姜黃素抗氧化的初步機(jī)理研究

□ 崔冬月 李媛媛 肖寶平 劉靜雯, 李健蘇文金李桂玲?

1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021;1

2.福建省海洋功能食品工程技術(shù)研究中心，福建 廈門361021;

姜黃起源于印度，是常用的香料及色素，是制作咖喱不可或缺的主要材料，有高達(dá)六千年的食用歷史，且具有較強(qiáng)的保健功效[1]。姜黃素(curcumin, Cur)是姜黃的主要成分之一。它是一種多酚類化合物，也是植物界中很稀少的二酮類色素，為橙黃色結(jié)晶粉末，味稍苦，不溶于水[2]，與脂類食物一同食用更易吸收利用。作為姜黃的主要功效成分，姜黃素已通過國家食品藥品監(jiān)督管理局、糧農(nóng)組織以及世界衛(wèi)生組織食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)的安全性及毒性檢測[3]。姜黃素因其分子中含有多個(gè)雙鍵，以及酚羥基和羰基等活性基團(tuán)，在護(hù)胃、保肝、抗氧化、增強(qiáng)免疫力、減肥等多個(gè)保健功效方面都具有很好的作用[1]。在亞洲一些國家,傳統(tǒng)的飲食習(xí)慣使人們攝入較少的飽和脂肪酸和含糖食物，而攝入含有豐富的化學(xué)防護(hù)物質(zhì)的植物，如姜黃素的攝入量（約 100 mg /d）明顯高于西方國家[4]。在印度等經(jīng)常攝入姜黃素的國家，肝癌等高發(fā)癌癥的發(fā)病率遠(yuǎn)低于美國[5]。但是，姜黃素的作用機(jī)理尚未十分明確，進(jìn)一步的探究可以幫助指導(dǎo)姜黃素的膳食攝入。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)人體眾多病變的引發(fā)與活性氧（reactive oxygen species，ROS）的形成有關(guān)，ROS氧中的自由基可通過致癌基因的激活、抑癌基因的失活、活化致癌物等途徑引發(fā)癌癥[6]。因此，增強(qiáng)自由基捕獲能力,消除或減輕自由基所造成的氧化損傷, 是預(yù)防和阻斷癌癥發(fā)展的有效方法[7]。姜黃素的多種活性與其抗氧化作用相關(guān)[8]。本文通過檢測姜黃素對HepG2細(xì)胞抗氧化能力的影響，探究其可能的調(diào)節(jié)機(jī)理，可能為姜黃素對ROS相關(guān)疾病的預(yù)防保健提供理論依據(jù)。

方法

細(xì)胞培養(yǎng)及姜黃素處理

HepG2細(xì)胞購自上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清及1%青霉素-鏈霉素溶液的DMEM高糖培養(yǎng)基（SH30022.01，Hyclone），培養(yǎng)在37℃，含 5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。姜黃素處理方法：姜黃素（C1386，Sigma）以二甲基亞砜（DMSO，Amresco）為溶劑，配制成27 mM的母液。將細(xì)胞以4×105/ mL的密度接種于六孔板中，過夜培養(yǎng)后加入姜黃素至終濃度5、10、15 μM，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。

細(xì)胞增殖率檢測

將HepG2細(xì)胞以1×105/ mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL。細(xì)胞貼壁后，加入姜黃素繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，每孔加入20 μL濃度為 5mg/mL的四甲基噻唑藍(lán)（MTT，奧多福尼），37℃孵育4 h后吸棄上清，加入150 μL DMSO以溶解生成的甲臜，繼續(xù)震蕩10分鐘，用多功能酶標(biāo)儀（SYNERGY/H1，Biotek）測定A490，以溶劑為對照計(jì)算細(xì)胞相對增殖率。

細(xì)胞相對增殖率=（OD實(shí)驗(yàn)組-OD本底）/（OD對照-OD本底）×100%

ROS水平檢測

采用活性氧檢測試劑盒（S0033，碧云天），按產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作。即細(xì)胞用姜黃素處理24 h后吸棄培養(yǎng)基，加入含10 μM DCFH-DA探針的工作液于37℃孵育30分鐘，然后用Opti-MEM無血清培養(yǎng)基（31985-070，Gibco）清洗殘余染料，最后將細(xì)胞收集重懸于無血清培養(yǎng)基中，用酶標(biāo)儀檢測熒光強(qiáng)度（EX488 nm，EM525 nm），并以樣品的蛋白量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)算單位蛋白量下的ROS水平。

總抗氧化能力檢測

分別選用碧云天的總抗氧化能力檢測試劑盒S0119和S0116進(jìn)行檢測。即細(xì)胞用姜黃素處理后吸棄培養(yǎng)基，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS，Hyclone）清洗三遍，細(xì)胞收集后重懸于PBS并超聲波破碎，4℃ 12000g離心5分鐘后，收集上清夜用于檢測。按照試劑盒說明書設(shè)置檢測體系，用酶標(biāo)儀檢測吸光值，計(jì)算單位蛋白量下的總抗氧化能力。最后將對照設(shè)為1，計(jì)算相對總抗氧化能力。

抗氧化酶活性檢測

分別采用南京建成生物工程研究所總超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒（A001-3-2）和 谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）測定試劑盒（A005-1-2）、碧云天的過氧化氫酶（CAT）檢測試劑盒（S0051）進(jìn)行檢測。SOD和GPx檢測的細(xì)胞處理及蛋白樣品提取同總抗氧化能力檢測，CAT檢測采用細(xì)胞裂解液（P0013，碧云天）裂解獲得蛋白樣品。按照試劑盒說明書設(shè)置檢測體系，酶標(biāo)儀檢測吸光值，計(jì)算單位蛋白量下的抗氧化酶活性。最后將對照設(shè)為1，計(jì)算相對抗氧化酶活性。

基因表達(dá)水平檢測

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測。按 Trizol Reagent試 劑 盒（15596-018，Ambion） 的 說明提取細(xì)胞總RNA，并用M-MLV Reverse transcriptase試劑盒（M1705，Promega）將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用TAKARA的 SYBR Premix Ex Taq II試 劑 盒（RR820A）在Applied Biosystems的ABI7300實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中反應(yīng)并測定，以GAPDH為內(nèi)參。本文所用qRTPCR引物序列如下：SOD2（GCTGCACCACAGCAAGCACC和 CCAGCAACTCCCCTTTGGGT）、GPx-1（GTGCTCGGCTTCCCGTGCAAC和 CTCGAAGAGCATGAAGTTGGGC）、CAT（GTGCGGAGATTCAACACTGCCA和CGGCAATGTTCTCACACAGACG） 和GAPDH（ATGACATCAAGAAGGTGGTG和CATACCAGGAAATGAGCTTG）。目的基因的mRNA相對表達(dá)水平以2-??ct公式進(jìn)行計(jì)算。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)表示為平均值±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差（SEM），用SPSS 19分析軟件運(yùn)用單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行比較，測定數(shù)據(jù)均獨(dú)立重復(fù)三次以上進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，＊P＜0.05認(rèn)為數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

姜黃素對細(xì)胞增殖的影響

姜黃素對HepG2細(xì)胞增殖的影響如圖1所示。作用24小時(shí)后，細(xì)胞增殖率隨姜黃素濃度提高略有下降。此時(shí)細(xì)胞尚能有效調(diào)節(jié)代謝，因此選擇5～15 μM為姜黃素作用濃度進(jìn)行后續(xù)檢測。

圖1 姜黃素對HepG2細(xì)胞增殖率的影響

注：5、10、15 μM姜黃素處理HepG2細(xì)胞24小時(shí)后進(jìn)行MTT檢測，將對照（溶劑DMSO處理，即姜黃素濃度為0）的增殖率設(shè)為100%。計(jì)算細(xì)胞相對增殖率。統(tǒng)計(jì)分析：單因素方差分析（n≥3）。

姜黃素降低ROS水平

圖2 姜黃素對HepG2細(xì)胞ROS水平的影響

確定姜黃素作用濃度后，檢測姜黃素對細(xì)胞ROS的影響。結(jié)果如圖2所示，與對照相比，姜黃素處理24小時(shí)后，細(xì)胞ROS含量顯著下降(P＜0.05)，提示姜黃素能夠顯著抑制HepG2細(xì)胞中ROS的積累。

注：5、10、15 μM姜黃素處理HepG2細(xì)胞24小時(shí)后，姜黃素顯著降低細(xì)胞ROS水平。結(jié)果表示為與對照（DMSO處理即姜黃素濃度為0）相比的DCFH-DA熒光強(qiáng)度，將對照的ROS水平設(shè)為1.0。統(tǒng)計(jì)分析：單因素方差分析（n≥3），＊P＜0.05。

姜黃素提高總抗氧化能力

進(jìn)一步檢測姜黃素對細(xì)胞總抗氧化的影響。采用ABTS、FRAP法用碧云天的檢測試劑盒進(jìn)行操作。結(jié)果顯示，與對照相比，姜黃素處理后，細(xì)胞內(nèi)總抗氧化能力顯著提高(P＜0.05)（圖3），提示姜黃素能夠顯著提高細(xì)胞抗氧化能力。

圖3 姜黃素對HepG2細(xì)胞總抗氧化能力的影響

注：5、10、15 μM姜黃素處理HepG2細(xì)胞24小時(shí)后，姜黃素顯著提高細(xì)胞總抗氧化能力。結(jié)果表示為姜黃素處理樣品與對照（DMSO處理）相比的總抗氧化能力（FRAP法和ABTS法檢測），將對照的總抗氧化能力設(shè)為1.0。統(tǒng)計(jì)分析：單因素方差分析（n≥3），不同字母的數(shù)值間有顯著性差異P＜0.05。

姜黃素對抗氧化酶活性及基因表達(dá)水平的影響

確定姜黃素提高HepG2細(xì)胞的抗氧化能力后，進(jìn)一步探究其可能的機(jī)理。首先檢測姜黃素對細(xì)胞抗氧化酶活性的影響，結(jié)果如圖4所示。與對照相比，姜黃素處理樣品的SOD及GPx酶活性顯著提高(P＜0.05)，CAT酶活性變化不大，只在大濃度姜黃素處理時(shí)略有下降。這提示姜黃素能夠提高抗氧化酶SOD和GPx的活性，而對CAT酶活性影響不大。

最后檢測這三種抗氧化酶基因的表達(dá)水平。由于金屬輔機(jī)不同，SOD分為Fe-SOD、Mn-SOD、Cu/ZnSOD等，其中定位于線粒體的Mn-SOD是清除ROS的主要類型。通過對Mn-SOD（SOD-2）、細(xì)胞中的GPx（GPx-1）和CAT的mRNA表達(dá)水平檢測發(fā)現(xiàn)，與對照相比，姜黃素處理細(xì)胞中的SOD-2和GPx-1基因表達(dá)水平顯著上調(diào)(P＜0.05)，而CAT基因表達(dá)水平無顯著變化。

圖4 姜黃素對HepG2細(xì)胞抗氧化酶活性的影響

圖5 姜黃素對HepG2細(xì)胞抗氧化酶基因表達(dá)的影響

大，僅在大濃度姜黃素作用時(shí)略有下降。結(jié)果表示為姜黃素處理樣品與對照（DMSO處理）相比的酶活性，將對照的酶活性設(shè)為1.0。統(tǒng)計(jì)分析：單因素方差分析（n≥3），不同字母的數(shù)值間有顯著性差異P＜0.05。

注：5、10、15 μM姜黃素處理HepG2細(xì)胞24小時(shí)后，SOD-2、GPx-1基因的mRNA水平顯著上升，CAT基因表達(dá)無顯著變化。結(jié)果表示為與對照（DMSO處理）相比的目的基因表達(dá)水平，以GAPDH為內(nèi)參，將對照的基因表達(dá)水平設(shè)為1.0。統(tǒng)計(jì)分析：單因素方差分析（n≥3），不同字母的數(shù)值間有顯著性差異P＜0.05。

討論

姜黃素是世界衛(wèi)生組織準(zhǔn)許使用的食品添加劑，其兩側(cè)苯環(huán)上的甲氧基能夠增強(qiáng)其抗氧化活性[4]。姜黃素的自由基清除效果強(qiáng)于維生素E多倍，對類自由基的清除作用更強(qiáng)[9]，因此它也被應(yīng)用于膳食保健。但在姜黃素的體內(nèi)抗氧化活性研究中，它對不同細(xì)胞和動(dòng)物模型的作用效果和機(jī)理不盡相同，且可能通過多途徑產(chǎn)生影響[11]，因此相關(guān)機(jī)制還在不斷探究中。

ROS中包含的自由基等強(qiáng)氧化物質(zhì)會(huì)造成細(xì)胞氧化損傷(oxidative damage)，而氧化損傷與多種慢性病如心血管病、癌癥等密切相關(guān)[12]。在正常生理狀態(tài)下, ROS維持在較低水平，微量的ROS參與細(xì)胞內(nèi)多種生化反應(yīng)[13, 14]，而在癌細(xì)胞中ROS過量產(chǎn)生，通過誘導(dǎo)基因組不穩(wěn)定性，修飾基因表達(dá)和參與信號傳導(dǎo)等途徑促進(jìn)癌變發(fā)展[15]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，降低ROS產(chǎn)生量能夠降低癌癥發(fā)病率和病死率[16]，抑制腫瘤細(xì)胞增殖和血管生成[17, 18]。因此，控制細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生對預(yù)防癌癥等機(jī)體損傷具有積極作用。本研究顯示姜黃素作用24h顯著降低HepG2細(xì)胞的ROS水平。這可能是姜黃素激活了細(xì)胞內(nèi)源性的抗氧化防御機(jī)制，提高了抗氧化能力引起的?？寡趸负头敲缚寡趸镔|(zhì)是細(xì)胞抗氧化活性的重要組成部分，抗氧化酶中SOD是首當(dāng)其沖的的第一道抗氧化防線，能催化強(qiáng)自由基超氧陰離子O2·—歧化轉(zhuǎn)化為過氧化氫，過氧化氫由GPx、CAT等抗氧化酶迅速分解生成水和氧氣。本研究結(jié)果顯示，姜黃素能夠顯著提高細(xì)胞的總抗氧化能力、SOD和GPx酶的活性，提示姜黃素降低ROS累積可能是由提高抗氧化酶活性、增強(qiáng)抗氧化功能引起的。這與曾瑜等的報(bào)道[19]類似, 他們發(fā)現(xiàn)急性酒精肝損傷小鼠的血清與肝組織SOD、GSH-Px活力會(huì)隨姜黃素濃度增加而升高。

Mn-SOD特異性定位于線粒體，其作用在于維持氧自由基的平衡、清除轉(zhuǎn)移超氧陰離子自由基、防御氧化損傷。本研究結(jié)果顯示，姜黃素能夠顯著提高M(jìn)n-SOD、GPx-1的mRNA表達(dá)水平，與細(xì)胞中SOD和GPx等抗氧化酶活性增加的結(jié)果一致。抗氧化酶基因表達(dá)量的增加有助于酶活的提高，提示姜黃素可能通過對Mn-SOD和GPx-1基因的調(diào)節(jié)發(fā)揮其抗氧化作用，更詳盡的機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。CAT酶活性僅在高濃度姜黃素作用后略有下降，其基因表達(dá)量也無明顯變化，提示在HepG2細(xì)胞中CAT的酶活性和表達(dá)可能與姜黃素的抗氧化作用無緊密關(guān)系。

綜上，姜黃素可以增強(qiáng)HepG2細(xì)胞的SOD和GPx酶活性，提高細(xì)胞的總抗氧化能力，使細(xì)胞中ROS水平下降，Mn-SOD和GPx-1的基因表達(dá)上調(diào)。姜黃素的抗氧化作用可能是通過調(diào)節(jié)抗氧化酶的表達(dá)和活性實(shí)現(xiàn)的，但具體的機(jī)理仍有待研究。本研究闡述了姜黃素可能的抗氧化作用機(jī)制，可為姜黃素的膳食保健應(yīng)用提供理論依據(jù)及方向引導(dǎo)，但更深入詳細(xì)的細(xì)胞內(nèi)姜黃素的生物學(xué)功能途徑還有待進(jìn)一步發(fā)掘。