色譜質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合主成分分析鑒別廬山云霧茶真?zhèn)?/h1>
2019-08-07 06:32:52徐春暉王遠(yuǎn)興
中國食品學(xué)報 2019年7期
劉 曄 徐春暉 王遠(yuǎn)興
（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室 南昌330047）
“匡廬奇秀甲天下，云霧醇香益壽年”的廬山云霧茶宛若碧玉，味似龍井而更醇香，色如沱茶卻更清淡，是綠茶中的珍品[1]。廬山云霧茶保護(hù)區(qū)范圍大，茶場分散，市場規(guī)范難度大，大量非原產(chǎn)地的廬山云霧茶以低廉的價格擾亂市場，真正產(chǎn)自保護(hù)區(qū)范圍內(nèi)的廬山云霧茶得不到有效保護(hù)，這對廬山云霧茶的銷售價格及市場聲譽均有較大影響。
指紋圖譜可以鑒別真實性，評價質(zhì)量一致性和產(chǎn)品穩(wěn)定性，具有整體性和模糊性的特點，能夠較全面地反映多種化合物的內(nèi)在作用關(guān)系，通過與模式識別技術(shù)相結(jié)合，可有效提取有效信息[2]。紅外光譜法、HPLC、GC、GC-MS 和液-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS）等方法均能生成指紋圖譜[3-5]。
HPLC 技術(shù)分離性能高，穩(wěn)定性好，可有效分析檢測食品中多種化學(xué)成分，己被廣泛應(yīng)用到食品指紋圖譜構(gòu)建的研究中。它能夠結(jié)合多種檢測器，比如紫外檢測器、二極管陣列檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器、質(zhì)譜檢測器等。Xie 等[6]釆用LC-MS技術(shù)建立了不同基因類型和不同部位的絞股藍(lán)樣品的黃酮類化合物指紋圖譜，PCA 能夠取得較好的分類結(jié)果。
GC 或GC-MS 技術(shù)具有高靈敏度和高選擇性，可以很好的分離、鑒定和定性化合物的特性[7]。李萬春等[8]采用衍生化GC-MS 方法，對福建省安溪縣境內(nèi)8 個鄉(xiāng)鎮(zhèn)的鐵觀音及3 個烏龍茶品種通過化學(xué)計量學(xué)對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、建模，確定茶葉的品種及產(chǎn)地，PCA 結(jié)果表明安溪縣境內(nèi)不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)的鐵觀音表型有明顯差異，相鄰鄉(xiāng)鎮(zhèn)的茶葉代謝表型相似，為辨別安溪鐵觀音真?zhèn)蔚於嘶A(chǔ)。王麗鴛等[9]利用多元化學(xué)指紋圖譜方法對杭州、麗水和新昌3 個地區(qū)9 類扁形綠茶產(chǎn)品進(jìn)行判別分析，結(jié)果表明，同一品種不同產(chǎn)地或同一產(chǎn)地不同品種綠茶樣本指紋圖譜間存在顯著差異。
本文將廬山云霧茶水溶性成分和揮發(fā)性成分作為研究對象，分別采用HPLC 和GC-MS 分析技術(shù)對廬山云霧茶和測試樣本的成分進(jìn)行探討，獲得廬山云霧茶的指紋圖譜數(shù)據(jù)并得到各成分的相對峰面積，然后利用PCA 對相對峰面積進(jìn)行處理，研究結(jié)果可對廬山云霧茶的真?zhèn)巫R別提供一定參考。
1 試驗部分
1.1 樣品與試劑
供試廬山云霧茶，通遠(yuǎn)鎮(zhèn)（S1-S5）廬山茶科所茶場；賽陽鎮(zhèn)（S6-S9），廬山露語茶業(yè)有限公司；星子縣（S10-S12），星子縣廬山七尖云霧茶有限公司，以及廬山市本地、市面上采買的8 個茶葉樣本（S13-S20）。供試品均采于2016年5月份，樣品放置于4 ℃冰箱中保存。
甲醇（色譜純），德國Merck 公司；甲酸（色譜純），ROE 公司；水，屈臣氏蒸餾水；表沒食子兒茶素（HPLC≧94%）、咖啡因（HPLC≧99%）、芹菜素（HPLC≧96%）、蘆?。℉PLC≧92%）、表兒茶素沒食子酸酯（HPLC≧95%），中國食品藥品鑒定研究院。
1.2 儀器與設(shè)備
Agilent1290 超高相液相色譜儀（四元泵、在線脫氣機、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD 檢測器）、Eclipse Plus-C 18 column （4.6 mm×100 mm，3.5 μm）、Agilent GC- QQQ 7890/7000A 三重串聯(lián)四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀、HP-5 MS 石英彈性毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），美國Agilent 公司；萃取纖維頭50/30 μm DVB/ CAR/ PDMS，美國Supelco 公司；AL104 電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；KQ5200E 型超聲波清洗器，機械昆山市超聲儀器有限公司；TDL-5-A 型離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠。
1.3 樣品預(yù)處理
1.3.1 水溶性成分的提取 將茶葉粉碎過篩，精確稱取1.00 g 粉末并加入50 mL 超純水，超聲10 min，80 ℃水浴30 min，置于離心機中5 000 r/min離心15 min，將上清液用0.22 μm 水系濾膜過濾，得到茶葉水溶性成分。
1.3.2 揮發(fā)性成分的提取 將茶葉粉碎過篩，精確稱取2.00 g 粉末于20 mL 頂空萃取瓶中，立即用含隔墊蓋子密封；將頂空瓶置于80 ℃水浴鍋中水浴平衡30 min，每隔10 min 晃動瓶身；再將固相萃取頭插入頂空萃取瓶中，萃取吸附30 min[10]。萃取結(jié)束后將萃取頭放入GC-MS 進(jìn)樣口中，250℃解析5 min，以檢測茶葉揮發(fā)性成分。
1.4 色譜和質(zhì)譜條件
1.4.1 HPLC 條件 流動相：以0.1%甲酸水溶液為流動相A 和甲醇為流動相B 進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫：0～15 min：5%～20%（B）；15～35 min：20%～45%（B）；35～40 min：45%～5%（B）。二級管陣列檢測器（DAD）波長：254 nm；柱溫：30 ℃；流速：0.6 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL。
1.4.2 GC-MS 條件 色譜條件：色譜柱：HP-5 MS 石英毛細(xì)柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：起始柱溫50 ℃，保持5 min，以5 ℃/min 升至80 ℃，然后以2 ℃/min 升至140 ℃，最后以5 ℃/min 升至210 ℃保持5 min；載氣為高純氦氣（純度≥99.999%）；載氣流速為1 mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；分流比為10∶1。
質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源；電子能量70 eV；傳輸線溫度250 ℃；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度為150 ℃；溶劑延遲1 min；質(zhì)量掃描方式為全掃描；質(zhì)量掃描范圍m/z 40～400。
1.5 數(shù)據(jù)分析
水溶性成分通過HPLC，利用中國藥典委員會推薦的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A 版”進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，將所得的色譜圖進(jìn)行比較，得到可以全面反映多個色譜圖特征的廬山云霧茶對照指紋圖譜，得到共有峰，將其共有峰時間居中的峰作為參照峰，并以參照峰的峰面積為分母，各共有峰的峰面積為分子，求得其相對峰面積。利用SIMCA-P 13.0 版軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析。
揮發(fā)性成分通過GC-MS 檢測得到總離子流圖，根據(jù)NIST MS Search 2.0 質(zhì)譜圖庫檢索結(jié)果，并結(jié)合保留指數(shù)文獻(xiàn)值對廬山云霧茶揮發(fā)性成分進(jìn)行初步篩查鑒定。以樣本揮發(fā)性物質(zhì)的相對峰面積為變量，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P 13.0 版軟件，將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行無監(jiān)督的主成分分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 液相指紋圖譜的方法學(xué)考察
2.1.1 精密度試驗 隨機抽取同一批次的廬山云霧茶樣品，1 d 內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6 次，考察色譜峰的相對保留時間、相對峰面積的一致性。結(jié)果表明，其色譜峰的相對保留時間和峰面積的比值基本沒有變化，各共有峰相對保留時間RSD≦0.52%，相對峰面積RSD≦2.47%，表明儀器精密度良好。
2.1.2 重現(xiàn)性試驗 隨機抽取同一批次的廬山云霧茶樣品，平行制備6 份測試液，比較其相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果表明，各共有峰相對保留時間RSD≦1.02%，相對峰面積RSD≦2.81%，表明該測定具有良好的重現(xiàn)性。
2.1.3 穩(wěn)定性試驗 取同一批次的廬山云霧茶水樣品，分別在制備后的24 h 內(nèi)每隔4 h 進(jìn)樣1 次，比較色譜峰的相對保留時間、相對峰面積。結(jié)果表明，各共有峰相對保留時間RSD≦0.95%，相對峰面積RSD≦1.86%，表明所制備的樣液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.2 廬山云霧茶水溶性成分
2.2.1 HPLC 指紋圖譜的構(gòu)建 將S1-S20 茶葉樣品按1.3.1 節(jié)的方法制備樣液，在1.4.1 節(jié)色譜條件下進(jìn)行測定，得到所有水提茶葉樣本的HPLC圖。經(jīng)過中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)處理，獲得其液相對照指紋圖譜R 見圖1（橫坐標(biāo)為時間，min，縱坐標(biāo)為所獲信號，mV），并建立20 批廬山云霧茶的指紋圖譜，見圖3。將沒食子兒茶素、咖啡因、芹菜素、蘆丁、表兒茶素沒食子酸酯5 個標(biāo)準(zhǔn)品。每個取2 mg 加超純水溶解定容至10 mL棕色容量瓶中，制成單標(biāo)。用0.22 μm 水系濾膜過濾，在1.4.1 節(jié)色譜條件下進(jìn)行測定，確定每個標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間。再將混標(biāo)在相同的條件下進(jìn)行測定，結(jié)果如圖2所示。編號1～5 分別是沒食子兒茶素、咖啡因、芹菜素、蘆丁、表兒茶素沒食子酸酯，這個5 個峰分別對應(yīng)圖1中C15，C20，C21，C32 和C36。
圖1 廬山云霧茶的對照指紋圖譜Fig.1 Reference fingerprint of Lu Mountain Clouds-Mist Tea samples
圖2 5 種混標(biāo)的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of five kinds of mixed standards samples
圖3 20 批廬山云霧茶的液相指紋圖譜Fig.3 HPLC fingerprints of 20 batches of Lu Mountain Clouds-Mist Tea samples
相似度作為中藥指紋圖譜的評價參數(shù)，可以最大限度的避免主觀因素影響，以實現(xiàn)對指紋圖譜整體相似性的客觀評價。對照指紋圖譜R 與20批茶葉樣品相似度進(jìn)行比較，結(jié)果見表1。相似度值越接近1，它們越相似。由表1可知，所有茶葉樣品指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度都在0.93以上，符合指紋圖譜要求，因此可以較全面地反映廬山云霧茶指紋圖譜的相似關(guān)系。同時也表明所測樣品間的組分具有很強的相似性，各組間成分較為一致。
表1 20 批廬山云霧茶液相指紋圖譜間的相似度Table 1 The similarity of fingerprints from 20 batches of Lu Mountain Clouds-Mist Tea samples
表2 廬山云霧茶液相指紋圖譜共有峰的相對峰面積Table 2 The relative peak areas of the HPLC fingerprints of common peaks in Lu Mountain Clouds-Mist Tea samples
（續(xù)表2）
表3 測試茶樣液相指紋圖譜共有峰的相對峰面積Table 3 The relative peak areas of the HPLC fingerprints of common peaks of tested samples
（續(xù)表3）
將茶葉樣本水溶性成分相對峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 軟件，擬合3 個主成分，第1 主成分特征值為8.37，貢獻(xiàn)率41.9%，第2 主成分特征值為4.31，貢獻(xiàn)率為21.6%，累積方差貢獻(xiàn)率為63.5%，第3 主成分特征值為3.64，貢獻(xiàn)率18.2%，累積方差貢獻(xiàn)率為81.7%。3 個主成分已包含絕大多數(shù)信息，可說明數(shù)據(jù)的變化趨勢[11-12]。利用主成分分析可實現(xiàn)對數(shù)據(jù)的降維處理，簡化數(shù)據(jù)，同時保留數(shù)據(jù)最重要的方面，方便進(jìn)行樣品之間相似性和差異性的分析。坐標(biāo)的絕對值越大，對該成分的貢獻(xiàn)越大。不同茶葉樣本之間的距離表示其差異的大小。以第1 主成分為x 軸，第2 主成分為y 軸得到廬山云霧茶水溶性成分主成分分析圖，見圖4。
圖4 廬山云霧茶樣本水溶性成分的主成分二維得分圖（a）和二維載荷圖（b）Fig.4 PCA 2D score plots （a） and loading plots （b） of Lu Mountain Clouds-Mist Tea samples on water soluble active components
由圖4可以看出，大部分廬山云霧茶樣本都匯聚在y 軸的右邊，而S18、S19 和S20 茶葉樣本遠(yuǎn)離匯聚區(qū)域，零散分布在y 軸的左邊。其中圖4a中樣本S19 和載荷圖中化合物芹菜素（C21）、C24、C33 位置類似，說明這些含量呈正相關(guān)，結(jié)合表2、表3可知，在S19 樣本中芹菜素（30.66%）、C24（1.79%）和C33（0.56%）3 個化合物含量比其它樣本都要高很多。表明這些化合物是區(qū)分S19和真正廬山云霧茶的關(guān)鍵變量。圖4a 中樣本S18、S20 和 圖4b 中 化 合 物C3、C16、C17、咖 啡 因（C20）、C22、C28、C30、蘆?。–32）、C34 位置類似。這些化合物遠(yuǎn)離y 軸，說明這些含量呈正相關(guān)，S18 較S20 距離y 軸更遠(yuǎn)，表示這些化合物含量更高。結(jié)合表2、表3可知，S18 和S20 中這些化合物的含量要遠(yuǎn)高于其它廬山云霧茶樣本。如C16：S18（5.20%）>S20（3.53%）>其它樣本；C17：S18（1.85%）>S20（1.15%）>其它樣本；咖啡因：S18（32.51%）>S20（27.32%）>其它樣本；蘆丁：S18（3.94%）>S20 （3.12%）>其它樣本；C34：S18（7.01%）>S20（5.25%）>其它樣本。表明這些化合物是區(qū)分S18、S20 和真正廬山云霧茶樣本的關(guān)鍵變量。而C10、C11、C12、C14、表沒食子兒茶素（C15）、表兒茶素沒食子酸酯（C36）等化合物與S18、S19、S20 位置相反，說明這些物質(zhì)的含量呈負(fù)相關(guān)，結(jié)合表2、表3可知，S18、S19、S20 中這些化合物的含量要遠(yuǎn)低于其它樣本，如表沒食子兒茶素含量：其它樣本>S20（3.81%>S19（3.55%）>S18 （1.24%）；表兒茶素沒食子酸酯：其它樣本>S19（1.93%）>S20（1.55%）>S18（0.90%）。
綜合而言，8 個測試茶葉樣本中S13、S14、S15、S16、S17 為廬山云霧茶樣本，S18、S19、S20 為非廬山云霧茶樣本。HPLC 技術(shù)結(jié)合PCA 結(jié)果表明，所有樣本均能正確識別真?zhèn)?，判別率為100%。
2.3 廬山云霧茶揮發(fā)性成分
2.3.1 GC-MS 指紋圖譜的構(gòu)建 將S1-S20 茶葉樣品按1.3.2 節(jié)方法制備樣液，在1.4.2 節(jié)色譜條件下進(jìn)行測定，得到所有茶葉樣本的GC-MS 總離子流圖。獲得其典型的廬山云霧茶揮發(fā)性成分指紋圖譜，見圖5a。并建立20 批廬山云霧茶的揮發(fā)性成分指紋圖譜，見圖5b。
圖5 廬山云霧茶揮發(fā)性成分指紋圖譜Fig.5 Fingerprint of Lu Mountain Clouds-Mist Tea samples on volatile components
由圖3、圖5b 中可以看出，廬山云霧茶樣品的GC-MS 指紋圖譜的差異性比HPLC 指紋圖譜大得多，揮發(fā)性成分峰的個數(shù)較水溶性成分更多，為方便統(tǒng)計分析，選擇了38 種含量較高的揮發(fā)性物質(zhì)作為研究對象。保留指數(shù)主要指物質(zhì)在固定液上的保留值行為，與色譜分析中的很多參數(shù)和條件無關(guān)，故結(jié)合文獻(xiàn)中的保留指數(shù)，這些揮發(fā)性成分可以得到初步鑒定。表4為廬山云霧茶揮發(fā)性成分定性分析結(jié)果。由表5、表6可知，各成分的色譜峰的相對峰面積有較大差異，說明其揮發(fā)性物質(zhì)成分差別較大，這可能是由于廬山云霧茶等級、產(chǎn)地、采摘時間等條件影響導(dǎo)致。
2.3.2 主成分分析 將茶葉樣本揮發(fā)性成分相對峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 軟件，擬合3 個主成分，第1 主成分特征值為8.62，貢獻(xiàn)率43.1%，第2 主成分特征值為4.98，貢獻(xiàn)率為24.9%，累積方差貢獻(xiàn)率為68.0%，第3 主成分特征值為3.15，貢獻(xiàn)率15.8%，前3 個成分的累計方差貢獻(xiàn)率已經(jīng)達(dá)到83.8%。以第1 主成分為x 軸，第2 主成分為y 軸得到廬山云霧茶樣本揮發(fā)性成分主成分分析圖，見圖6。
不同的變量對區(qū)分模型的建立和貢獻(xiàn)是不一樣的。從理論上講，越是遠(yuǎn)離中心點的變量，對得分圖的貢獻(xiàn)也就越大，而這種物質(zhì)正是不同類型樣本中的差異成分[33]。由圖6a 得分圖可以看出，a區(qū)域分布在x 軸的上部分，b 區(qū)域分布在x 軸的下部分，c 區(qū)域分布在y 軸的右邊，已知3 個產(chǎn)地的廬山云霧茶能夠相對分開，區(qū)域各產(chǎn)地樣本均處于相對獨立的空間。而通過液相色譜得到的數(shù)據(jù)無法做到這樣的區(qū)分。圖6a 得分圖表示不同茶葉樣品揮發(fā)性成分含量的相似性和差異性，圖6b 載荷圖則能找出引起這些樣品差異的關(guān)鍵變量。結(jié)
合表5、表6可知，載荷圖中萘（C18）、3-甲基十一烷（C19）、十二烷（C22）、α-柏木烯（C29）、石竹烯（C30）、雪松醇（C36）等揮發(fā)性成分與a 區(qū)域（S1、S2、S3、S4、S5）位置相似，說明這些化合物含量較高，是區(qū)分a 區(qū)域的關(guān)鍵變量。如化合物3-甲基十一烷：S1（0.50%）>S2（0.40%）> S5（0.35%）>S3（0.34%）>S4（0.27%）>S11（0.20%）>S12（0.19%）>S6（0.14%）>S10（0.11%）>S9（0.06%）>S8（0.01%）=S7（0.01%）。載荷圖中己醛（C2）、吲哚（C24）、十四烷（C28）、α-衣蘭油烯（C32）、十六烷（C37）等揮發(fā)性成分與b 區(qū)域（S6、S7、S8、S9）位置相似，這些化合物含量高，是區(qū)分b 區(qū)域的關(guān)鍵變量。如化合物α-衣蘭油烯：S6（3.05%）> S9（2.26%）>S8（1.69%）>S7（1.55%）>S1（0.27%）>S5（0.26%）>S2（0.24%）=S4（0.24%）>S10（0.23%）>S3（0.16%）>S12（0.15%）>S11（0.11%）?；衔镘岳蛲–27）遠(yuǎn)離y 軸，與c區(qū)域（S10、S11、S12）位置類似，表明含量較a、b 區(qū)域高：S11（2.11%）> S10（2.01%）>S12（1.53%）>S4（1.48%）>S6（1.35%）>S5（1.10%）>S9（1.08%）>S2（0.91%）>S7（0.64%）=S8（0.64%）>S1（0.55%）>S3（0.35%）。由圖6a 可以看出，S18、S19、S20 茶葉樣本遠(yuǎn)離廬山云霧茶樣品范圍，特別是S18 和S20 茶葉樣本距離其它樣本更遠(yuǎn)。圖6b 中的1-辛烯-3-醇（C8）、2-正戊基呋喃（C9）、馬鞭草烯酮（C21）、β-紫羅酮（C31）、δ-畢澄茄烯（C34）等化合物與S18、S19 和S20 位置類似，含量呈正相關(guān)，是區(qū)別廬山云霧茶真?zhèn)蔚年P(guān)鍵變量。如馬鞭草烯酮：S18（2.88%）> S20（2.83%）> S19（1.09%）> 其它樣品；如β-紫羅酮：S18（8.96%）> S20（6.55%）>S19（5.16%）>其它樣品。
表4 廬山云霧茶揮發(fā)性成分定性分析結(jié)果Table 4 Qualitative analysis of volatile components in Lu Mountain Clouds-Mist Tea samples
表5 廬山云霧茶揮發(fā)性成分相對峰面積Table 5 The relative peak areas of Lu Mountain Clouds-Mist Tea samples on volatile components
表6 測試茶樣揮發(fā)性成分相對峰面積Table 6 The relative peak areas of tested tea samples on volatile components
綜合而言，8 個測試茶葉樣本中S13、S14、S15、S16、S17 為廬山云霧茶樣本，S18、S19、S20 為非廬山云霧茶樣本。利用GC-MS 技術(shù)結(jié)合PCA均能正確識別真?zhèn)?，判別率為100%。
圖6 廬山云霧茶樣本揮發(fā)性成分的主成分二維得分圖（a）和二維載荷圖（b）Fig.6 PCA 2D score plots （a） and 2D loading plots （b） of Lu Mountain Clouds-Mist Tea samples on volatile components
3 結(jié)論
本試驗采用HPLC 技術(shù)檢測廬山云霧茶水溶性成分，并得到相應(yīng)的指紋圖譜，通過方法學(xué)考察和相似度計算，說明建立的指紋圖譜可以較為全面的反映廬山云霧茶的特征，同時利用主成分分析得到前3 個主成分累積貢獻(xiàn)率分別為81.7%，其中得分圖可以較好的識別廬山云霧茶的真?zhèn)?，判別率達(dá)100%。采用GC-MS 技術(shù)檢測廬山云霧茶揮發(fā)性成分，38 個揮發(fā)性成分得到初步鑒定。將揮發(fā)性成分相對峰面積進(jìn)行主成分分析，前3個主成分累計貢獻(xiàn)率為83.8%，其中得分圖較精準(zhǔn)識別廬山云霧茶的真?zhèn)?，判別率達(dá)100%。結(jié)果表明，利用色譜質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合主成分分析可以較為精準(zhǔn)的識別廬山云霧茶的真?zhèn)?。今后可以嘗試如LC-MS[34]、近紅外光譜法[35]等檢測技術(shù)，以期為廬山云霧茶產(chǎn)地、品種、等級或香型的識別方面，提供一種簡便快速的方法。
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劉 曄 徐春暉 王遠(yuǎn)興
（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室 南昌330047）
“匡廬奇秀甲天下，云霧醇香益壽年”的廬山云霧茶宛若碧玉，味似龍井而更醇香，色如沱茶卻更清淡，是綠茶中的珍品[1]。廬山云霧茶保護(hù)區(qū)范圍大，茶場分散，市場規(guī)范難度大，大量非原產(chǎn)地的廬山云霧茶以低廉的價格擾亂市場，真正產(chǎn)自保護(hù)區(qū)范圍內(nèi)的廬山云霧茶得不到有效保護(hù)，這對廬山云霧茶的銷售價格及市場聲譽均有較大影響。
指紋圖譜可以鑒別真實性，評價質(zhì)量一致性和產(chǎn)品穩(wěn)定性，具有整體性和模糊性的特點，能夠較全面地反映多種化合物的內(nèi)在作用關(guān)系，通過與模式識別技術(shù)相結(jié)合，可有效提取有效信息[2]。紅外光譜法、HPLC、GC、GC-MS 和液-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS）等方法均能生成指紋圖譜[3-5]。
HPLC 技術(shù)分離性能高，穩(wěn)定性好，可有效分析檢測食品中多種化學(xué)成分，己被廣泛應(yīng)用到食品指紋圖譜構(gòu)建的研究中。它能夠結(jié)合多種檢測器，比如紫外檢測器、二極管陣列檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器、質(zhì)譜檢測器等。Xie 等[6]釆用LC-MS技術(shù)建立了不同基因類型和不同部位的絞股藍(lán)樣品的黃酮類化合物指紋圖譜，PCA 能夠取得較好的分類結(jié)果。
GC 或GC-MS 技術(shù)具有高靈敏度和高選擇性，可以很好的分離、鑒定和定性化合物的特性[7]。李萬春等[8]采用衍生化GC-MS 方法，對福建省安溪縣境內(nèi)8 個鄉(xiāng)鎮(zhèn)的鐵觀音及3 個烏龍茶品種通過化學(xué)計量學(xué)對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、建模，確定茶葉的品種及產(chǎn)地，PCA 結(jié)果表明安溪縣境內(nèi)不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)的鐵觀音表型有明顯差異，相鄰鄉(xiāng)鎮(zhèn)的茶葉代謝表型相似，為辨別安溪鐵觀音真?zhèn)蔚於嘶A(chǔ)。王麗鴛等[9]利用多元化學(xué)指紋圖譜方法對杭州、麗水和新昌3 個地區(qū)9 類扁形綠茶產(chǎn)品進(jìn)行判別分析，結(jié)果表明，同一品種不同產(chǎn)地或同一產(chǎn)地不同品種綠茶樣本指紋圖譜間存在顯著差異。
本文將廬山云霧茶水溶性成分和揮發(fā)性成分作為研究對象，分別采用HPLC 和GC-MS 分析技術(shù)對廬山云霧茶和測試樣本的成分進(jìn)行探討，獲得廬山云霧茶的指紋圖譜數(shù)據(jù)并得到各成分的相對峰面積，然后利用PCA 對相對峰面積進(jìn)行處理，研究結(jié)果可對廬山云霧茶的真?zhèn)巫R別提供一定參考。
1 試驗部分
1.1 樣品與試劑
供試廬山云霧茶，通遠(yuǎn)鎮(zhèn)（S1-S5）廬山茶科所茶場；賽陽鎮(zhèn)（S6-S9），廬山露語茶業(yè)有限公司；星子縣（S10-S12），星子縣廬山七尖云霧茶有限公司，以及廬山市本地、市面上采買的8 個茶葉樣本（S13-S20）。供試品均采于2016年5月份，樣品放置于4 ℃冰箱中保存。
甲醇（色譜純），德國Merck 公司；甲酸（色譜純），ROE 公司；水，屈臣氏蒸餾水；表沒食子兒茶素（HPLC≧94%）、咖啡因（HPLC≧99%）、芹菜素（HPLC≧96%）、蘆?。℉PLC≧92%）、表兒茶素沒食子酸酯（HPLC≧95%），中國食品藥品鑒定研究院。
1.2 儀器與設(shè)備
Agilent1290 超高相液相色譜儀（四元泵、在線脫氣機、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD 檢測器）、Eclipse Plus-C 18 column （4.6 mm×100 mm，3.5 μm）、Agilent GC- QQQ 7890/7000A 三重串聯(lián)四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀、HP-5 MS 石英彈性毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），美國Agilent 公司；萃取纖維頭50/30 μm DVB/ CAR/ PDMS，美國Supelco 公司；AL104 電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；KQ5200E 型超聲波清洗器，機械昆山市超聲儀器有限公司；TDL-5-A 型離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠。
1.3 樣品預(yù)處理
1.3.1 水溶性成分的提取 將茶葉粉碎過篩，精確稱取1.00 g 粉末并加入50 mL 超純水，超聲10 min，80 ℃水浴30 min，置于離心機中5 000 r/min離心15 min，將上清液用0.22 μm 水系濾膜過濾，得到茶葉水溶性成分。
1.3.2 揮發(fā)性成分的提取 將茶葉粉碎過篩，精確稱取2.00 g 粉末于20 mL 頂空萃取瓶中，立即用含隔墊蓋子密封；將頂空瓶置于80 ℃水浴鍋中水浴平衡30 min，每隔10 min 晃動瓶身；再將固相萃取頭插入頂空萃取瓶中，萃取吸附30 min[10]。萃取結(jié)束后將萃取頭放入GC-MS 進(jìn)樣口中，250℃解析5 min，以檢測茶葉揮發(fā)性成分。
1.4 色譜和質(zhì)譜條件
1.4.1 HPLC 條件 流動相：以0.1%甲酸水溶液為流動相A 和甲醇為流動相B 進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫：0～15 min：5%～20%（B）；15～35 min：20%～45%（B）；35～40 min：45%～5%（B）。二級管陣列檢測器（DAD）波長：254 nm；柱溫：30 ℃；流速：0.6 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL。
1.4.2 GC-MS 條件 色譜條件：色譜柱：HP-5 MS 石英毛細(xì)柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：起始柱溫50 ℃，保持5 min，以5 ℃/min 升至80 ℃，然后以2 ℃/min 升至140 ℃，最后以5 ℃/min 升至210 ℃保持5 min；載氣為高純氦氣（純度≥99.999%）；載氣流速為1 mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；分流比為10∶1。
質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源；電子能量70 eV；傳輸線溫度250 ℃；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度為150 ℃；溶劑延遲1 min；質(zhì)量掃描方式為全掃描；質(zhì)量掃描范圍m/z 40～400。
1.5 數(shù)據(jù)分析
水溶性成分通過HPLC，利用中國藥典委員會推薦的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A 版”進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，將所得的色譜圖進(jìn)行比較，得到可以全面反映多個色譜圖特征的廬山云霧茶對照指紋圖譜，得到共有峰，將其共有峰時間居中的峰作為參照峰，并以參照峰的峰面積為分母，各共有峰的峰面積為分子，求得其相對峰面積。利用SIMCA-P 13.0 版軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析。
揮發(fā)性成分通過GC-MS 檢測得到總離子流圖，根據(jù)NIST MS Search 2.0 質(zhì)譜圖庫檢索結(jié)果，并結(jié)合保留指數(shù)文獻(xiàn)值對廬山云霧茶揮發(fā)性成分進(jìn)行初步篩查鑒定。以樣本揮發(fā)性物質(zhì)的相對峰面積為變量，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P 13.0 版軟件，將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行無監(jiān)督的主成分分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 液相指紋圖譜的方法學(xué)考察
2.1.1 精密度試驗 隨機抽取同一批次的廬山云霧茶樣品，1 d 內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6 次，考察色譜峰的相對保留時間、相對峰面積的一致性。結(jié)果表明，其色譜峰的相對保留時間和峰面積的比值基本沒有變化，各共有峰相對保留時間RSD≦0.52%，相對峰面積RSD≦2.47%，表明儀器精密度良好。
2.1.2 重現(xiàn)性試驗 隨機抽取同一批次的廬山云霧茶樣品，平行制備6 份測試液，比較其相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果表明，各共有峰相對保留時間RSD≦1.02%，相對峰面積RSD≦2.81%，表明該測定具有良好的重現(xiàn)性。
2.1.3 穩(wěn)定性試驗 取同一批次的廬山云霧茶水樣品，分別在制備后的24 h 內(nèi)每隔4 h 進(jìn)樣1 次，比較色譜峰的相對保留時間、相對峰面積。結(jié)果表明，各共有峰相對保留時間RSD≦0.95%，相對峰面積RSD≦1.86%，表明所制備的樣液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.2 廬山云霧茶水溶性成分
2.2.1 HPLC 指紋圖譜的構(gòu)建 將S1-S20 茶葉樣品按1.3.1 節(jié)的方法制備樣液，在1.4.1 節(jié)色譜條件下進(jìn)行測定，得到所有水提茶葉樣本的HPLC圖。經(jīng)過中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)處理，獲得其液相對照指紋圖譜R 見圖1（橫坐標(biāo)為時間，min，縱坐標(biāo)為所獲信號，mV），并建立20 批廬山云霧茶的指紋圖譜，見圖3。將沒食子兒茶素、咖啡因、芹菜素、蘆丁、表兒茶素沒食子酸酯5 個標(biāo)準(zhǔn)品。每個取2 mg 加超純水溶解定容至10 mL棕色容量瓶中，制成單標(biāo)。用0.22 μm 水系濾膜過濾，在1.4.1 節(jié)色譜條件下進(jìn)行測定，確定每個標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間。再將混標(biāo)在相同的條件下進(jìn)行測定，結(jié)果如圖2所示。編號1～5 分別是沒食子兒茶素、咖啡因、芹菜素、蘆丁、表兒茶素沒食子酸酯，這個5 個峰分別對應(yīng)圖1中C15，C20，C21，C32 和C36。
圖1 廬山云霧茶的對照指紋圖譜Fig.1 Reference fingerprint of Lu Mountain Clouds-Mist Tea samples
圖2 5 種混標(biāo)的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of five kinds of mixed standards samples
圖3 20 批廬山云霧茶的液相指紋圖譜Fig.3 HPLC fingerprints of 20 batches of Lu Mountain Clouds-Mist Tea samples
相似度作為中藥指紋圖譜的評價參數(shù)，可以最大限度的避免主觀因素影響，以實現(xiàn)對指紋圖譜整體相似性的客觀評價。對照指紋圖譜R 與20批茶葉樣品相似度進(jìn)行比較，結(jié)果見表1。相似度值越接近1，它們越相似。由表1可知，所有茶葉樣品指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度都在0.93以上，符合指紋圖譜要求，因此可以較全面地反映廬山云霧茶指紋圖譜的相似關(guān)系。同時也表明所測樣品間的組分具有很強的相似性，各組間成分較為一致。
表1 20 批廬山云霧茶液相指紋圖譜間的相似度Table 1 The similarity of fingerprints from 20 batches of Lu Mountain Clouds-Mist Tea samples
表2 廬山云霧茶液相指紋圖譜共有峰的相對峰面積Table 2 The relative peak areas of the HPLC fingerprints of common peaks in Lu Mountain Clouds-Mist Tea samples
（續(xù)表2）
表3 測試茶樣液相指紋圖譜共有峰的相對峰面積Table 3 The relative peak areas of the HPLC fingerprints of common peaks of tested samples
（續(xù)表3）
將茶葉樣本水溶性成分相對峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 軟件，擬合3 個主成分，第1 主成分特征值為8.37，貢獻(xiàn)率41.9%，第2 主成分特征值為4.31，貢獻(xiàn)率為21.6%，累積方差貢獻(xiàn)率為63.5%，第3 主成分特征值為3.64，貢獻(xiàn)率18.2%，累積方差貢獻(xiàn)率為81.7%。3 個主成分已包含絕大多數(shù)信息，可說明數(shù)據(jù)的變化趨勢[11-12]。利用主成分分析可實現(xiàn)對數(shù)據(jù)的降維處理，簡化數(shù)據(jù)，同時保留數(shù)據(jù)最重要的方面，方便進(jìn)行樣品之間相似性和差異性的分析。坐標(biāo)的絕對值越大，對該成分的貢獻(xiàn)越大。不同茶葉樣本之間的距離表示其差異的大小。以第1 主成分為x 軸，第2 主成分為y 軸得到廬山云霧茶水溶性成分主成分分析圖，見圖4。
圖4 廬山云霧茶樣本水溶性成分的主成分二維得分圖（a）和二維載荷圖（b）Fig.4 PCA 2D score plots （a） and loading plots （b） of Lu Mountain Clouds-Mist Tea samples on water soluble active components
由圖4可以看出，大部分廬山云霧茶樣本都匯聚在y 軸的右邊，而S18、S19 和S20 茶葉樣本遠(yuǎn)離匯聚區(qū)域，零散分布在y 軸的左邊。其中圖4a中樣本S19 和載荷圖中化合物芹菜素（C21）、C24、C33 位置類似，說明這些含量呈正相關(guān)，結(jié)合表2、表3可知，在S19 樣本中芹菜素（30.66%）、C24（1.79%）和C33（0.56%）3 個化合物含量比其它樣本都要高很多。表明這些化合物是區(qū)分S19和真正廬山云霧茶的關(guān)鍵變量。圖4a 中樣本S18、S20 和 圖4b 中 化 合 物C3、C16、C17、咖 啡 因（C20）、C22、C28、C30、蘆?。–32）、C34 位置類似。這些化合物遠(yuǎn)離y 軸，說明這些含量呈正相關(guān)，S18 較S20 距離y 軸更遠(yuǎn)，表示這些化合物含量更高。結(jié)合表2、表3可知，S18 和S20 中這些化合物的含量要遠(yuǎn)高于其它廬山云霧茶樣本。如C16：S18（5.20%）>S20（3.53%）>其它樣本；C17：S18（1.85%）>S20（1.15%）>其它樣本；咖啡因：S18（32.51%）>S20（27.32%）>其它樣本；蘆丁：S18（3.94%）>S20 （3.12%）>其它樣本；C34：S18（7.01%）>S20（5.25%）>其它樣本。表明這些化合物是區(qū)分S18、S20 和真正廬山云霧茶樣本的關(guān)鍵變量。而C10、C11、C12、C14、表沒食子兒茶素（C15）、表兒茶素沒食子酸酯（C36）等化合物與S18、S19、S20 位置相反，說明這些物質(zhì)的含量呈負(fù)相關(guān)，結(jié)合表2、表3可知，S18、S19、S20 中這些化合物的含量要遠(yuǎn)低于其它樣本，如表沒食子兒茶素含量：其它樣本>S20（3.81%>S19（3.55%）>S18 （1.24%）；表兒茶素沒食子酸酯：其它樣本>S19（1.93%）>S20（1.55%）>S18（0.90%）。
綜合而言，8 個測試茶葉樣本中S13、S14、S15、S16、S17 為廬山云霧茶樣本，S18、S19、S20 為非廬山云霧茶樣本。HPLC 技術(shù)結(jié)合PCA 結(jié)果表明，所有樣本均能正確識別真?zhèn)?，判別率為100%。
2.3 廬山云霧茶揮發(fā)性成分
2.3.1 GC-MS 指紋圖譜的構(gòu)建 將S1-S20 茶葉樣品按1.3.2 節(jié)方法制備樣液，在1.4.2 節(jié)色譜條件下進(jìn)行測定，得到所有茶葉樣本的GC-MS 總離子流圖。獲得其典型的廬山云霧茶揮發(fā)性成分指紋圖譜，見圖5a。并建立20 批廬山云霧茶的揮發(fā)性成分指紋圖譜，見圖5b。
圖5 廬山云霧茶揮發(fā)性成分指紋圖譜Fig.5 Fingerprint of Lu Mountain Clouds-Mist Tea samples on volatile components
由圖3、圖5b 中可以看出，廬山云霧茶樣品的GC-MS 指紋圖譜的差異性比HPLC 指紋圖譜大得多，揮發(fā)性成分峰的個數(shù)較水溶性成分更多，為方便統(tǒng)計分析，選擇了38 種含量較高的揮發(fā)性物質(zhì)作為研究對象。保留指數(shù)主要指物質(zhì)在固定液上的保留值行為，與色譜分析中的很多參數(shù)和條件無關(guān)，故結(jié)合文獻(xiàn)中的保留指數(shù)，這些揮發(fā)性成分可以得到初步鑒定。表4為廬山云霧茶揮發(fā)性成分定性分析結(jié)果。由表5、表6可知，各成分的色譜峰的相對峰面積有較大差異，說明其揮發(fā)性物質(zhì)成分差別較大，這可能是由于廬山云霧茶等級、產(chǎn)地、采摘時間等條件影響導(dǎo)致。
2.3.2 主成分分析 將茶葉樣本揮發(fā)性成分相對峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 軟件，擬合3 個主成分，第1 主成分特征值為8.62，貢獻(xiàn)率43.1%，第2 主成分特征值為4.98，貢獻(xiàn)率為24.9%，累積方差貢獻(xiàn)率為68.0%，第3 主成分特征值為3.15，貢獻(xiàn)率15.8%，前3 個成分的累計方差貢獻(xiàn)率已經(jīng)達(dá)到83.8%。以第1 主成分為x 軸，第2 主成分為y 軸得到廬山云霧茶樣本揮發(fā)性成分主成分分析圖，見圖6。
不同的變量對區(qū)分模型的建立和貢獻(xiàn)是不一樣的。從理論上講，越是遠(yuǎn)離中心點的變量，對得分圖的貢獻(xiàn)也就越大，而這種物質(zhì)正是不同類型樣本中的差異成分[33]。由圖6a 得分圖可以看出，a區(qū)域分布在x 軸的上部分，b 區(qū)域分布在x 軸的下部分，c 區(qū)域分布在y 軸的右邊，已知3 個產(chǎn)地的廬山云霧茶能夠相對分開，區(qū)域各產(chǎn)地樣本均處于相對獨立的空間。而通過液相色譜得到的數(shù)據(jù)無法做到這樣的區(qū)分。圖6a 得分圖表示不同茶葉樣品揮發(fā)性成分含量的相似性和差異性，圖6b 載荷圖則能找出引起這些樣品差異的關(guān)鍵變量。結(jié)
合表5、表6可知，載荷圖中萘（C18）、3-甲基十一烷（C19）、十二烷（C22）、α-柏木烯（C29）、石竹烯（C30）、雪松醇（C36）等揮發(fā)性成分與a 區(qū)域（S1、S2、S3、S4、S5）位置相似，說明這些化合物含量較高，是區(qū)分a 區(qū)域的關(guān)鍵變量。如化合物3-甲基十一烷：S1（0.50%）>S2（0.40%）> S5（0.35%）>S3（0.34%）>S4（0.27%）>S11（0.20%）>S12（0.19%）>S6（0.14%）>S10（0.11%）>S9（0.06%）>S8（0.01%）=S7（0.01%）。載荷圖中己醛（C2）、吲哚（C24）、十四烷（C28）、α-衣蘭油烯（C32）、十六烷（C37）等揮發(fā)性成分與b 區(qū)域（S6、S7、S8、S9）位置相似，這些化合物含量高，是區(qū)分b 區(qū)域的關(guān)鍵變量。如化合物α-衣蘭油烯：S6（3.05%）> S9（2.26%）>S8（1.69%）>S7（1.55%）>S1（0.27%）>S5（0.26%）>S2（0.24%）=S4（0.24%）>S10（0.23%）>S3（0.16%）>S12（0.15%）>S11（0.11%）?；衔镘岳蛲–27）遠(yuǎn)離y 軸，與c區(qū)域（S10、S11、S12）位置類似，表明含量較a、b 區(qū)域高：S11（2.11%）> S10（2.01%）>S12（1.53%）>S4（1.48%）>S6（1.35%）>S5（1.10%）>S9（1.08%）>S2（0.91%）>S7（0.64%）=S8（0.64%）>S1（0.55%）>S3（0.35%）。由圖6a 可以看出，S18、S19、S20 茶葉樣本遠(yuǎn)離廬山云霧茶樣品范圍，特別是S18 和S20 茶葉樣本距離其它樣本更遠(yuǎn)。圖6b 中的1-辛烯-3-醇（C8）、2-正戊基呋喃（C9）、馬鞭草烯酮（C21）、β-紫羅酮（C31）、δ-畢澄茄烯（C34）等化合物與S18、S19 和S20 位置類似，含量呈正相關(guān)，是區(qū)別廬山云霧茶真?zhèn)蔚年P(guān)鍵變量。如馬鞭草烯酮：S18（2.88%）> S20（2.83%）> S19（1.09%）> 其它樣品；如β-紫羅酮：S18（8.96%）> S20（6.55%）>S19（5.16%）>其它樣品。
表4 廬山云霧茶揮發(fā)性成分定性分析結(jié)果Table 4 Qualitative analysis of volatile components in Lu Mountain Clouds-Mist Tea samples
表5 廬山云霧茶揮發(fā)性成分相對峰面積Table 5 The relative peak areas of Lu Mountain Clouds-Mist Tea samples on volatile components
表6 測試茶樣揮發(fā)性成分相對峰面積Table 6 The relative peak areas of tested tea samples on volatile components
綜合而言，8 個測試茶葉樣本中S13、S14、S15、S16、S17 為廬山云霧茶樣本，S18、S19、S20 為非廬山云霧茶樣本。利用GC-MS 技術(shù)結(jié)合PCA均能正確識別真?zhèn)?，判別率為100%。
圖6 廬山云霧茶樣本揮發(fā)性成分的主成分二維得分圖（a）和二維載荷圖（b）Fig.6 PCA 2D score plots （a） and 2D loading plots （b） of Lu Mountain Clouds-Mist Tea samples on volatile components
3 結(jié)論
本試驗采用HPLC 技術(shù)檢測廬山云霧茶水溶性成分，并得到相應(yīng)的指紋圖譜，通過方法學(xué)考察和相似度計算，說明建立的指紋圖譜可以較為全面的反映廬山云霧茶的特征，同時利用主成分分析得到前3 個主成分累積貢獻(xiàn)率分別為81.7%，其中得分圖可以較好的識別廬山云霧茶的真?zhèn)?，判別率達(dá)100%。采用GC-MS 技術(shù)檢測廬山云霧茶揮發(fā)性成分，38 個揮發(fā)性成分得到初步鑒定。將揮發(fā)性成分相對峰面積進(jìn)行主成分分析，前3個主成分累計貢獻(xiàn)率為83.8%，其中得分圖較精準(zhǔn)識別廬山云霧茶的真?zhèn)?，判別率達(dá)100%。結(jié)果表明，利用色譜質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合主成分分析可以較為精準(zhǔn)的識別廬山云霧茶的真?zhèn)?。今后可以嘗試如LC-MS[34]、近紅外光譜法[35]等檢測技術(shù)，以期為廬山云霧茶產(chǎn)地、品種、等級或香型的識別方面，提供一種簡便快速的方法。
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