高白鮭肌肉蛋白質(zhì)組雙向電泳技術(shù)體系的優(yōu)化

于亞文 朱新榮 張 建

（石河子大學(xué)食品學(xué)院 新疆石河子832000）

蛋白質(zhì)組（Proteome）于1994年首次提出，定義為“由基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)”[1]。近年來，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)展迅速，已成為生命科學(xué)研究中的重要領(lǐng)域。而雙向電泳 （Two-dimensional electrophoresis，2-DE） 技術(shù)是目前蛋白質(zhì)組研究技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)方法[2]。雙向電泳的分辨率較高，近年來，在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)和微生物學(xué)等研究領(lǐng)域廣泛運(yùn)用[3]。目前，國內(nèi)對于雙向電泳主要用于分離蛋白質(zhì)以及后續(xù)蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。徐永杰等[4]研究了豬肌肉組織雙向電泳分離條件的建立及常見問題；梁光明等[5]研究凡納濱對蝦肌肉蛋白質(zhì)雙向電泳分離技術(shù)的建立；王任等[6]建立大黃魚肌肉組織雙向凝膠電泳方法；丁勤學(xué)等[7]就雙向電泳技術(shù)中樣品上樣方式及水化上樣等做出討論。目前關(guān)于高白鮭的研究，主要集中在營養(yǎng)養(yǎng)殖、貯藏保鮮等方面，基于雙向凝膠電泳技術(shù)的高白鮭肌肉組織蛋白尚未見報(bào)道。

高白鮭屬鮭科、白鮭屬，為冷水性魚類。營養(yǎng)全面，肌肉蛋白質(zhì)含量平均為18.83%，氨基酸含量平均為17.48%，其中必需氨基酸含量為9.16%，占氨基酸總量的52.40%[8]，并且肉質(zhì)鮮美，備受消費(fèi)者喜愛，具有重要的經(jīng)濟(jì)和營養(yǎng)價值。同時由于其營養(yǎng)價值豐富，水分含量較高，易腐敗變質(zhì)。如貯藏不當(dāng)，魚肉的蛋白質(zhì)、氨基酸等會分解變質(zhì)，對魚肉品質(zhì)產(chǎn)生不利影響[9]。本研究以高白鮭為試驗(yàn)材料，通過對蛋白質(zhì)樣品的制備方法、上樣量、IPG 膠條的pH 范圍、等電聚焦程序、助凝劑劑量、SDS-PAGE 凝膠濃度及染色方法等因素的比較，優(yōu)化雙向電泳條件，建立適用于高白鮭肌肉蛋白質(zhì)的雙向電泳體系，獲得分辨率高、橫紋少等較理想的二維電泳圖譜，為下一步開展高白鮭蛋白質(zhì)組學(xué)的研究奠定基礎(chǔ)，也為其它魚類肌肉蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

鮮活的高白鮭（1 000±50）g，新疆天潤賽里木湖漁業(yè)開發(fā)有限公司。真空包裝，于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑與設(shè)備

IPG 干膠條 （17 cm）、尿素 （Urea）、硫脲（Thiourea）、二硫蘇糖醇（DTT）、3-[3-（膽酰氨丙基） 二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽（CHAPS）、Ampholine（pH 3～10 或pH 5～8）、碘乙酰胺（IAA）、十二烷基磺酸鈉（SDS）、溴酚藍(lán)、低熔點(diǎn)瓊脂糖、過硫酸銨（AP）、四甲基乙二胺（TEMED）、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、Tris 堿、甘氨酸、牛血清白蛋白（BSA）等試劑，北京博奧拓達(dá)科技有限公司；其它試劑均使用國產(chǎn)分析純級試劑。

DYY-16D 型 電 泳 儀、WD-9412A 恒 溫 循 環(huán)器、DYC-DD2 等電聚焦電泳槽、DYC-SCZ8 垂直電泳槽、DYCX-C 型凝膠成像系統(tǒng)，北京六一生物科技有限公司；臺式冷凍高速離心機(jī)、超低溫冰箱，美國Thermo Scientific 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蛋白樣品的制備及定量 液氮研磨法：取高白鮭背脊部肌肉3～5 g，置于液氮中冰凍，研磨后精確稱取0.05 mg 分裝于1.5 mL EP 管中，添加500 μL 的 裂 解 液 （8 mol/L Urea，4%CHAPS，65 mmol/L DTT，5%Ampholine，0.001%溴酚藍(lán)） 裂解2 h，然后在低溫（4 ℃）離心機(jī)中12 000 r/min 離心1 h，棄去上層懸浮及下層沉淀，取中間澄清液，即為提取的高白鮭組織蛋白樣品。

丙酮沉淀法：取高白鮭背脊部肌肉2 g，加入6 mL 抽提液（3.00 g Urea，1.55 g 硫脲，15 μL β-巰基乙醇，用0.01 mol 磷酸鹽緩沖液定容至10 mL）勻漿，于4 ℃冰箱放置14 h 后取出，以10 000 r/min，離心20 min，取上清液，向其加入10 倍體積的-20 ℃預(yù)冷的丙酮，于-20 ℃冰箱中靜置2 h 后，10 000 r/min，離心10 min，保留沉淀，自然干燥30 min 使丙酮揮發(fā)，得到蛋白質(zhì)團(tuán)塊。向蛋白質(zhì)團(tuán)塊加入500 μL 裂解液，充分打散混勻，4 ℃，10 000 r/min，離心10 min，取上清液備用。

蛋白質(zhì)定量采用Bradford 法，在波長595 nm條件下，用標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對制備蛋白溶液定量，蛋白樣品直接上樣或分裝后于-80℃保持備用。

1.3.2 上樣量選擇方法 17 cm pH 5～8 IPG 膠條上樣量設(shè)定3 個對比：60，90，120 μg，進(jìn)行雙向電泳。

1.3.3 IPG 膠條pH 范圍選擇方法 IPG 膠條設(shè)定2 個對比，分別為17 cm pH 5～8 和17 cm pH 3～10，進(jìn)行雙向電泳。

1.3.4 聚焦時間 一向膠聚焦時間設(shè)定2 個對比：程序一，400 V 10 h+1 000 V 2 h；程序二，400 V 16 h+1 000 V 3 h，進(jìn)行雙向電泳。

1.3.5 平衡時間 膠條平衡時間設(shè)定2 個對比：5，15 min，進(jìn)行雙向電泳。等電聚焦完成后，取出膠條，用濾紙吸取表明多余液體，依次放入平衡緩沖液I （6 mol/L Urea，2%SDS，50 nmol/L pH 8.8 Tris-HCl，20%甘油，1%DTT）、平衡緩沖液II（2.5%碘乙酰胺代替平衡液I 中1%DTT）中，選擇5，15 min 于搖床上平衡。

1.3.6 助凝劑劑量 配制二向膠溶液 （33%水，40%二向凝膠儲備液，25% 1.5 mol/L pH 8.8 Tris堿，1%SDS（10%）混勻，取10 mL 裝入100 mL 小燒杯中，分別加入如表1所示含10%過硫酸銨和TEMED），每隔1 min 檢測二向膠是否凝結(jié)，并記錄開始凝膠時間。

1.3.7 二向膠濃度的選擇 二向膠濃度設(shè)定2 個對比，分別為10%和12%SDS 聚丙烯酰氨凝膠，配制試劑如表2。

表1 試劑添加量Table 1 Reagents of experiment

表2 不同濃度的凝膠試劑添加量Table 2 Reagents of different concentration in gels

1.3.8 凝膠染色、掃描及圖譜分析 比較分析考馬斯亮藍(lán)染色和硝酸銀染色效果。

考馬斯亮藍(lán)染色：用考馬斯亮藍(lán)染色液（0.12%考馬斯亮藍(lán)G-250，40%甲醇，10%冰醋酸）浸泡，搖床上過夜，染色完成后，用蒸餾水清洗2～3 次，再用脫色液（30%甲醇，10%冰醋酸）脫色，每1 h 換新脫色液浸泡脫色，3 次以上，直至圖像清晰為止。

硝酸銀染色：固定，加入固定液（10%冰醋酸，40%無水乙醇蒸餾水定容至500 mL），搖床上過夜，把經(jīng)固定的膠板置于盛有500 mL 雙蒸水的塑料盤中清洗3 次，每次10 min；致敏，將膠放入致敏液（0.2%硫代硫酸鈉，6.8%乙酸鈉，30%無水乙醇）中，搖床上浸泡30 min，用500 mL 蒸餾水在塑料盤中清洗3 次，每次10 min；染色，加入染色液（0.25%硝酸銀），銀染20 min，振蕩混勻，注意避光，染色完成后，純水洗2 次，每次1 min；顯色，先用少量顯色液（2%碳酸鈉，0.8 mol/L 甲醛溶液）快速洗去“黃褐色泥沙樣”的背景雜質(zhì)，再加入多量顯色液，快速振蕩，密切觀察染色情況，及時加入終止液（11.6 g/L EDTA），一般2～5 min 即可；終止顯色，在終止液中放置30 min，用蒸餾水搖晃清洗10 min。

脫色后凝膠用Vilber Lourmat 凝膠成像系統(tǒng)掃描并進(jìn)行圖譜分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)樣品制備方法對結(jié)果的影響

蛋白質(zhì)樣品制備是雙向電泳的基礎(chǔ)步驟，是影響結(jié)果的關(guān)鍵因素[10]。本試驗(yàn)采用液氮研磨和丙酮沉淀2 種方法進(jìn)行蛋白質(zhì)樣品制備。結(jié)果顯示利用液氮研磨法提取的蛋白質(zhì)所得的2-DE 圖譜（圖1a）的蛋白點(diǎn)較少，分辨率低，蛋白質(zhì)拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重。丙酮沉淀法是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中常用的蛋白質(zhì)提取方法，可有效對蛋白樣本進(jìn)行濃縮及除鹽[11]，利用丙酮沉淀法所得的2-DE 圖譜 （圖1b）的蛋白點(diǎn)明顯增多且清晰，拖尾現(xiàn)象減少。丙酮沉淀法有效去除了核酸、脂肪等雜質(zhì)的影響，提取的蛋白質(zhì)較純，過夜放置使得蛋白質(zhì)的提取率增加，所得圖譜效果較佳。因此后續(xù)試驗(yàn)選用丙酮沉淀法進(jìn)行蛋白質(zhì)樣品制備。

圖1 不同蛋白質(zhì)提取方法的2-DE 圖譜Fig.1 The 2-DE map of different protein extraction methods

2.2 不同上樣量的影響

膠條的蛋白上樣量是決定雙向電泳圖譜質(zhì)量的重要因素之一。本試驗(yàn)選用17 cm IPG 和考馬斯亮藍(lán)染色，對上樣量進(jìn)行分析。上樣量過高使蛋白質(zhì)不易分離，易造成圖譜拖尾。而上樣量過低時，低豐度的蛋白質(zhì)點(diǎn)不易被染色，無法觀察，從而可能丟失很多重要的蛋白質(zhì)信息。提高蛋白質(zhì)的上樣量有利于低豐度蛋白質(zhì)的檢測，而上樣量過高會引起雙向電泳圖譜的畸變，高豐度蛋白會掩蓋其它蛋白點(diǎn)，致使雙向電泳圖譜質(zhì)量下降[12]。結(jié)果顯示當(dāng)?shù)鞍咨蠘恿繛?0 μg 時，圖譜（圖2b）蛋白點(diǎn)清晰，縱紋和橫紋較少；上樣量為60 μg時，部分低豐度蛋白沒有被檢測到而使總蛋白點(diǎn)較少；而上樣量為120 μg 時，出現(xiàn)蛋白質(zhì)點(diǎn)密集分離不開的現(xiàn)象，拖尾嚴(yán)重。對比分析可得，17 cm pH 5～8 IPG 膠條蛋白樣品的最佳上樣量為90 μg，所得的圖譜質(zhì)量較佳。

圖2 不同上樣量的2-DE 圖譜Fig.2 The 2-DE map of different loading quantities

2.3 IPG 膠條pH 范圍對結(jié)果的影響

選擇合適的pH 梯度范圍的IPG 膠條對提高雙向電泳圖譜的分辨率很重要[13]。本試驗(yàn)選取17 cm pH 3～10 和pH 5～8 的IPG 膠條。采用pH 3～10 的IPG 膠條時（圖3a），拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重，尤其是堿性末端。這可能與高白鮭肌肉蛋白質(zhì)的種類有關(guān)，肌肉蛋白在堿性條件下分離不徹底或含量較高。由于膠條長度一定，pH 范圍越大，分離的蛋白質(zhì)范圍越廣，而不同pH 值的越難區(qū)分，從而導(dǎo)致電泳圖譜出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。pH 5～8 的IPG 膠條（圖3b）的圖譜蛋白點(diǎn)較為清晰，而分離到的蛋白質(zhì)較少，尤其是堿性蛋白質(zhì)損失嚴(yán)重，圖譜較清晰，縱紋及橫紋少。因此，在選擇IPG 膠條pH 范圍時，要根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康呐c研究的蛋白質(zhì)種類選擇，本研究選用pH 5～8 的IPG 膠條。

2.4 不同聚焦時間對結(jié)果的影響

17 cm 的IPG 膠條來說，聚焦時間選擇400 V 16 h+1 000 V 2 h 較為適宜。

合理的等電聚焦程序是獲得高質(zhì)量及高分辨率圖譜的基礎(chǔ)，等電聚焦程序的選擇直接影響圖譜上的橫紋及蛋白質(zhì)點(diǎn)的拖尾現(xiàn)象[14]。本試驗(yàn)采用兩種聚焦時間在其它條件一致的情況下進(jìn)行雙向電泳試驗(yàn)。結(jié)果顯示，當(dāng)聚焦時間為400 V 10 h+1 000 V 2 h 時（圖4a），圖譜的蛋白點(diǎn)分布較為集中，并且數(shù)量少，由于聚焦時間不足，蛋白質(zhì)不能很好的在一向膠中分散開。采用聚焦時間為400 V 16 h+1 000 V 2 h 時（圖4b），得到的圖譜蛋白點(diǎn)分散較為均勻，清晰度提高。由此可得，對于

圖3 不同pH IPG 膠條的2-DE 圖譜Fig.3 The 2-DE map of different pH IPG strips

圖4 不同聚焦時間的2-DE 圖譜Fig.4 The 2-DE map of different time of electrophoresis

2.5 不同平衡時間對結(jié)果的影響

雙向電泳操作過程中，一向膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到二向膠中需要經(jīng)過平衡，平衡時間影響蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移程度。膠條平衡過程有利于蛋白從第一向到第二向的轉(zhuǎn)移，使蛋白質(zhì)巰烷基化，防止在電泳過程中重新氧化，以確保在此過程中正常遷移。結(jié)果顯示，平衡5 min 時（圖5a），蛋白質(zhì)從一向膠到二向膠的轉(zhuǎn)移效果較差，在膠片上方出現(xiàn)蛋白質(zhì)條帶，嚴(yán)重拖尾；而平衡15 min 時（圖5b），一向膠中蛋白質(zhì)較好的轉(zhuǎn)移到二向膠中，蛋白點(diǎn)較為清晰，橫縱紋較少。膠條的平衡過程是雙向電泳的關(guān)鍵步驟，對比分析可知平衡時間選擇15 min 較為合理。

圖5 不同平衡時間的2-DE 圖譜Fig.5 The 2-DE map of different time of balance

2.6 凝膠劑劑量的選擇

雙向電泳操作中，凝膠劑TEMED 和過硫酸銨的用量直接影響膠片凝結(jié)時間。凝膠劑劑量的選擇對試驗(yàn)的成功與否具有重要影響。凝膠劑的劑量過多，膠凝太過迅速，無法將膠灌注到膠板中；凝膠劑用量過少，膠無法按時凝結(jié)，膠片脆弱且不光滑，并且長時間等待會影響后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)程。由圖6中可知，隨著TEMED 和過硫酸銨用量的增加，膠凝結(jié)的時間明顯縮短，變化顯著。由灌膠所需時間所知，30 min 凝膠時間較為理想，從圖6中可以看出，第5 組凝膠時間復(fù)合要求，即添加10%過硫酸銨0.05 mL，TEMED 2 μL。當(dāng)然，不同溫度也會對凝膠時間有影響，具體選擇時，要根據(jù)環(huán)境因素以及試驗(yàn)所合適的凝膠時間選擇。

圖6 不同助凝劑劑量對凝膠時間的影響Fig.6 The influence to time of different concentration of assistant reagent

2.7 不同二向膠濃度的影響

SDS-PAGE 凝膠電泳主要根據(jù)蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量進(jìn)行分離[15]，不同樣品蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量不同，所選擇的凝膠濃度也有差異，因此選擇適宜的膠濃度以達(dá)到良好的分離效果。本試驗(yàn)采用10%和12%兩種膠濃度進(jìn)行對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：高白鮭肌肉蛋白在10%濃度的二向膠圖譜 （圖7a）中分離效果較好，而濃度小的膠在低分子質(zhì)量蛋白易跑出，并且膠濃度較低膠容易破碎，在操作大膠過程中較困難；而12%濃度的二向膠圖譜（圖7b）的分離效果要差于10%，橫縱條紋相對較多，分離不徹底。因此在后續(xù)試驗(yàn)中第二向選擇濃度為10%的凝膠。

2.8 不同染色方法的影響

染色方法對雙向電泳圖譜分辨率的高低以及蛋白點(diǎn)檢測的靈敏度有很大影響[16]，最常用的檢測方法有銀染和考馬斯亮藍(lán)染色兩種，此外還包括放射自顯影和熒光染色等[17]。本試驗(yàn)用銀染和考染兩種染色方案對高白鮭肌肉組織總蛋白雙向電泳結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，銀染（圖8a）圖譜中蛋白點(diǎn)多且較為清晰，靈敏度明顯高于考染，而考染（圖8b）圖譜檢測到蛋白點(diǎn)少，靈敏度低。對比分析，銀染靈敏度顯然高于考染，而操作相對復(fù)雜，干擾因素較多?？既静僮骱唵?，價格低廉，而蛋白點(diǎn)少且靈敏度低，不易出結(jié)果，因此后續(xù)研究中，在對比尋找差異蛋白點(diǎn)時可選用銀染法制膠，而結(jié)合質(zhì)譜進(jìn)行差異蛋白鑒定時選用考染法。

圖7 不同二向膠濃度的2-DE 圖譜Fig.7 The 2-DE map of different concentration in gels

圖8 不同染色方法的2-DE 圖譜Fig.8 The 2-DE map of different staining methods

3 結(jié)論

蛋白質(zhì)樣品的制備是雙向電泳技術(shù)最為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，根據(jù)樣品自身的特性，選擇最適合的制備方法。肌肉組織由于其特殊性，與其它樣品的雙向電泳略有不同。本研究采用兩種方法進(jìn)行蛋白質(zhì)提取，對比電泳結(jié)果，丙酮沉淀法能很好的提純蛋白質(zhì)，該方法去除了核酸、脂肪等雜質(zhì)的影響，提取的蛋白質(zhì)較純，使得蛋白質(zhì)的提取率增加。生物體中大部分蛋白的等電點(diǎn)在pH 4～8 之間，通過對IPG 膠條pH 值選擇的優(yōu)化試驗(yàn)，可知線性寬范圍的膠條（pH 3～10）其pH 值分布范圍廣，基本涵蓋樣品中所有等電點(diǎn)的蛋白，而大量蛋白點(diǎn)集中在膠條中間，得到的2-DE 圖譜堿性端拖尾嚴(yán)重，蛋白點(diǎn)也較少，總體圖譜質(zhì)量差，而窄范圍（pH 5～8）的膠條能夠有效提高雙向電泳圖譜的分辨率和靈敏度，然而也會存在pH 梯度外蛋白丟失現(xiàn)象，因此，選擇一個合適pH 梯度范圍的IPG 膠條對提高2-DE 圖譜質(zhì)量有重要作用。合理的等電聚焦程序是獲得高質(zhì)量及高分辨率圖譜的基礎(chǔ)，等電聚焦程序的選擇對圖譜上的橫紋及蛋白質(zhì)點(diǎn)的拖尾直接影響。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)一向膠聚焦時間400 V 16 h 比較適宜，蛋白質(zhì)分散均勻，有效改善圖譜的橫紋及拖尾問題，而選用平衡時間15 min可以使一向膠中的蛋白很好的轉(zhuǎn)移到二向膠中。在用不同濃度的SDS-PAGE 膠進(jìn)行第二向電泳時發(fā)現(xiàn)，10%的膠中蛋白質(zhì)圖形點(diǎn)數(shù)均勻，效果最佳。最終對比染色方法得到銀染蛋白點(diǎn)多且效果優(yōu)于考染。

綜上所述，該研究建立的高白鮭肌肉蛋白質(zhì)雙向電泳體系：丙酮沉淀法制備蛋白質(zhì)樣品，選用90 μg 上樣量，17 cm pH 5～8 的IPG 膠條，設(shè)定一向膠聚焦時間為400 V 16 h+1 000 V 2 h 以及平衡時間為15 min，助凝劑劑量選用過硫酸銨0.05 mL，TEMED 2 μL，采用濃度為10%的二向分離膠以及硝酸銀染色。采用本試驗(yàn)方法得到的雙向電泳圖譜更為理想，蛋白點(diǎn)清晰，分布均勻，且具有比較好的重復(fù)性，這為后續(xù)蛋白質(zhì)組學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。