不同照射方式下核黃素-A波紫外線兔鞏膜膠原交聯(lián)術(shù)對(duì)兔鞏膜成纖維細(xì)胞生物力學(xué)特性的影響

韓寶雁 侯玉榮 陳博宇

近視為眼科的常見病，目前發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)。近視發(fā)病機(jī)制主要為在環(huán)境和遺傳因素的共同作用下，鞏膜生物力學(xué)特性的改變誘導(dǎo)鞏膜發(fā)生了主動(dòng)重塑，進(jìn)而造成了眼軸的拉長(zhǎng)。作為鞏膜主要組成細(xì)胞的鞏膜成纖維細(xì)胞，其力學(xué)特性及細(xì)胞信號(hào)傳遞通路的改變?cè)诟叨冉暤男纬芍衅鸬街陵P(guān)重要的作用。鞏膜交聯(lián)術(shù)是近年來(lái)開展的一項(xiàng)新技術(shù)，能增強(qiáng)鞏膜自身生物力學(xué)強(qiáng)度，阻止鞏膜的擴(kuò)張，防治進(jìn)行性近視發(fā)生。目前，國(guó)際上兔眼鞏膜交聯(lián)研究中普遍采用370 nm的A波紫外線 (ultraviolet A，UVA)，功率3 mW·cm-2，照射時(shí)間30 min，總能量為5.4 J·cm-2[1]。本實(shí)驗(yàn)采用兩種總能量相同(5.4 J·cm-2)，但功率及照射時(shí)間均不同的照射方式對(duì)新西蘭兔鼻上方鞏膜進(jìn)行核黃素-UVA交聯(lián)，旨在通過(guò)細(xì)胞微管吸吮實(shí)驗(yàn)，探討不同照射方式下核黃素-UVA鞏膜交聯(lián)術(shù)前后鞏膜成纖維細(xì)胞的細(xì)胞黏彈性變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取健康新西蘭大白兔24只，無(wú)眼部疾患，雌雄兼用，隨機(jī)將兔平均分為A、B兩組，每組均選取左眼為實(shí)驗(yàn)眼，右眼為對(duì)照眼。

1.1.2 試劑與儀器注射用核黃素磷酸鈉(珠海經(jīng)濟(jì)特區(qū)生物化學(xué)制藥廠)，羥糖苷滴眼液(美國(guó)Alcon公司)，二甲基亞砜(美國(guó) Gibco公司)；微管吸吮系統(tǒng)包括微機(jī)械手、倒置顯微鏡、顯微圖像分析系統(tǒng)、電子數(shù)顯高度尺(XKG300，北京量具刃具廠)，細(xì)胞小室、可調(diào)節(jié)水位的水箱、計(jì)算機(jī)1臺(tái)、37～38 ℃林格氏液的環(huán)境箱(以上生物力學(xué)的儀器由太原理工大學(xué)應(yīng)用力學(xué)研究所提供)。

1.1.3 主要試劑的配制5-磷酸核黃素：將5 mL羥糖苷滴眼液與5 mg注射用核黃素磷酸鈉溶液混合、搖勻。丁卡因眼液：注射用丁卡因5 mg與生理鹽水注射液5 mL混合、搖勻。DMEM培養(yǎng)液(即細(xì)胞培養(yǎng)液)：由體積分?jǐn)?shù)20%的胎牛血清、100×103U·L-1的青霉素、100 mg·L-1的鏈霉素配制而成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 核黃素-UVA兔鞏膜膠原交聯(lián)術(shù)每組選取左眼為實(shí)驗(yàn)眼，右眼為對(duì)照眼，水合氯醛合劑(3 mL·kg-1)腹腔注射麻醉實(shí)驗(yàn)兔，開瞼器開瞼，將內(nèi)外直肌間的上方的球結(jié)膜及筋膜充分分離，上方角膜緣6-0牽引線拉向顳下方，充分暴露鼻上方鞏膜(圖1)；在暴露區(qū)滴加5-磷酸核黃素溶液，浸潤(rùn)5 min，然后用波長(zhǎng)370 nm的紫外線燈聚焦照射暴露區(qū)(圖2)。A組的照射時(shí)間為30 min，能量密度為3.0 mW·cm-2；B組的照射時(shí)間為9 min，能量密度為10.0 mW·cm-2。照射期間，每2 min滴加1次5-磷酸核黃素溶液，以保持鞏膜的濕潤(rùn)。

圖1 術(shù)中接受紫外照射的鼻上象限鞏膜的暴露。圖2 紫外交聯(lián)儀正在照射暴露的交聯(lián)部位鞏膜

1.2.2 兔鞏膜成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定術(shù)后60 d，取實(shí)驗(yàn)眼照射部位的鞏膜組織，及對(duì)照眼相應(yīng)部位的鞏膜組織，用眼科顯微剪刀將鞏膜組織剪成1 mm×1 mm的碎塊，采用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)兔的鞏膜成纖維細(xì)胞，用免疫細(xì)胞化學(xué)法對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。

1.2.3 細(xì)胞微管吸吮系統(tǒng)微管實(shí)驗(yàn)腔是由兩塊干凈的蓋玻片、一個(gè)中間開口的不銹鋼架子組成。細(xì)胞懸液注入微管實(shí)驗(yàn)腔時(shí)，液體靠表面張力的作用而懸浮于蓋玻片上，微管可以從腔體的兩側(cè)開口處進(jìn)入。當(dāng)細(xì)胞懸液約0.5 mL(106個(gè)·mL-1)加入微管實(shí)驗(yàn)腔后，可用放大的油鏡和目鏡觀察待測(cè)細(xì)胞，然后用顯微操作手緩慢地將微管尖端靠近細(xì)胞表面，通過(guò)壓力控制系統(tǒng)對(duì)微管產(chǎn)生階躍式負(fù)壓以吸吮細(xì)胞，使細(xì)胞的一小部分被吸入微管內(nèi)。階躍式負(fù)壓是指首先給待測(cè)細(xì)胞施加0.01 kPa的負(fù)壓，隨后調(diào)節(jié)壓力，對(duì)待測(cè)細(xì)胞逐步施加0.02 kPa的階躍式負(fù)壓，細(xì)胞達(dá)到穩(wěn)態(tài)后，再記錄細(xì)胞被吸入的長(zhǎng)度和相應(yīng)負(fù)壓值。依細(xì)胞的差異而調(diào)節(jié)施加負(fù)壓的范圍，使吸入的長(zhǎng)度小于微管的內(nèi)徑，以保證細(xì)胞的變形在彈性范圍之內(nèi)。

1.2.4 力學(xué)模型根據(jù)半無(wú)限體模型可推出細(xì)胞的彈性模量E：

△p表示吸入負(fù)壓，a表示微管內(nèi)徑，L表示吸入長(zhǎng)度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，n為各實(shí)驗(yàn)組所測(cè)量細(xì)胞的個(gè)數(shù)，各組細(xì)胞的彈性模量E則經(jīng)過(guò)Origin Pro 8.0統(tǒng)計(jì)，最終結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示。我們利用標(biāo)準(zhǔn)線性的黏彈性固體模型來(lái)描述細(xì)胞的黏彈性行為：在階躍式的負(fù)壓△p作用下，吸入長(zhǎng)度L與時(shí)間的關(guān)系式為

τ為△p作用下變形松弛的時(shí)間，μ為表觀黏性系數(shù)，E0為瞬態(tài)彈性模量，E∞為平衡彈性模量。參數(shù)A與參數(shù)B均可以由擬合曲線得出。利用OriginPro 8.0軟件對(duì)給定負(fù)壓的平均吸入長(zhǎng)度曲線，進(jìn)行指數(shù)擬合。其中n為各組中測(cè)量細(xì)胞的總數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用 SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果原代培養(yǎng)：組織塊培養(yǎng)3～5 d后，新分裂的游離細(xì)胞多呈現(xiàn)為小的三角形或星形，約10 d后細(xì)胞生長(zhǎng)為新生細(xì)胞體積的2～3倍。形態(tài)呈長(zhǎng)梭形，10～14 d后細(xì)胞進(jìn)入分裂增殖旺盛的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。傳代培養(yǎng)：傳代接種的細(xì)胞密度為109個(gè)·L-1，約2 h即可貼壁，按12的比例傳代，7～14 d傳代1次。

2.2 鞏膜成纖維細(xì)胞鑒定結(jié)果用免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定顯示鞏膜成纖維細(xì)胞Vimentin染色呈陽(yáng)性，細(xì)胞漿內(nèi)可見清晰的棕黃色陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物，Desmin染色以及Keratin染色均呈陰性，S-100染色也呈陰性，上述觀察結(jié)果表明所提取并培養(yǎng)的細(xì)胞為鞏膜成纖維細(xì)胞。

2.3 鞏膜成纖維細(xì)胞微管吸吮實(shí)驗(yàn)結(jié)果A、B兩組實(shí)驗(yàn)眼鞏膜細(xì)胞的楊氏模量、表觀黏性均較各自對(duì)照眼顯著增強(qiáng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；而A、B兩組實(shí)驗(yàn)眼間及對(duì)照眼間鞏膜細(xì)胞的楊氏模量、表觀黏性差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。以上結(jié)果表明，交聯(lián)術(shù)后鞏膜細(xì)胞的黏彈性發(fā)生了明顯的變化，黏彈性顯著升高。而兩種照射方式之間鞏膜細(xì)胞的黏彈性無(wú)顯著差異(見表1)。

表1 各組鞏膜成纖維細(xì)胞的細(xì)胞生物力學(xué)性能數(shù)據(jù)分析表

注：與同組對(duì)照眼比較，*P<0.05

3 討論

病理性近視的特點(diǎn)是眼軸出現(xiàn)進(jìn)行性增長(zhǎng)、鞏膜厚度變薄(尤其易發(fā)生在鞏膜后極部)，嚴(yán)重時(shí)可引起后鞏膜葡萄腫[2-3]。近年來(lái)多項(xiàng)臨床及實(shí)驗(yàn)研究表明，鞏膜的主動(dòng)重塑在眼球發(fā)育、正視化發(fā)展以及近視形成的過(guò)程中起著十分重要的作用。國(guó)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)通過(guò)紫外線-核黃素誘導(dǎo)交聯(lián)的方法，可以加強(qiáng)角膜及鞏膜組織的機(jī)械強(qiáng)度，阻止圓錐角膜及進(jìn)行性近視的病理進(jìn)程[4-5]。目前國(guó)際上已將此方法用于臨床治療角膜疾病，但對(duì)于鞏膜膠原交聯(lián)的研究目前還處在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究階段[6-9]。Wollensak等[6]對(duì)人及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物兔鞏膜行核黃素-UVA膠原交聯(lián)，證實(shí)其可增加鞏膜組織生物抗張力作用，但當(dāng)UVA的照射參數(shù)為：能量密度4.2 mW·cm-2，照射時(shí)間30 min，總能量7.6 J·cm-2時(shí)，導(dǎo)致視網(wǎng)膜的光感受器細(xì)胞和色素上皮細(xì)胞嚴(yán)重受損，但將UVA的照射能量密度、照射時(shí)間和總能量改為3 mW·cm-2、30 min、5.4 J·cm-2時(shí)，取得了較好的加強(qiáng)鞏膜強(qiáng)度的效果，有效且安全[1]。

根據(jù)本生-羅斯科互易律的規(guī)定，即在能量密度低于50 mW·cm-2、照射時(shí)間>2 min的照射都是有效的，若同時(shí)增加能量密度，減少照射的時(shí)間，且保證照射總能量相同，對(duì)兔角膜及鞏膜的膠原交聯(lián)應(yīng)該是有效的[9]。Schumacher等[10]通過(guò)研究證明能量密度3 mW·cm-2、照射時(shí)間30 min的UVA得到的交聯(lián)效果，與快速膠原交聯(lián)9 mW·cm-2、10 min時(shí)的交聯(lián)效果幾乎是同等的。以往的研究也表明，5.4 J·cm-2能量的核黃素-UVA膠原交聯(lián)可引起兔及人角膜硬度的增加[9-10]，而角膜和鞏膜組織在相同能量密度下進(jìn)行膠原交聯(lián)，可發(fā)生相似的組織結(jié)構(gòu)的改變[11]。因此，我們有理由相信照射總能量為5.4 J·cm-2的核黃素-UVA膠原交聯(lián)可引起兔鞏膜膠原纖維密度和直徑的增加，而對(duì)眼內(nèi)組織不造成損傷。為了證實(shí)這一點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)選用兩種不同的照射方式對(duì)兔眼鼻上象限的鞏膜組織進(jìn)行了膠原交聯(lián)實(shí)驗(yàn)，兩組照射的總能量均為5.4 J·cm-2。另外，鑒于鞏膜為瓷白色組織，UVA在鞏膜的穿透性較角膜相對(duì)較弱，但由于鞏膜對(duì)藥物的滲透性較好，故本實(shí)驗(yàn)中提前5 min在照射區(qū)域滴加光敏劑核黃素溶液，以保證照射前待照射區(qū)域已經(jīng)滲透足夠的核黃素。

目前生物力學(xué)研究已由組織深入到細(xì)胞。以往研究表明，細(xì)胞的各項(xiàng)生命活動(dòng)如生長(zhǎng)、分化、調(diào)控、凋亡以及癌變等，都與細(xì)胞力學(xué)特性密切相關(guān)。而在近視的發(fā)展過(guò)程中，鞏膜成纖維細(xì)胞作為組成鞏膜的主要細(xì)胞，其細(xì)胞信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)和表達(dá)及其力學(xué)特性的改變對(duì)鞏膜發(fā)生重塑具有重要影響，對(duì)近視的形成具有舉足輕重的作用[12-14]。因此對(duì)細(xì)胞力學(xué)性能尤其是近視眼鞏膜成纖維細(xì)胞的研究對(duì)于人們深入認(rèn)識(shí)及改善細(xì)胞功能，具有十分重要的意義。近年來(lái)，在鞏膜細(xì)胞力學(xué)方面的研究也逐漸深入。陳維毅等[15]用微管吸吮的方法結(jié)合半無(wú)限體細(xì)胞力學(xué)模型測(cè)定透鏡誘導(dǎo)豚鼠對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組鞏膜成纖維細(xì)胞的力學(xué)特性，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組鞏膜成纖維細(xì)胞的黏彈性參數(shù)明顯升高。Chen等[16]用同樣的方法與力學(xué)模型研究透鏡誘導(dǎo)豚鼠不同誘導(dǎo)時(shí)間前部及后極部鞏膜成纖維細(xì)胞的力學(xué)特性，LIM組前部及后極部鞏膜成纖維細(xì)胞的平衡楊氏模量、黏彈性參數(shù)分別在誘導(dǎo)30 d和誘導(dǎo)15 d后有明顯升高，即有“硬化”現(xiàn)象。Wang等[17]通過(guò)FX-4000力學(xué)加載系統(tǒng)對(duì)兔鞏膜成纖維細(xì)胞進(jìn)行力學(xué)環(huán)境中的培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)動(dòng)態(tài)拉伸加載能增加鞏膜成纖維細(xì)胞的增殖活性，同時(shí)能使各組鞏膜成纖維細(xì)胞的生物力學(xué)特性發(fā)生改變。陳博宇等[18]將不同質(zhì)量濃度的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β2(分別為0 mg·L-1、1 mg·L-1、10 mg·L-1、100 mg·L-1)作用于后極部鞏膜成纖維細(xì)胞24 h，利用細(xì)胞微管吸吮的方法測(cè)定各組鞏膜成纖維細(xì)胞的力學(xué)特性，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β2能有效刺激基質(zhì)金屬蛋白酶2的表達(dá)。所有這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鞏膜成纖維細(xì)胞的力學(xué)特性改變必然會(huì)對(duì)其形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生影響。這種變化反映了細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)以及組成，伴隨近視的發(fā)展和內(nèi)部微力學(xué)環(huán)境的變化，而發(fā)生了相應(yīng)的重組。