19]。合理的秸稈還田能增加土壤有機(jī)質(zhì)含量，培肥地力、改善土壤結(jié)構(gòu)[20]，但不同屬性的秸稈還田對溫室氣體排放的影響，目前尚未見系統(tǒng)報(bào)道。相關(guān)研究表明，田間氮肥施用對稻田 CH4排放亦有顯著影響，但目前尚未有一致的結(jié)論，有研究認(rèn)為氮肥會增加稻田 CH4排放[21-22]，也有研究發(fā)現(xiàn)隨著施氮量的增加，稻田 CH4排放減少[23]。由于氮肥會影響還田秸稈的分解及其 CH4轉(zhuǎn)化過程[24]，因此氮肥對 CH4排放的影響可能還與稻田的秸稈類型有關(guān)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前關(guān)于水旱輪作模式（不同屬性秸稈還田處理）與氮肥水平對稻田 CH4的排放特性的互作效應(yīng)研究報(bào)道較少，而對其相關(guān)排放機(jī)理的研究則尚未見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】鑒此，本研究以多年長期定位試驗(yàn)（2003至今）為基礎(chǔ)，選擇 4種不同水旱輪作模式（不同屬性秸稈還田處理），結(jié)合3種不同氮肥水平，通過田間氣體采集與土壤樣品分析，主要目的在于：（1）評估還田秸稈屬性與氮肥水平互作對稻季 CH4的排放規(guī)律及累積排放量的影響；（2）結(jié)合土壤甲烷代謝微生物、土壤理化性質(zhì)與秸稈屬性綜合分析，明確不同秸稈還田與氮肥處理下稻季CH4排放差異機(jī)理。以期為我國稻田溫室氣體排放以及合理減排措施的制定提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況

試驗(yàn)于2016—2017年，在浙江省富陽市中國水稻研究所農(nóng)場進(jìn)行（120.2°E，30.3°N，海拔11 m）。該農(nóng)場位于長江中下游平原，屬亞熱帶季風(fēng)氣候，年平均氣溫為13—20℃，其中7月份為35℃；年平均降水量為1200—1600 mm，其中4月份和9月份降雨量約占80%。本研究所需的稻田種植模式定位試驗(yàn)于2003年開始實(shí)施，于 2016—2017年測定稻田CH4排放，兩年土壤基本性質(zhì)年度間差異不顯著，具體指標(biāo)見表1。

表1 不同輪作及氮肥水平下土壤基本性質(zhì)（兩年平均）Table1 Basic properties of soil under different rotation systems and different N rates（the two years’ average）

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究以不同水旱輪作模式長期定位試驗(yàn)為基礎(chǔ)（2003至今）。于2016—2017年測定稻田CH4排放。定位試驗(yàn)采用裂區(qū)隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，4種不同輪作模式為主區(qū)，分別為水稻-休閑（RF），水稻-紫云英（RC-G），水稻-小麥（RW）和水稻-稻草覆蓋種植馬鈴薯（RP）；水稻季氮肥水平為副區(qū)，分別為N0（0）、N1（142.5 kg N·hm-2）和 N2（202.5 kg N·hm-2），小區(qū)位置和面積長期固定，每個小區(qū)長8 m、寬8 m，3次田間區(qū)組重復(fù)。

冬季作物栽培：RF，田間不作任何處理，空閑放置，次年水稻移栽前，翻耕耘田；RC-G，紫云英于10月中下旬播種，出苗后施入尿素15 kg·hm-2作為基肥，次年盛花期（3月底4月初）將其割翻，翻耕還田；RW，小麥于10月下旬11月初撒直播，苗期和抽穗期分別施入復(fù)合肥75 kg·hm-2（基肥）和尿素15 kg·hm-2（追肥），次年5月中旬收獲，除籽粒外，其余秸稈翻耕還田；RP，稻草全程覆蓋種植馬鈴薯，于1月下旬在田面上直接擺放種薯，并覆蓋8—10 cm厚稻草，施入復(fù)合肥75 kg·hm-2作為基肥，5月中旬收馬鈴薯塊莖，其余部分翻耕還田，還田的有機(jī)物為腐爛的稻草和馬鈴薯莖葉等。

圖1 不同輪作模式下秸稈還田量（A）和還田秸稈C/N比（B）Fig.1 Amount (A) and C/N ratio (B) of straw incorporated under different rotations

單季稻種植：供試品種為嘉58（常規(guī)粳稻）。水稻田于6月上旬翻耕。水稻浸種催芽后，5月中上旬播于秧田，至3葉1心左右移栽，行株距26.7 cm×13.3 cm。水稻季施氮肥，氮肥總量根據(jù)氮肥處理設(shè)置，其中基肥∶分蘗肥∶穗肥按照 40%∶30%∶30%施入；磷肥（過磷酸鈣，60 kg·hm-2）作為底肥一次性施入；鉀肥（氯化鉀，135 kg hm-2）按基、蘗肥各50%分次施入。

秸稈還田處理：水稻人工收獲，其秸稈全部移除用于冬季馬鈴薯覆蓋栽培。冬季作物秸稈全量還田，不同輪作模式下秸稈還田量及還田秸稈C/N比如圖1所示。不同輪作模式下秸稈還田量差異顯著（圖1-A，除2017年RW和RC-G差異不顯著），與RP相比，RW和RC-G的秸稈還田量分別減少45.7%和78.3%（2016），51.6%和62.5%（2017）。長期還田秸稈的C/N比（圖1-B）表現(xiàn)為RW顯著大于RP和RC-G（RP和RC-G差異不顯著）；相較于RW，RP和RC-G輪作下C/N分別降低58.0%和71.3%（2016），58.9%和74.1%（2017）。因此，根據(jù)秸稈屬性，可以將 4種輪作模式劃分為RP（高秸稈量、低C/N比）、RW（高秸稈量、高C/N比）、RC-G（低秸稈量、低C/N比）和RF（對照-無秸稈）。

1.3 樣品采集與分析

CH4氣體采集于2016和2017年6—10月間開展，采用密閉式靜態(tài)（透明）箱-氣相色譜法測定田間CH4排放通量。氣體采樣箱由底座和采樣箱組成，靜態(tài)箱底橫截面積為0.5 m×0.6 m，采樣箱由PVC材質(zhì)制成，箱體高度隨水稻高度而增加（拔節(jié)前 0.5 m、拔節(jié)后1.2 m），中部固定風(fēng)扇，箱內(nèi)嵌有溫度計(jì)，方便記錄溫度變化，底座為正方形U槽，嵌入地表，放置箱體后加水使之密封。

采集頻率：水稻自移栽后第3天起，根據(jù)實(shí)際情況每5—10天采氣1次。采樣時間為8：00—11：00。氣體采集前打開箱內(nèi)頂部 12 V小風(fēng)扇以充分混勻箱內(nèi)氣體，采樣時，將采樣箱垂直安放在底座5 cm深的凹槽內(nèi)并加水密封，樣品采集分別在關(guān)箱后的0、6、12、24 min進(jìn)行。氣體樣中 CH4濃度由氣象色譜（Agilent 7890A，美國安捷倫科技有限公司）分析測定。CH4檢測器是 FID（氫火焰離子化檢測器），檢測溫度300℃，柱溫 60℃，載氣為 99.999%高純 N2，流速 30 mL·min-1。

土壤及秸稈屬性測定：有機(jī)質(zhì)含量采用水合熱重鉻酸鉀氧化-比色法測定[67]；全氮用全自動凱氏定氮儀（海能 K9840，濟(jì)南海能儀器股份有限公司）測定；堿解氮采用堿解擴(kuò)散法進(jìn)行測定[67]；土壤pH用pH計(jì)（F2，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）進(jìn)行測定。

鑒于田間試驗(yàn)處理，年度間基本一致，且經(jīng)過多年定位試驗(yàn)，土壤性質(zhì)基本穩(wěn)定，因此于2018年分蘗期測定土壤氧化還原電位與土壤m(xù)crA和pmoA基因豐度以探索CH4排放機(jī)理差異。

土壤氧化還原電位（Eh）測定（2018年）：于水稻移栽后每5—7天測定一次。利用土壤氧化還原電位儀（FJA-6型，南京傳滴儀器設(shè)備有限公司）測定根際土壤中的Eh值。

唐玉煙不好意思地笑了笑，道：“實(shí)在抱歉，那天，我蒙蒙眬眬地感覺四周不停地顛簸搖晃，就像地震了一般，后來又感覺一陣窒息，我在窒息中醒來，一睜眼，就發(fā)現(xiàn)自己正被一只怪物攜著向前跑，我很害怕，于是拔出刀，割斷了它的脖子?！?/p>

土壤m(xù)crA和pmoA基因豐度測定：分別于水稻移栽后 3 d（2018/6/28）、14 d（2018/7/9）、28 d（2018/7/23）利用取土器采集每個小區(qū)距稻樁20 cm，耕層（0—20 cm）土壤樣品（5點(diǎn)取樣法取樣），去雜質(zhì)后混合待用。土壤m(xù)crA和pmoA基因豐度采用實(shí)時熒光定量PCR分析。即用土壤DNA快速提取試劑盒提取土壤 DNA，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測所提 DNA片段大小，并用超微量紫外分光光度計(jì)測定DNA濃度及質(zhì)量。設(shè)計(jì)產(chǎn)甲烷菌的mcrA基因、甲烷氧化菌的pmoA基因引物，進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR分析，反應(yīng)體系為20 μL[25]。各基因定量PCR分析所用的引物和反應(yīng)條件見表2，其中采集信號溫度為72℃。

表2 光實(shí)時定量PCR擴(kuò)增引物及反應(yīng)條件Table2 Aplification primer and reaction condition of quantitative PCR

1.4 數(shù)據(jù)處理

溫室氣體排放通量由該氣體在箱中濃度隨時間的變化率計(jì)算得出，計(jì)算方程為氣體排放通量計(jì)算公式如下：

式中，F(xiàn)為排放通量（mg·m-2·h-1）；dc/dt為采樣過程中箱內(nèi)氣體濃度隨時間的變化率（mL·m-3·h-1)）；h為采樣箱體高度（m）；ρ為標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下氣體的密度（0.714 kg·m-3）；T為采樣時箱內(nèi)溫度（℃），273為氣態(tài)方程常數(shù)。每次觀測時各處理氣體排放通量用3次重復(fù)的平均值表示；作物生長季節(jié)氣體平均排放通量的計(jì)算則以相鄰兩次采樣時間間隔為權(quán)重，將各次排放通量進(jìn)行加權(quán)平均；氣體累積排放量用平均排放通量和全生長季時間的乘積表示。

本文采用Excel 2010和SAS 9.2軟件對數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行計(jì)算和分析，采用 Duncan法分析數(shù)據(jù)間的差異顯著性（P=0.05）。

2 結(jié)果

2.1 稻季CH4排放通量

水稻生長期稻田CH4排放通量的變化受水分管理影響顯著，呈現(xiàn)明顯的階段性變化（圖2），可觀測到兩個排放高峰期—分蘗期和孕穗期CH4排放階段。其中分蘗期CH4排放階段（約移栽后7—30 d）持續(xù)時間占全生育期的19.0%—19.7%。分蘗中后期（移栽后 37 d左右），稻田逐漸進(jìn)入擱田期，各處理 CH4排放通量都表現(xiàn)不同程度下降。擱田復(fù)水后，CH4排放小幅上升，進(jìn)入孕穗期 CH4排放階段（約移栽后50—70 d），該階段持續(xù)時間約占生育期的 16.7%—17.2%。之后進(jìn)入低排放通量周期。

輪作模式對稻田CH4排放的影響因氮肥水平差異而有所不同。N0水平下，分蘗階段CH4平均排放通量，RP、RW和RC-G無顯著差異，但均顯著高于RF，分別提高 72.1%—168.7%、70.8%—145.2%和 56.5%—145.2%（圖2- A 和2-B）。孕穗階段CH4排放通量，各模式間無顯著差異，但2016年RP顯著高于其他。此外，N0水平下分蘗期CH4排放表現(xiàn)為雙峰特點(diǎn)（約為移栽后第12—15 d和25—30 d）。各輪作在移栽后25—30 d出現(xiàn)最大排放峰，RP、RW、RC-G的最高排放通量（兩年平均）分別為55.0、42.9和38.6 mg·m-2·h-1。相比RF，RP、RW、RC-G的最高排放通量分別提高182.1%、120.0%和97.9%。

隨著施氮量的增加，CH4排放通量對輪作的響應(yīng)出現(xiàn)分化。RF、RP和RW的分蘗期和孕穗期CH4平均排放通量隨著施氮量的增加而顯著提高。N2水平下，RP 分蘗期 CH4平均排放通量為 36.2 mg·m-2·h-1，要比N1和N0分別高14.8%和40.4%；與RP相似，RW則要高13.9%和43.9%。RF則表現(xiàn)為分蘗期CH4排放通量，N1和N2顯著高于N0，尤其在移栽后25—30 d，其平均排放通量達(dá)到23.8和27.5 mg·m-2·h-1（兩年平均），相比N0，分別提高29.9%和50.3%。而RC-G分蘗期CH4排放通量保持相對穩(wěn)定（2017）或略有下降（2016）。與 N0相比，增施氮肥下 RC-G分蘗期CH4平均排放通量降低20.0%—29.8%（N1）和11.9%—20.1%（N2）。

圖2 2016（A、C和E）和2017（B、D和F）年度不同輪作模式及氮肥梯度下稻田CH4排放通量的季節(jié)變化Fig.2 Seasonal variations of CH4 fluxes in rice season under different rotation systems and N fertilizer rates in 2016 (A, C, E), 2017 (B, D, F)

2.2 稻季CH4累積排放量

由圖3中可以看出，不同輪作模式及氮肥水平對稻季CH4排放量的影響存在顯著互作。N0條件下，休閑（RF）模式的稻季CH4累積排放量要顯著低于冬季作物種植（RP、RW 和 RC-G）。RF稻季年均 CH4累積排放僅 18.4—21.2 g·m-2，分別比 RP、RW 和 RC-G降低42.6%—59.4%、40.7%—52.1%和36.0%— 52.1%。

隨著氮肥的增加，RP、RW和RF處理下稻季CH4累積排放量均有不同程度的增加。N2水平下，RP、RW 和 RF的 CH4累積排放量分別為 51.2—55.8、45.3—51.5 和 25.0—30.5 g·m-2，比 N0水平提高23.0%—38.4%、26.7%—33.7%和 35.3%—43.5%；而與 N1相比，則提高 9.9%—19.7%、20.8%—23.1%和17.4%—18.8%（2016，RF模式下，N1和N2無顯著差異）。而RC-G稻季CH4累積排放量則隨著施氮量的增加而顯著降低。與N0相比，N1和N2下稻季CH4累積排放量分別降低20.7%—42.4%和10.6%—16.6%。不同輪作間比較，N1和N2水平下，RF和RC-G的稻季CH4累積排放量無顯著差異，但顯著低于RW和RP。

圖3 2016（A）和2017年（B）不同輪作模式及肥料梯度下稻季CH4累積排放量Fig.3 CH4 accumulation emissions in rice season under different rotations and N fertilizer rates in 2016 (A) and 2017 (B)

稻季CH4排放通量還與水稻生育階段相關(guān)。為了進(jìn)一步明確不同輪作模式與氮肥水平下稻季CH4的排放規(guī)律，將水稻全生育期分為分蘗期、孕穗期和灌漿期3個主要生育階段?？傮w而言，稻季CH4的累積排放量分蘗期＞孕穗期＞灌漿期，其中分蘗期、孕穗期和灌漿期占比分別為51.85%—72.31%、22.9%—31.3%和6.0%—20.7%，這表明CH4排放主要集中在生育前中期，而后期占比較小（圖4）。輪作模式和氮肥水平對水稻不同生育階段CH4累積排放量影響顯著，差異主要集中體現(xiàn)在分蘗期和孕穗期，而灌漿期則無顯著差異。N0水平下，與RP、RW和RC-G相比，RF的分蘗期 CH4累積排放量降低 95.9%—171.1%、70.7%—144.1%和74.2%—165.8%；隨著氮肥的施用，各輪作分蘗期CH4累積排放量占比均顯著提高（2016年RC-G除外），增幅為7.0%—48.3%。孕穗期CH4累積排放量，RP和RW模式顯著高于RC-G和RF，而RC-G和RF無顯著差異。灌漿期，CH4排放量較小，各處理之間無顯著差異。

2.3 產(chǎn)甲烷菌（mcrA）和甲烷氧化菌（pmoA）基因豐度

土壤中產(chǎn)甲烷菌（mcrA）和甲烷氧化菌（pmoA）是影響稻季CH4排放的重要微生物。為進(jìn)一步明確不同輪作模式下稻季CH4排放微生物差異，于2018年水稻移栽后3、14和28 d采集并測定土壤中mcrA和pmoA基因豐度（圖5）。不同輪作模式與氮肥水平下，mcrA和pmoA基因豐度差異顯著。N0水平下，移栽后3 d，mcrA基因豐度量較少，而移栽14 d和28 d后豐度顯著增加。移栽后28 d mcrA基因豐度大小順序?yàn)?RP＞RW＞RC-G＞RF，相較于RF，RP、RW 和 RC-G模式下mcrA基因豐度增加195.7%、121.3%和45.7%，這說明秸稈還田有利于提高土壤中產(chǎn)甲烷菌豐度。施氮后，各輪作模式mcrA基因豐度均顯著增加，相較于N0，N1水平下RP、RW、RC-G和RF的mcrA基因豐度分別增加191.4%、135.6%、43.1%和105.7%（移栽后28 d），其中以RC-G增加最少。

圖4 2016（A、C和E）和2017（B、D和F）年度不同輪作模式及氮肥梯度下水稻不同生育階段CH4累積排放量Fig.4 CH4 accumulation emissions at different rice growth periods under different rotation systems and N fertilizer rates in 2016(A, C and E) and 2017 (B, D and F)

與mcrA不同，N0水平下，移栽后14和28 d，RP和RW的pmoA基因豐度顯著高于RF和RC-G。增氮后，RF、RW和RP的pmoA基因豐度顯著減少降幅分別為42.7%、14.1%和13.3%（移栽后28 d），說明氮肥一定程度上抑制了甲烷氧化菌的活性，而RC-G則剛好相反，增施氮肥后pmoA基因豐度增加72.8%（移栽后28 d）。

以上結(jié)果表明，隨著氮肥的增施，RP、RW和RF的產(chǎn)甲烷菌顯著提高，但RC-G增加較少；而甲烷氧化菌的豐度變化則與CH4排放剛好相反，表現(xiàn)為RP、RW和RF pmoA基因豐度減少，而RC-G增加。進(jìn)一步分析mcrA/pmoA比值(圖6-E和6-F)，發(fā)現(xiàn)N0水平下，不同輪作模式下 mcrA/pmoA比值大小順序?yàn)镽P＞RW、RC-G＞RF（移栽后14 d和28 d），其變化規(guī)律與稻季不同輪作方式下CH4排放變化基本一致。增施氮肥后RF、RP和RW mcrA/pmoA基因豐度比值顯著提高，其增加比例分別為 71.4%—141.1%、197.1%—258.2%和84.6%—165.5%；而RC-G則下降26.8%—42.3%。這與田間CH4的排放規(guī)律相似。

圖5 2018年不同輪作模式及氮肥梯度下產(chǎn)甲烷菌基因（mcrA；A和B）和甲烷氧化菌基因（pmoA；C和D）拷貝數(shù)和mcrA/pmoA比值（E和F）Fig.5 Abundance of methanogenic gene mcrA (A and B) and methanotrophic gene pmoA (C and D) and mcrA/pmoA ratio (E and F) under different rotation systems and N rates in 2018

2.4 氧化還原電位差異性

不同輪作模式下氧化還原電位（Eh）變化規(guī)律在不同氮肥處理下基本一致（圖6），擱田前（稻田一直處于淹水狀態(tài)），各輪作模式 Eh持續(xù)下降，在移栽后18—25 d降到最低，然后開始回升，移栽30—35 d以后Eh＞0，并呈波浪式變化。N0水平下，水稻移栽前期（3—7 d），此時各輪作模式 Eh大小順序?yàn)镽P＞RW＞RC-G＞RF（輪作間 Eh差異不顯著），可能是由于秸稈的添加與機(jī)械翻耕增加了土壤的通氣性。移栽后22 d，RP、RW和RC-G模式之間無顯著差異，但均顯著低于 RF模式，降幅為 118.4%、102.6%和80.5%，說明隨著淹水時間的延長，秸稈的降解消耗了土壤中的O2，加速了土壤中氧化還原電位的降低。增施氮肥后，Eh變化幅度因輪作模式而有所差異（移栽后22 d），N2水平下，RP、RW、RC-G和RF的Eh分別為-198.9、-188.5、-156.3和-80.3 mV（RP、RW 和 RC-G模式之間無顯著差異，但均顯著低于RF模式），與N0相比，分別降低33.1%、34.5%、29.7%和24.2%。而與N1相比，則降低7.2%、20.2%、38.4%和 15.9%。無機(jī)氮肥的投入，一定程度上促進(jìn)秸稈的腐解速率，并進(jìn)一步加速土壤中氧化還原電位的降低。

3 討論

3.1 輪作模式對稻田CH4排放的影響

圖6 不同輪作模式及氮肥梯度下稻季土壤氧化還原電位變化規(guī)律Fig.6 Variations of soil redox potential in rice season under different rotation systems and N fertilizer rates

輪作處理與氮肥水平并未改變稻季CH4總的排放規(guī)律。受田間水分管理和生長發(fā)育影響，稻季CH4排放主要集中在水稻分蘗期，其它時期（如拔節(jié)抽穗期、灌漿結(jié)實(shí)期）相對較少[28-29]。在水稻生長季，CH4排放表現(xiàn)為分蘗期前期升高，中后期特別是擱田開始后降低，擱田結(jié)束稻田復(fù)水后略有升高，并保持低排放量直至水稻收獲，呈現(xiàn)波浪式變化[5]。

本研究發(fā)現(xiàn)輪作模式與氮肥水平對稻季CH4不同階段排放通量及其累積排放量均有顯著影響，其影響主要集中在分蘗期，這與張?jiān)婪糩30]和黃太慶[31]等的部分研究結(jié)論一致。另外，張嘯林等[32]研究認(rèn)為添加秸稈和綠肥作物均增加稻季CH4排放，而添加高生物量秸稈比添加低生物量綠肥作物有更多的CH4排放。這與本研究施氮（N1和 N2）處理下不同輪作模式 CH4排放規(guī)律基本一致；但在N0下，RP、RW和RC-G無顯著差異。其變化規(guī)律還與產(chǎn)甲烷菌基因豐度密切聯(lián)系，即添加秸稈生物量與CH4排放之間的關(guān)系受氮肥施用調(diào)控，并受到產(chǎn)甲烷菌活性的制約。微生物增殖與激活需要底物和能量，而土壤有效碳量是影響土壤微生物活性的限制因子[33]。稻田CH4排放主要受限于產(chǎn)甲烷菌和甲烷氧化菌的豐度及其活性。產(chǎn)甲烷菌是稻田土壤中甲烷產(chǎn)生的主要生物源[34]。而甲烷氧化菌，是以甲烷作為唯一碳源和能源進(jìn)行同化和異化代謝的微生物[35]。李大明等[36]研究指出產(chǎn)甲烷菌豐度與稻田CH4排放量呈正相關(guān)，這與本研究結(jié)果一致。秸稈還田與氮肥處理影響了有機(jī)碳的轉(zhuǎn)化和產(chǎn)甲烷菌與甲烷氧化菌可利用的有機(jī)碳及能量，進(jìn)而影響到CH4排放[37]。在種植系統(tǒng)中，秸稈全量還田能夠顯著增加產(chǎn)甲烷菌豐度，進(jìn)而導(dǎo)致稻田CH4排放量提高[38]。本研究發(fā)現(xiàn)N0下，產(chǎn)甲烷菌豐度變化規(guī)律與秸稈還田量有關(guān)，這與BAO[38]和ARIF[39]等關(guān)于大量秸稈碳的投入增加稻田產(chǎn)甲烷菌數(shù)量的結(jié)果一致。另一方面，稻田CH4排放量也因秸稈還田的有機(jī)物料種類而異。前人研究認(rèn)為添加的有機(jī)物料C/N越高，能源物質(zhì)越豐富，土壤有關(guān)微生物活性就越高，在環(huán)境適宜的條件下，CH4排放就越多[40]。本研究中RW、RP和RC-G還田秸稈的C/N比分別為70.39、29.25和19.26（圖1 B），其中RP處理C/N較低，但其CH4排放通量顯著高于RC-G，這與其秸稈還田量顯著高于RC-G相符（圖1-A）。顯然，以還田秸稈 C/N比作為判斷還田秸稈對 CH4排放的影響亦不全面。筆者認(rèn)為與C/N相比，還田秸稈中有機(jī)碳含量可能與 CH4排放關(guān)系更加密切，但其效應(yīng)受氮肥施用的影響。此外，長期定位輪作后，RP土壤中較高的有機(jī)質(zhì)含量可能也是導(dǎo)致 RP輪作模式 CH4排放量最大的重要因素（表1）。

3.2 輪作模式和氮肥水平對稻田CH4排放的互作效應(yīng)

氮肥能夠影響稻田CH4排放，其效應(yīng)受種類、施用量、施用方式和施用時間等影響[23]。長期還田秸稈的C/N比能干擾增施氮肥帶來的CH4排放效應(yīng)。在本研究的RP、RW和RF輪作模式中，我們發(fā)現(xiàn)，增施氮肥能夠顯著增加稻田CH4排放（圖3），與前人研究印證[41]。但RC-G的表現(xiàn)則剛好相反。這與ZHU[42]和胡安永等[5]關(guān)于紫云英-水稻輪作模式不同施氮量下CH4排放研究結(jié)論一致。氮肥與有機(jī)物料的互作效應(yīng)對稻季CH4排放的影響主要與有機(jī)物料分解及其后續(xù)有機(jī)物種類有關(guān)[43]。一般而言，具有較高C/N比的有機(jī)底物，其分解速率隨著氮輸入量的增加而增加[44]。另外秸稈的分解速率還與相關(guān)微生物豐度密切相關(guān)，后者則受到土壤中有效氮含量的制約[45]，研究發(fā)現(xiàn)，在氮受限的環(huán)境中，增加氮的輸入提高土壤中氮的有效性，這相應(yīng)提高了土壤中產(chǎn)甲烷菌所需有機(jī)底物的有效性，促進(jìn)了產(chǎn)甲烷微生物活性，增加CH4產(chǎn)生[46]。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)微生物對氮肥的響應(yīng)機(jī)制因輪作模式而有所差異，增施氮肥促進(jìn)產(chǎn)甲烷菌的增殖，卻抑制了甲烷氧化菌的增殖（圖5-A，5-B），但其變化幅度因輪作處理而有所不同。這與許欣等[25]關(guān)于土壤中可利用氮含量（銨態(tài)氮與硝態(tài)氮）與mcrA基因豐度正相關(guān)而與 pmoA基因豐度呈顯著負(fù)相關(guān)的結(jié)論一致。筆者認(rèn)為CH4排放對氮肥的響應(yīng)，原因可能是：（1）產(chǎn)甲烷菌主要以NH4+-N為氮源，外源無機(jī)氮的輸入提高了產(chǎn)甲烷菌繁殖所需底物的有效性[46]，會加快產(chǎn)甲烷菌的生理活動[47]，從而促進(jìn)其群體的快速增長[48]；（2）甲烷單氧酶（MMO）是甲烷氧化菌的關(guān)鍵功能酶，可以在氧氣的作用下催化甲烷等低碳烷烴或烯烴羥基化或環(huán)氧化[49]，NH4+是MMO的競爭性抑制劑，通過與MMO的競爭，減少了甲烷氧化，促進(jìn)了甲烷排放[50]；（3）氮素增加還會引起植物根系分泌量增加，進(jìn)而為產(chǎn)甲烷菌帶來更多生活底物[51]；（4）由于產(chǎn)甲烷菌代謝過程嚴(yán)格厭氧，只能生活在氧化還原電位很低的環(huán)境中[52]。增加無機(jī)氮的投入，能夠加速有機(jī)物料的腐解速率，腐解的同時消耗了水中的O2，降低了土壤中的氧化還原電位（圖6-B和6-C），進(jìn)一步增加了產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量，進(jìn)而促進(jìn)CH4的排放。另外，WATANABE等[53]研究發(fā)現(xiàn)，稻田CH4排放與秸稈還田量顯著正相關(guān)，當(dāng)秸稈還田量為 2、4和 6 t·hm-2時，CH4排放量分別增加 19%、97%和 228%，其中秸稈中的碳對CH4排放的貢獻(xiàn)分別為19%、51%和60%。本研究中，RW和RP中秸稈還田量達(dá)到15.15和 7.85 t·hm-2，屬于高還田量栽培。微生物利用碳源進(jìn)行繁殖增長的同時，需要外界提供較高的氮源[46]。而RC-G處理本身帶入秸稈量較少（4.30 t·hm-2），含氮量較高。鑒此，筆者認(rèn)為稻田系統(tǒng)中秸稈還田C/N的相對含量可能是干擾氮肥水平對稻田CH4排放作用的關(guān)鍵。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，稻田土壤CH4排放量并不是取決于產(chǎn)甲烷菌或甲烷氧化菌中的某一個，而產(chǎn)甲烷菌與甲烷氧化菌基因豐度比值（mcrA/pmoA）能更客觀的反映CH4產(chǎn)生、氧化及排放之間的數(shù)量關(guān)系，這與LIU[52]等研究結(jié)果一致。當(dāng)土壤中生成的CH4通過擴(kuò)散進(jìn)入氧化區(qū)域時，大量CH4被甲烷氧化菌氧化。因此稻田土壤的CH4排放量不僅取決于CH4的生成能力，還決定于土壤對內(nèi)源CH4的氧化能力[54]。本研究表明，相較N0水平下，增施氮肥（N1）顯著增加RF、RW和RP輪作模式mcrA/pmoA比值；而RC-G輪作模式卻正好相反。其變化規(guī)律與CH4排放量基本一致。表明紫云英綠肥還田配施氮肥（N1），對土壤中甲烷氧化菌的促進(jìn)作用強(qiáng)于產(chǎn)甲烷菌，有助于減少稻田CH4排放。

3.3 水稻植株及冬季作物種植對稻季CH4排放的影響

稻田甲烷排放是稻田甲烷產(chǎn)生、氧化和傳輸綜合作用的結(jié)果，而水稻的生長強(qiáng)烈影響這3個過程[55]。水稻根系作為重要的中間載體，其根系形態(tài)和生理特征嚴(yán)重影響CH4排放[56]，而投入的有機(jī)物料及其分解后有機(jī)物種類對根系的影響程度不同，最終會導(dǎo)致甲烷排放的差異。王紅妮等[57]發(fā)現(xiàn)水稻根系為了維持正常的呼吸作用，大量消耗根系附近的氧氣，降低了根系土壤的氧化還原電位，促進(jìn)了稻田土壤厭氧環(huán)境的形成，這也可能是導(dǎo)致不同輪作模式下稻田 Eh差異性的原因之一（圖6）；同時，水稻根系通過分泌物和凋落物的形式為產(chǎn)甲烷菌提供底物，促進(jìn)產(chǎn)甲烷的增殖[58]。另外，水稻植株也會影響稻田CH4氧化作用，AULAKH等[59]研究指出大氣中的氧氣可以通過水稻植株的通氣組織進(jìn)入根系，形成一個好氧微區(qū)域，促進(jìn)甲烷氧化菌的生長，氧化稻田土壤中產(chǎn)生的甲烷；稻田土壤中產(chǎn)生的甲烷大約有36%[55]到80%甚至更多[60]在根區(qū)微氧區(qū)域被甲烷氧化細(xì)菌消耗。本研究中紫云英綠肥還田配施氮肥后CH4排放相對較低，是否與水稻植株根系發(fā)育程度及其通氣組織有關(guān)還有待更深入的研究。筆者認(rèn)為大量有機(jī)物料及無機(jī)氮肥的投入對水稻植株及其根系影響程度存在差異，進(jìn)而造成稻田甲烷產(chǎn)生、氧化和傳輸過程的不同，最終導(dǎo)致CH4排放存在差異。

本研究發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)中C/N相對含量與CH4排放密切聯(lián)系。冬季輪作及冬作后殘留氮會影響土壤中有效氮含量[61-62]，同時也會影響稻季秸稈還田和氮肥施用，這也可能是導(dǎo)致溫室氣體差異的原因之一。土壤中有效氮源（碳源）是微生物繁殖的限制因素，而不同冬季輪作種植能夠影響土壤有機(jī)質(zhì)含量、培肥地力及改善土壤結(jié)構(gòu)[20]，進(jìn)而改變了微生物代謝的有效有機(jī)碳/氮的組成與數(shù)量[63]，從而顯著影響相關(guān)微生物的生存能力和活性[33]。本研究中，相較于 RF，RP、RW 和RC-G輪作系統(tǒng)下土壤全氮分別提高24.3%、14.0%和7.9%，有機(jī)碳分別提高24.2%、7.2%和6.3%（表1）。這與粱愛珍[64]和汪娟[65]等的部分結(jié)論一致。土壤全氮是能夠反映土壤供氮能力的重要指標(biāo)，而有機(jī)碳在一定程度上影響著土壤結(jié)構(gòu)及其微生物多樣性，同時又是土壤肥力和基礎(chǔ)地力的最重要的物質(zhì)基礎(chǔ)[66]。盡管不同處理下，土壤屬性有所差異，但輪作研究中土壤屬性的變化緩慢而微量。而與秸稈還田和氮肥施用帶來迅速且高通量的CH4排放相比，土壤地力的變化是否是影響當(dāng)季CH4排放的重要因子，有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

N0處理不同輪作模式下稻田CH4排放差異顯著，具體表現(xiàn)為RP＞RW＞RC-G＞RF；增施氮肥后，輪作模式與氮肥水平存在顯著互作，RW、RP和RF的CH4排放顯著增加，而RC-G則略有下降；產(chǎn)甲烷菌與甲烷氧化菌基因豐度比值（mcrA/pmoA）與CH4排放規(guī)律基本一致。鑒此，筆者認(rèn)為稻田系統(tǒng)中秸稈還田C/N的相對含量可能是干擾氮肥水平對稻田CH4排放作用的關(guān)鍵，當(dāng)系統(tǒng)中碳冗余時，相關(guān)微生物活性受到土壤中有效氮制約，投入無機(jī)氮可以減輕氮的限制作用從而顯著提高CH4排放；而碳不足時，繼續(xù)投入無機(jī)氮，相關(guān)微生物繁殖由于受到土壤中有限碳源的限制其活性也會受到抑制，CH4排放相對減少。