酒酒球菌脅迫適應(yīng)性機(jī)制的研究進(jìn)展

趙紅玉 李 華 劉龍祥 彭 帥 王 華

（西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院 陜西楊凌712100）

蘋果酸乳酸發(fā)酵 （Malolactic fermentation，MLF）是在酒精發(fā)酵結(jié)束后再發(fā)酵的過程，又稱為“二次發(fā)酵”。發(fā)酵機(jī)理是在蘋果酸乳酸酶催化下將蘋果酸分解為乳酸和二氧化碳，其中，乳酸菌參與合成蘋果酸乳酸酶[1-3]。MLF 被認(rèn)為是釀造優(yōu)質(zhì)紅葡萄酒及部分白葡萄酒中必不可少的環(huán)節(jié)，它的順利進(jìn)行會(huì)降低葡萄酒的酸度，提高葡萄酒的微生物穩(wěn)定性，增加酒體的果香味，降低酒體的收斂性，豐富酒體的結(jié)構(gòu)感，使其更加飽滿、馥郁等[4-5]。目前，應(yīng)用于葡萄酒使其進(jìn)行MLF 的主要人為誘導(dǎo)方法是向酒體中加入乳酸菌直投式發(fā)酵劑[6-9]。參與MLF 的乳酸菌主要有：明串珠菌屬（Leuconostoc）、片球菌屬（Pediococcus）和乳桿菌屬（Lactobacillus），其中，酒酒球菌是19 世紀(jì)60年代中期在16SRNA 序列分析的基礎(chǔ)上被鑒定并重新命名的。它是使蘋果酸乳酸發(fā)酵能夠順利進(jìn)行的最重要的啟動(dòng)者，也是在葡萄酒的嚴(yán)峻生境中耐受性最強(qiáng)的菌種[10-13]。

在葡萄酒的釀造過程中，酒體中乙醇濃度、SO2含量、酒體pH 值、溫度都是制約酒酒球菌生長(zhǎng)的重要因素[14]，從而對(duì)MLF 的順利進(jìn)行產(chǎn)生不利影響。葡萄酒微生物學(xué)家探究了酒酒球菌在葡萄酒中的適應(yīng)性機(jī)制，同時(shí)，需要繼續(xù)發(fā)展和完善直投式發(fā)酵劑的生產(chǎn)技術(shù)，以獲得耐受性強(qiáng)、發(fā)酵活力高、活菌數(shù)高、MLF 效率高的菌株，在接種后可直接使用，無(wú)需中間繼代培養(yǎng)和預(yù)培養(yǎng)的商業(yè)化產(chǎn)品。對(duì)酒酒球菌的脅迫適應(yīng)性機(jī)制研究頗受關(guān)注[15～18]。本文主要從pH 值、乙醇濃度和溫度3個(gè)方面對(duì)酒酒球菌的影響及其在葡萄酒惡劣生境中形成的適應(yīng)性機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 乙醇對(duì)酒酒球菌的影響及脅迫反應(yīng)機(jī)制

1.1 乙醇脅迫對(duì)酒酒球菌的影響

早期有關(guān)酒酒球菌（Oenococcus oeni）抗逆性機(jī)理的研究主要在細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和成分的變化上。酒酒球菌是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，沒有完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，直接由細(xì)胞膜包被，所以細(xì)胞膜是其抵御不利環(huán)境的第一道屏障[17]。在受到脅迫反應(yīng)時(shí)，為避免影響細(xì)胞新陳代謝的正常進(jìn)行，細(xì)胞膜物理特性和流動(dòng)性需要不斷調(diào)整，以維持其屏障作用和酶活性。乙醇脅迫主要影響酒酒球菌細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，研究顯示，隨著乙醇濃度的升高，細(xì)胞膜的流動(dòng)性和通透性增加，質(zhì)子或其它離子的透過率增加，將致使能量轉(zhuǎn)化效率降低[19]。隨著乙醇處理時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率顯著降低，不同乙醇濃度對(duì)細(xì)胞的影響出現(xiàn)明顯差異。處理時(shí)間30 min 時(shí)，14%乙醇處理會(huì)使菌體細(xì)胞發(fā)生不可逆的硬化，而10%和12%乙醇處理發(fā)生的硬化是可逆的，當(dāng)脅迫條件移除時(shí)細(xì)胞膜會(huì)恢復(fù)至初始狀態(tài)。處理時(shí)間相同時(shí)，細(xì)胞存活率隨著乙醇濃度的增加而降低，即乙醇濃度越高對(duì)細(xì)胞活力的影響越大[20]。也有研究指出，當(dāng)環(huán)境中存在10%乙醇或更少量乙醇（3%～5%或7%）時(shí)，可促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)，當(dāng)酒精濃度高于12%時(shí)，將顯著抑制酒酒球菌的生長(zhǎng)[21]。

Nair 等[21]對(duì)酒酒球菌PSU-1 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)在12%乙醇存在的條件下，與碳水化合物轉(zhuǎn)移有關(guān)的基因表達(dá)會(huì)受到抑制，與細(xì)胞組件合成相關(guān)的基因和蛋白質(zhì)表達(dá)量增加。此外，兩個(gè)與乙酰轉(zhuǎn)移酶相關(guān)的基因表達(dá)也受到顯著抑制。由蛋白質(zhì)組學(xué)分析可知，酒酒球菌PSU-1 在12%乙醇處理5 h 后，蛋白質(zhì)含量及穩(wěn)定性顯著下降，如clpC、clpE 及參與胞壁質(zhì)合成的蛋白質(zhì)如MurC、MurD 和GlmS 等。

1.2 乙醇脅迫的適應(yīng)性機(jī)制

細(xì)胞受到乙醇脅迫時(shí)，細(xì)胞膜組分會(huì)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整以適應(yīng)不利環(huán)境。其中，較為明顯的是環(huán)丙烷脂肪酸含量增加，環(huán)丙烷環(huán)狀結(jié)構(gòu)中?；湵软樖降碾p鍵更穩(wěn)定，從而增強(qiáng)菌體細(xì)胞對(duì)脅迫環(huán)境的耐受性[22]。同時(shí)，細(xì)胞膜中乳桿菌酸（lactobacillic acid，C19cyc11）含量增加，表示C19cyc11可能參與了脅迫反應(yīng)，此機(jī)制仍需要進(jìn)一步探究。乙醇可通過自由擴(kuò)散進(jìn)出細(xì)胞，因此環(huán)境中存在乙醇時(shí)會(huì)影響細(xì)胞膜的通透性。菌體細(xì)胞受到乙醇脅迫時(shí)，細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸含量增加使流動(dòng)性增加，細(xì)胞膜通透性增加[23]。菌體細(xì)胞中的檸檬酸代謝可提供細(xì)胞生長(zhǎng)存活所需的能量，當(dāng)受到乙醇脅迫時(shí)，很多調(diào)控菌體細(xì)胞中檸檬酸鹽代謝的基因會(huì)過量表達(dá)，這就表明檸檬酸鹽代謝可能參與了脅迫反應(yīng)[24]。進(jìn)一步研究得到檸檬酸鹽并不直接發(fā)揮其脅迫適應(yīng)性作用，而是其代謝的產(chǎn)物，如乙酸、二乙酰發(fā)揮作用，且參與代謝的基因表達(dá)量與乙醇濃度有關(guān)[25]。其中，酒酒球菌SD-2a 在經(jīng)乙醇脅迫處理后，其降解蘋果酸的能力與細(xì)胞膜中C14：0 的含量之間存在明顯的正相關(guān)性，即細(xì)胞膜中C14：0 可能參與了細(xì)胞的乙醇脅迫反應(yīng)。

圖1 乙醇脅迫后細(xì)胞適應(yīng)性機(jī)制示意圖Fig.1 Schematic diagram of cell adaptive mechanism after ethanol stress

此外，菌體細(xì)胞受到乙醇脅迫時(shí)，流動(dòng)性發(fā)生變化會(huì)觸發(fā)信號(hào)傳導(dǎo)，從而誘導(dǎo)脅迫基因的表達(dá)。如，脅 迫 基 因hsp18[26]、ggpps[27]、clpP 等 的 表 達(dá)。hsp18 合成脅迫蛋白Lo18，此蛋白可作用于菌體細(xì)胞膜以防止蛋白質(zhì)聚集而發(fā)生變性[28]，利于維持細(xì)胞膜的完整性，從而使得菌體細(xì)胞在乙醇環(huán)境中存活。ggpps 基因是參與類胡蘿卜素代謝的基因，當(dāng)它過量表達(dá)時(shí)，可促使類異戊二烯前體轉(zhuǎn)化為類胡蘿卜素以提高細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，從而參與脅迫適應(yīng)性反應(yīng)，且乙醇濃度越高ggpps 基因的表達(dá)量就越高，其機(jī)制有待進(jìn)一步探究。在酒酒球菌受到脅迫時(shí)，常伴隨著分子伴侶的表達(dá)，分子伴侶是一類在序列上雖沒有相關(guān)性但有共同功能的蛋白質(zhì)，它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)幫助其它含多肽的結(jié)構(gòu)完成正確的組裝，而且在組裝完畢后與其分離，不構(gòu)成這些蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)執(zhí)行功能的組分。在受到乙醇脅迫時(shí)，分子伴侶適應(yīng)性機(jī)制（如clpP 等）會(huì)被誘導(dǎo)表達(dá)[29]，這對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的正確組裝有重要意義。此外，活性氧（Reactive oxygen species，ROS）在生物體內(nèi)持續(xù)的產(chǎn)生，可導(dǎo)致DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)損傷，過量的活性氧會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞受到氧化脅迫[30]。細(xì)胞受到乙醇脅迫時(shí)細(xì)胞內(nèi)的活性氧產(chǎn)生會(huì)增加，谷胱甘肽還原酶（Glutathione reductase，GR）的含量也會(huì)增加，谷胱甘肽還原酶是一種利用還原型NADPH 將氧化型谷胱甘肽催化反應(yīng)成還原型谷胱甘肽的酶。因此，細(xì)胞中GR 對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原電位和抵制氧化脅迫有重要作用[31]。

2 低溫對(duì)酒酒球菌的影響及脅迫反應(yīng)機(jī)制

2.1 低溫對(duì)酒酒球菌的影響

葡萄酒進(jìn)行MLF 的啟動(dòng)途徑有以下幾種：自然誘發(fā)MLF；利用正在進(jìn)行MLF 的酒體接種；使用實(shí)驗(yàn)室制備的菌株或商業(yè)化菌株接種（即直投式發(fā)酵劑）；運(yùn)用固定化細(xì)胞或固定化酶。目前，應(yīng)用最為廣泛是第3 種誘發(fā)途徑。葡萄酒生境復(fù)雜，MLF 自然觸發(fā)與發(fā)酵時(shí)間都難以控制，其次，自然觸發(fā)MLF 對(duì)酒體的影響是非定向的，這與誘發(fā)菌種特性有關(guān)，如果MLF 不能順利進(jìn)行可能會(huì)給酒體帶來(lái)病害影響。人為誘發(fā)時(shí)，可選擇誘發(fā)的菌種與時(shí)間，有利于MLF 的控制，用于進(jìn)行MLF 的直投式發(fā)酵劑主要為酒酒球菌凍干粉，因此探究低溫對(duì)酒酒球菌的影響，對(duì)提高酒酒球菌啟動(dòng)MLF的順利進(jìn)行非常重要[32]。細(xì)胞經(jīng)低溫處理后，細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸/飽和脂肪酸（UFA/SFA）比率上升，而膜中環(huán)丙烷脂肪酸（CFA）的含量增加，同時(shí)，細(xì)胞膜的流動(dòng)性大大降低。Chu 等[19]研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在經(jīng)低溫處理后，細(xì)胞膜會(huì)發(fā)生明顯的硬化現(xiàn)象，然而其細(xì)胞活力未受到明顯影響，且溫度越低其硬化現(xiàn)象越明顯。細(xì)胞經(jīng)短時(shí)間低溫處理后，將溫度回升至原來(lái)溫度時(shí)，其細(xì)胞膜的流動(dòng)性也會(huì)恢復(fù)至原來(lái)狀態(tài)，且細(xì)胞膜及蛋白質(zhì)組分并未發(fā)生明顯變化。即低溫脅迫會(huì)影響細(xì)胞膜中脂肪酸及蛋白質(zhì)組分，卻不影響細(xì)胞的存活率，且此過程是可逆的。低溫不僅會(huì)影響細(xì)胞膜的流動(dòng)性，更會(huì)使得細(xì)胞內(nèi)的酶活性暫時(shí)降低，抑制了細(xì)胞內(nèi)各種生化反應(yīng)的進(jìn)行，當(dāng)溫度回升，這種抑制作用便會(huì)解除。

2.2 低溫脅迫的適應(yīng)性機(jī)制

細(xì)胞膜的流動(dòng)性是生物膜正常功能的必須條件，如細(xì)胞物質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞信息的傳導(dǎo)、膜上的酶活性等。受到低溫脅迫時(shí)細(xì)胞膜組分調(diào)整是為了使其流動(dòng)性保持在最適范圍內(nèi)，其最佳流動(dòng)性約為水黏度的100 倍，相當(dāng)于90%甘油水溶液的黏度。在該值附近，細(xì)胞膜可維持其結(jié)構(gòu)的連續(xù)性，適合于膜蛋白的嵌入和運(yùn)動(dòng)。酒酒球菌細(xì)胞受到低溫脅迫時(shí)，C19cyc11 的含量會(huì)增加，C16：0 的含量會(huì)降低，這樣的脂肪酸組成有利于提高細(xì)胞膜的完整性和對(duì)抗脅迫環(huán)境的能力[33]。環(huán)丙烷脂肪酸的合成防止了細(xì)胞膜磷脂的堆積，且環(huán)丙烷脂肪酸比其它脂肪酸更加穩(wěn)定，使細(xì)胞膜在低溫下仍能保持較好的彈性和靈活性[24]。此外，酒酒球菌可產(chǎn)生胞外多糖（Exopolysaccharides，EPS），主要是莢膜類多聚體及葡聚糖。莢膜EPS 和可溶性EPS 的產(chǎn)生對(duì)酒酒球菌的細(xì)胞膜有保護(hù)作用，在低溫脅迫時(shí)，這可對(duì)菌體細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用，然而菌株所產(chǎn)生的EPS 對(duì)葡萄酒的質(zhì)量有一定的影響[34-36]。總言之，低溫脅迫對(duì)細(xì)胞的影響及機(jī)制的探究大多數(shù)停留在細(xì)胞膜組分的變化上，而并未進(jìn)行深入的研究。

3 高溫對(duì)酒酒球菌的影響及脅迫反應(yīng)機(jī)制

3.1 高溫對(duì)酒酒球菌的影響

高溫會(huì)增加細(xì)胞膜的流動(dòng)性及通透性，甚至導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)代謝物流出，溫度過高時(shí)會(huì)影響細(xì)胞膜中的酶活，進(jìn)而影響細(xì)胞的存活率。在42 ℃條件下培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，菌體的生長(zhǎng)明顯受到抑制，且高溫脅迫誘導(dǎo)了脅迫蛋白的合成[37]。這種機(jī)制使得酒酒球菌細(xì)胞能夠存活并繁殖。并且酒酒球菌細(xì)胞經(jīng)42 ℃處理后直投入葡萄酒中發(fā)酵可明顯提高細(xì)胞在葡萄酒中的存活率以及誘發(fā)MLF 順利進(jìn)行的能力。酒酒球菌細(xì)胞受到高溫脅迫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的熱休克蛋白含量增加，如Lo18[38-39]。且脅迫溫度不同時(shí)，Lo18 在細(xì)胞上的分布存在差異。當(dāng)溫度升至42 ℃時(shí)，Lo18 大多數(shù)分布在細(xì)胞脂質(zhì)體膜上，這表示Lo18 可直接作用于磷脂組分來(lái)增強(qiáng)分子順序，防止蛋白質(zhì)發(fā)生熱聚集變性，保持細(xì)胞膜完整及穩(wěn)定性。當(dāng)處理溫度高于33.8 ℃時(shí)，膜會(huì)發(fā)生硬化現(xiàn)象，當(dāng)溫度為15～33.8 ℃時(shí)，Lo18 對(duì)細(xì)胞膜沒有顯著影響。在不同脅迫溫度下測(cè)定sHSP分子質(zhì)量，當(dāng)溫度為4 ℃時(shí)，sHSP 的分子質(zhì)量為1.5 Mu，30 ℃時(shí)sHSP 的分子質(zhì)量為229 ku，40 ℃時(shí)為75 ku，45 ℃時(shí)為43 ku[38]。

3.2 高溫脅迫的適應(yīng)性機(jī)制

高溫脅迫時(shí)，酒酒球菌細(xì)胞膜上的酰基鏈運(yùn)動(dòng)增加，利于保持較好的脂質(zhì)順序，以防止細(xì)胞膜流動(dòng)性過高引起細(xì)胞內(nèi)代謝物質(zhì)流失。酒酒球菌可通過合成小熱休克蛋白（Small heat shock protein，sHSP）來(lái)抵制高溫脅迫環(huán)境，如Lo18[40]。在大多數(shù)分子伴侶上游都存在CtsR 基因，細(xì)胞膜流動(dòng)性的變化會(huì)觸發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而誘導(dǎo)該調(diào)節(jié)子的表達(dá)，啟動(dòng)合成分子伴侶基因的表達(dá)[25]。細(xì)胞小熱休克蛋白大多為分子伴侶，這種蛋白質(zhì)廣泛存在于可獨(dú)立存活的微生物細(xì)胞中。受到高溫脅迫時(shí)，隨著溫度的變化，Lo18 在細(xì)胞膜上的分布會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化，這反映出不同溫度對(duì)細(xì)胞膜的影響不同。Lo18 可根據(jù)細(xì)胞膜的變化調(diào)整自己在細(xì)胞膜上的分布情況，從而更有利于發(fā)揮其作用。溫度較高時(shí)，Lo18 可直接作用于細(xì)胞膜上的脂質(zhì)組分，來(lái)增強(qiáng)分子順序防止蛋白質(zhì)熱聚集而變性，以維持蛋白質(zhì)的正常功能，保證細(xì)胞在高溫下的存活。此外，Lo18 的分子質(zhì)量也根據(jù)溫度的變化而有所改變，在一定范圍內(nèi)溫度升高時(shí)，分子質(zhì)量會(huì)降低，這樣有利于更好的與細(xì)胞膜上的脂質(zhì)分子相結(jié)合，更好的穩(wěn)定細(xì)胞膜[40]。此外，在高溫脅迫后菌體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的多種脅迫蛋白被逐漸發(fā)現(xiàn)并了解，包括：ClpX，一種在指數(shù)生長(zhǎng)期最先表達(dá)的熱誘導(dǎo)蛋白，是調(diào)節(jié)ATP 酶亞基Clp-P 的分子伴侶[41]；TrxA，類似于硫氧還蛋白，編碼環(huán)蛋白，當(dāng)環(huán)境中溫度升高時(shí)其表達(dá)量會(huì)增加[42]；FtsH，一種膜蛋白酶，在菌體受到高溫脅迫或者精氨酸存在時(shí)表達(dá)量都會(huì)增加[43]；OmrA，在高溫脅迫下其表達(dá)量會(huì)增加[44]。

4 酸對(duì)酒酒球菌的影響及脅迫適應(yīng)性機(jī)制

4.1 酸對(duì)酒酒球菌的影響

酒酒球菌生長(zhǎng)的最適pH 值為4.8～5.5，而葡萄酒的pH 值通常低于3.5，即對(duì)酒酒球菌而言，葡萄酒是一個(gè)低pH 值的脅迫環(huán)境，pH 值的高低限制MLF 是否能夠順利進(jìn)行[45]。當(dāng)pH 值較低時(shí)，酒酒球菌細(xì)胞膜中乳桿菌酸的含量顯著增加。Drici-Cachon 等[46]研究了3 株酒酒球菌在不同pH值條件下，膜脂肪酸的變化情況，結(jié)果表明pH 的變化對(duì)強(qiáng)嗜酸菌的膜脂肪酸影響較小，而對(duì)Lo107 和Lo8413（中性嗜酸菌）的影響幅度較大，且不飽和脂肪酸的不飽和度隨著pH 的變化而變化。菌體細(xì)胞膜經(jīng)pH 3.0 脅迫處理后細(xì)胞膜發(fā)生了硬化現(xiàn)象，pH 4.0 處理后的細(xì)胞膜流動(dòng)性未出現(xiàn)明顯變化，且酸脅迫對(duì)細(xì)胞膜的影響是不可逆的。不同pH 處理對(duì)細(xì)胞的存活率影響不同，經(jīng)pH 3.0 處理30 min 后，細(xì)胞的存活率下降到75%，經(jīng)pH 4.0 處理30 min 的細(xì)胞活力幾乎保持100%。有研究對(duì)編碼H+-ATP 酶的基因atp 進(jìn)行分析，結(jié)果顯示受到酸脅迫的菌體細(xì)胞其atp 的mRNA 含量要遠(yuǎn)高于未受到脅迫菌體細(xì)胞的mRNA 含量，受到脅迫后細(xì)胞中atp 基因表達(dá)量為正常環(huán)境中生存菌體細(xì)胞的3 倍[47]。

4.2 酸脅迫的適應(yīng)性機(jī)制

酸脅迫時(shí)，細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸的含量會(huì)變化，以維持細(xì)胞膜流動(dòng)性位于最適范圍。其中，乳桿菌酸含量會(huì)增加，乳桿菌酸有利于維持細(xì)胞膜的完整性及穩(wěn)定性。酒酒球菌在酸脅迫條件下時(shí)，能誘導(dǎo)膜上H+-ATP 酶的活性增強(qiáng)。該酶不僅在MLF 過程中發(fā)揮作用而且在抗酸機(jī)制中也發(fā)揮重要作用。H+-ATP 酶可耦合ATP 水解將質(zhì)子排除細(xì)胞外，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外的pH 值，以維持細(xì)胞膜特性，以保證細(xì)胞的正常生長(zhǎng)[48]。同時(shí)，膜上H+-ATP 活性越強(qiáng)，MLF 活性也越強(qiáng)，這為菌株在葡萄酒惡劣生境中的生長(zhǎng)提供了能量保障。此外，菌體細(xì)胞受到酸脅迫時(shí)會(huì)誘導(dǎo)精氨酸脫亞胺酶（Arginine deiminase，ADI）代謝，將精氨酸轉(zhuǎn)化為堿性產(chǎn)物而升高外部pH 值，從而增強(qiáng)了菌體細(xì)胞的耐酸性[49]。此外，精氨酸代謝是一個(gè)產(chǎn)能過程，與細(xì)菌的生長(zhǎng)相偶聯(lián)[50]，使酒酒球菌在脅迫條件下具有更高的存活率。

圖2 酸脅迫后細(xì)胞適應(yīng)性機(jī)制示意圖Fig.2 Schematic diagram of cell adaptive mechanism after acid stress

5 存在問題與展望

隨著生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)酒酒球菌脅迫適應(yīng)性機(jī)制逐漸轉(zhuǎn)向基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及生物信息學(xué)研究，以期從基因表達(dá)方面了解脅迫反應(yīng)的實(shí)質(zhì)。在酒酒球菌受到脅迫后的生長(zhǎng)過程中，參與脅迫反應(yīng)的基因被發(fā)現(xiàn)并探究其發(fā)揮作用的機(jī)理。盡管很多脅迫基因已經(jīng)被描述，但在惡劣的葡萄酒生境中，脅迫適應(yīng)基因的調(diào)控機(jī)制，所參與的代謝通路仍需進(jìn)一步研究[51]。例如，酒酒球菌對(duì)酒體中氨基酸和多肽的吸收至關(guān)重要，有利于其在脅迫環(huán)境中存活，然而目前對(duì)酒酒球菌在酒體中的氮代謝研究較少，如果能夠探究得到菌體細(xì)胞在酸性環(huán)境下對(duì)多肽的利用機(jī)制，對(duì)進(jìn)一步理解MLF 將會(huì)有非常重要的幫助[52]。

探究酒酒球菌脅迫反應(yīng)基因的目標(biāo)：明確菌體中脅迫反應(yīng)基因的具體調(diào)控機(jī)制；對(duì)脅迫適應(yīng)基因進(jìn)行篩選、復(fù)制，研究其脅迫反應(yīng)機(jī)理，并驗(yàn)證；發(fā)展生化手段篩選高耐受的菌株，以適應(yīng)酒體的惡劣環(huán)境；發(fā)展生化或分子手段，對(duì)菌株在脅迫環(huán)境中的適應(yīng)性進(jìn)行評(píng)估；構(gòu)建工程菌，使菌株具有抗酸，抗酒精，耐低溫等特性，提高其在酒體中的存活率和MLF 能力。