高效液相色譜法測(cè)定不同產(chǎn)地假蒟中的α-細(xì)辛腦含量

李 清，何明月，瞿發(fā)林，譚興起，董文燊，倪玉佳，邵留英

(中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇四醫(yī)院，江蘇 常州 213003)

0 引言

假蒟系胡椒科假蒟(PipersarmentosumRoxb.)的干燥莖、葉或全草，又稱蛤蒟、假荖、蛤荖、假蔞、蛤蔞等，始載于清·何諫《生草藥性備要》[1]。其植物資源豐富，全年可采收，廣泛分布于我國廣西、廣東、云南、海南、福建、貴州等省份，印度、越南、菲律賓、泰國、馬來西亞等國家也有分布，且藥食兩用[2]，是極具特色的民族植物藥。本品性溫、味辛，主治風(fēng)寒咳嗽，風(fēng)濕腰痛，心下脹滿，泄瀉痢疾，產(chǎn)后腳腫，外傷出血，跌打損傷等[3]。目前，關(guān)于假蒟藥理作用的研究，有抗氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗骨質(zhì)疏松、抗菌、殺蟲[4-8]和抗抑郁[9]等方面的報(bào)道。近年來的研究表明假蒟中揮發(fā)油含量較高，主要含有α-細(xì)辛腦、石竹烯等多種成分，其中尤以α-細(xì)辛腦的含量最高，達(dá)到了40.33%[10-12]。目前已有關(guān)于不同產(chǎn)地假蒟中α-細(xì)辛腦含量的相關(guān)研究報(bào)道[13-15]，但這些研究中的假蒟藥材均只采自廣西一省，未能將其他省份所產(chǎn)的假蒟一同進(jìn)行研究。為進(jìn)一步完善假蒟質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，更好的開發(fā)和利用假蒟的自然資源，筆者首次對(duì)產(chǎn)自不同省份的假蒟進(jìn)行了有關(guān)α-細(xì)辛腦含量的研究。

1 儀器、試劑與材料

1.1 藥材與試劑

假蒟藥材采自廣西、廣東、海南、云南、福建以及越南等地(詳情如表1所示)，經(jīng)聯(lián)勤保障部隊(duì)第904醫(yī)院瞿發(fā)林主任藥師鑒定為胡椒科假蒟PipersarmentosumRoxb.的地上部分；α-細(xì)辛腦對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100298-201203)；乙腈、甲醇為色譜純；水為純化水。

表1 假蒟藥材的來源

1.2 儀器

Waters系列高效液相色譜儀(美國Waters公司，Empower2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng))；電熱恒溫水浴鍋(上海醫(yī)療器械五廠)；XS105型十萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；FA1004電子分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Lichrospher C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-0.05%磷酸溶液(47:53)，流速為1.0 ml/min，檢測(cè)波長313 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量為20 μl。在上述條件下，理論塔板數(shù)按α-細(xì)辛腦計(jì)算不低于1×104，α-細(xì)辛腦對(duì)照品和假蒟供試品的色譜圖如圖1。

2.2 溶液的制備

精密稱取α-細(xì)辛腦對(duì)照品19.5 mg置100 ml容量瓶中，用適量甲醇溶解，搖勻并定容后即得濃度為0.1950 mg/ml的對(duì)照品溶液。稱取假蒟干燥粗粉0.3 g，精密稱定，加入50%甲醇20 ml后回流提取1 h，放冷至室溫，再用50%甲醇補(bǔ)足減少的量，搖勻靜置后吸取上清液，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，即得假蒟供試品溶液。

2.3 線性范圍考察

分別精密吸取0.5、1、2、4、8、10 ml的上述α-細(xì)辛腦對(duì)照品溶液(0.1950 mg/ml)，置于10 ml容量瓶中，加甲醇稀釋、搖勻、定容，隨后分別吸取上述6個(gè)濃度的稀釋液進(jìn)樣，進(jìn)樣量為20 μl，記錄下峰面積。以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得出回歸方程為：

Y=4×107X+5993.2，r=0.9998

結(jié)果表明α-細(xì)辛腦的進(jìn)樣量在0.0970～1.934 μg之間時(shí)，與峰面積有著良好的線性關(guān)系。

2.4 精密度考察

取同一批假蒟供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定α-細(xì)辛腦峰面積值，計(jì)算RSD為0.82%，結(jié)果表明儀器設(shè)備精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次的假蒟藥材粗粉6份，每份0.3 g，精密稱定，按“2.2”項(xiàng)下的方法制備假蒟供試品溶液，測(cè)得α-細(xì)辛腦含量的平均值為2.1254 mg/g，其RSD為1.04%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按“2.2”項(xiàng)下的方法制備假蒟供試品溶液，于制備后0、2、4、8、12、24 h分別進(jìn)樣20 μl測(cè)定峰面積，測(cè)得α-細(xì)辛腦峰面積的RSD為0.94%，表明假蒟供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

分別取0.15 g已知α-細(xì)辛腦含量的藥材粉末(α-細(xì)辛腦含量為2.1254 mg/g)各6份，精密稱定，置100 ml的具塞錐形瓶中，分別精密加入與藥材相當(dāng)量的α-細(xì)辛腦對(duì)照品(0.330 2 mg/ml)溶液1 ml，按“2.2”項(xiàng)下的方法制備假蒟供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表2所示，計(jì)算出α-細(xì)辛腦的平均回收率為99.94%，RSD為1.13%。

圖1 α-細(xì)辛腦對(duì)照品(A)和假蒟供試品(B)的HPLC圖 1.α-細(xì)辛腦

批次取樣量(g)樣品中的含量(mg)加入量(mg)實(shí)測(cè)值(mg)回收率(%)平均值(%)RSD(%)10.15040.31960.33020.647499.5799.941.1320.15020.31920.33020.648399.8530.15030.31940.33020.645999.1340.15010.31900.33020.6519100.9250.15000.31880.33020.644198.5760.15000.31880.33020.6541101.61

2.8 樣品的測(cè)定

取不同采收地區(qū)或采收時(shí)間的假蒟藥材22批，按“2.2”項(xiàng)下的方法制備假蒟供試品溶液，分別精密吸取供試品溶液各20 μl，按“2.1”項(xiàng)下的方法進(jìn)行測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算α-細(xì)辛腦含量，結(jié)果如表3所示。

表3 不同產(chǎn)地假蒟中α-細(xì)辛腦的含量

圖2 不同產(chǎn)地假蒟中α-細(xì)辛腦的含量

3 討論

揮發(fā)油是一類由萜類、脂肪族和芳香族構(gòu)成的復(fù)雜化合物，具有發(fā)散解表、祛風(fēng)除濕、芳香開竅、清熱解毒、止咳祛痰等作用，均有特殊香氣與辛辣味。假蒟氣味芳香，其所含揮發(fā)油含量也較高，有研究表明假蒟中揮發(fā)油的得油率(%，ml/g)可達(dá)1.5%[16]。由此可見，在假蒟質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究中，對(duì)其揮發(fā)油含量進(jìn)行測(cè)定有著重要意義。近年來，α-細(xì)辛腦因其具有良好的平喘、止咳、祛痰、鎮(zhèn)靜、解痙以及抗驚厥等作用，逐漸成為大家研究的熱點(diǎn)之一[17]，而假蒟揮發(fā)油成分中，α-細(xì)辛腦含量最高，且在HPLC圖譜中與其他化合物分離度良好，信息峰穩(wěn)定，因此測(cè)量其含量具有一定的研究意義，亦可作為質(zhì)量控制的方法之一。

關(guān)于假蒟中α-細(xì)辛腦含量的研究，已報(bào)道的文獻(xiàn)中，假蒟藥材均取樣自廣西省境內(nèi)。但假蒟在我國分布卻不只是局限于廣西省，其廣泛分布于我國大部分熱帶地區(qū)。因此，本研究收集了采自不同省份以及越南的假蒟藥材，對(duì)其中的α-細(xì)辛腦含量進(jìn)行了測(cè)定，這在我國尚屬首次，填補(bǔ)了這方面的研究空白。方法學(xué)考察結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)所建立的方法簡單易行，具有良好的線性、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和加樣回收率。因此，可對(duì)假蒟中α-細(xì)辛腦的含量進(jìn)行準(zhǔn)確地測(cè)定，從而對(duì)假蒟藥材進(jìn)行有效的質(zhì)量控制。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明(如圖2所示)，不同產(chǎn)地的假蒟，其α-細(xì)辛腦含量有著較大差別，22批假蒟藥材中，采自越南的假蒟所含α-細(xì)辛腦含量最高(4.1071 mg/g)。在所收集的假蒟藥材中，有野生的假蒟，也有栽培的假蒟，研究發(fā)現(xiàn)采自同一省份的假蒟栽培品中，α-細(xì)辛腦的含量要遠(yuǎn)低于野生假蒟。若以省份來劃分產(chǎn)地，產(chǎn)自廣西省的假蒟(不包括栽培品)中的α-細(xì)辛腦平均含量(2.6842 mg/g)要明顯高于廣東(0.8374 mg/g)、云南(0.6942 mg/g)、海南(0.9934 mg/g)及福建(0.2265 mg/g)等省。此外，本文的研究中還發(fā)現(xiàn)有一批假蒟藥材(編號(hào)19，廣東揭陽)中α-細(xì)辛腦含量為0 mg/g。分析原因后，推測(cè)是由于這批藥材干燥處理時(shí)，沒有采用陰干的方式，將藥材直接置于強(qiáng)烈陽光下曬干導(dǎo)致的。然后，本課題組又從19號(hào)藥材的同一產(chǎn)地采得一批藥材(編號(hào)22)，陰干處理后進(jìn)行α-細(xì)辛腦含量測(cè)定，結(jié)果顯示這批藥材中α-細(xì)辛腦含量為1.3555 mg/g。這一發(fā)現(xiàn)與文獻(xiàn)報(bào)道[18]吻合，用曬干方式得到的假蒟藥材中不含有α-細(xì)辛腦，因陽光直射的高溫會(huì)使得α-細(xì)辛腦轉(zhuǎn)化為它的同分異構(gòu)體β-細(xì)辛腦。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可為進(jìn)一步完善假蒟質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù)。