以質(zhì)粒為基礎(chǔ)的同源重組技術(shù)在葡萄球菌基因敲除中的應(yīng)用

武有聰,2，孟媛媛，丁百興2，韓海燕2，瞿 滌2，白 麗

研究細(xì)菌基因功能的方法主要有基因敲除(基因組中直接去除某基因，位點(diǎn)特異)、反義RNA干擾(降低mRNA表達(dá)量，影響因素多)、轉(zhuǎn)座子插入突變(插入位點(diǎn)隨機(jī)，篩選繁瑣，存在多位點(diǎn)插入突變)、基因過表達(dá)等技術(shù)，但最可靠而常用的方法仍是基因敲除[1-2]，即選擇合適的質(zhì)粒，將靶基因兩側(cè)的同源序列克隆至載體上，轉(zhuǎn)入宿主菌后通過同源重組實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的置換敲除。由于微生物的多樣性，將外源DNA導(dǎo)入宿主菌并完成同源重組的策略也千差萬別。目前，未見有適合于多種宿主菌基因敲除的通用重組系統(tǒng)的報(bào)道。因此，需要根據(jù)宿主菌的特點(diǎn)來構(gòu)建相對(duì)特異的基因敲除系統(tǒng)，用于基因功能研究。

葡萄球菌屬(Staphylococcusspp.)是引起醫(yī)院內(nèi)感染的重要病原菌[3-5]，由于其GC含量較低(mol%約28%～35%)，通過同源重組進(jìn)行基因敲除相對(duì)較困難，常常受限于轉(zhuǎn)化效率低、重組頻率低、突變株篩選繁瑣等困難，是葡萄球菌致病基因功能研究的難點(diǎn)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，用于葡萄球菌基因敲除的重組系統(tǒng)也得到不斷改進(jìn)，基因敲除的過程也變得簡(jiǎn)捷。作者結(jié)合本實(shí)驗(yàn)工作，對(duì)葡萄球菌基因敲除中采用的以質(zhì)粒為基礎(chǔ)的同源重組技術(shù)進(jìn)行如下綜述。

1 同源重組技術(shù)敲除細(xì)菌靶基因的機(jī)制

將目的基因(待敲除的靶基因)兩側(cè)的同源序列(分別稱為同源臂A/B)克隆至復(fù)制起始子缺陷的質(zhì)粒中，一般在兩段同源臂之間含有一段抗性基因(圖1A)。在非容納條件下，質(zhì)粒通過同源重組整合至細(xì)菌基因組中(圖1B)。在容納條件下，通過質(zhì)粒的滾環(huán)復(fù)制發(fā)生單交換和雙交換，單交換重組時(shí)形成含有野生型和突變型同源序列的部分二倍體細(xì)胞，靶基因敲除不成功。雙交換重組時(shí)，隨著質(zhì)粒的切除，要么突變型同源序列留在細(xì)菌基因組中，帶有野生型的質(zhì)粒被切除，靶基因敲除成功(圖1C-1)；或者野生型序列留在細(xì)菌基因組中，同源重組質(zhì)粒切除，靶基因敲除不成功(圖1C-2)。在大多數(shù)菌株中，同源重組是一個(gè)低概率事件，所以需要插入抗性標(biāo)記幫助篩選突變株。除非是重組質(zhì)粒攜帶反向選擇標(biāo)記，否則質(zhì)粒切除或丟失發(fā)生的概率都非常低，需要大量精力來篩選突變株[6-7]。

A為同源重組質(zhì)粒的構(gòu)建；US為上游同源臂; DS為下游同源臂; R為耐藥基因. B為重組質(zhì)粒DNA與細(xì)菌基因組整合；C為雙交換重組時(shí)質(zhì)粒DNA的切除。圖1 同源重組在細(xì)菌基因敲除中的作用Fig.1 Role of allelic replacement in the gene deletion

2 pBT-2重組質(zhì)粒在葡萄球菌基因敲除中的應(yīng)用

2.1pBT-2重組質(zhì)粒構(gòu)建及其特點(diǎn) 由于質(zhì)粒DNA與宿主菌基因組的整合是隨機(jī)的，發(fā)生整合的效率可高可低，所以對(duì)克隆載體的選擇非常重要。Reinhold等[8]利用溫度敏感型質(zhì)粒pTV1Ts(40 ℃質(zhì)粒消除成功率高，pE194質(zhì)粒來源)構(gòu)建同源重組質(zhì)粒，用于肉葡萄球菌(S.carnosus)和木糖葡萄球菌(S.xylosus)基因敲除的研究。將pTV1Ts 質(zhì)粒來源的BamHI-PstI酶切片段(4.0 kb)與pBR322質(zhì)粒來源于的BamHI-PvuII酶切片段(2.7 kb)連接形成pBT1質(zhì)粒，前一片段含有質(zhì)粒pE194的復(fù)制子和pC194的氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶基因(cat194)，后一片段含有內(nèi)酰胺酶基因和質(zhì)粒ColE1復(fù)制起始子。pBT1質(zhì)粒獲得大腸桿菌和葡萄球菌的復(fù)制能力，在大腸桿菌內(nèi)表現(xiàn)為氨芐青霉素抗性(cat194表達(dá)相對(duì)較低，不推薦使用氯霉素抗性標(biāo)記)，葡萄球菌內(nèi)氯霉素抗性(在亞抑菌濃度作用下葡萄球菌轉(zhuǎn)化子的涂板陽性率可提高約3倍)。再將pUC18來源的HindIII-BglI片段連接入pBT1，得到含有多克隆位點(diǎn)(12個(gè)酶切位點(diǎn))的pBT2質(zhì)粒，多克隆位點(diǎn)位于轉(zhuǎn)錄終止子T1附近。pBT2質(zhì)粒在大腸桿菌和葡萄球菌中結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，30 ℃條件下能穩(wěn)定存在，40 ℃以上容易丟失，比較適合于葡萄球菌靶基因的突變研究。

2.2pBT2重組質(zhì)粒在葡萄球菌基因敲除中的應(yīng)用 Reinhold等[8]用pBT2質(zhì)粒敲除肉葡萄球菌磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(phosphotransferase system, PTS)基因ptsI，為方便突變株的篩選，作者在同源臂構(gòu)建過程中引入了紅霉素抗性基因(ermB)。PCR分別擴(kuò)增ptsI基因兩側(cè)大約1 kb片段(上/下游同源臂)，與pEC7質(zhì)粒來源的EcoRI-PstI酶切片段(含ermB)克隆連接至pBT2質(zhì)粒，形成的重組質(zhì)粒pBTIE1轉(zhuǎn)入肉葡萄球菌，30 ℃條件下，氯霉素(Cm 20 g/mL)敏感，紅霉素(Erm 10 g/mL)耐藥，并且不能分解甘露醇和果糖的菌株為疑似突變株。經(jīng)過Southern Blot驗(yàn)證ptsI基因被敲除，并且證實(shí)基因組上沒有質(zhì)粒的序列。獲得突變株菌落的比例約8%～12%(個(gè)體試驗(yàn)差別大)。另外，又用pBT2質(zhì)粒敲除木糖葡萄球菌的蔗糖酶基因scrB，不同的是上/下游同源臂大小分別為1.7 kb和2 kb，基因敲除效率42%～57%。Egeter等[9]用pBT2質(zhì)粒敲除葡萄球菌的其它基因，發(fā)現(xiàn)敲除效率從1%～50%不等。

pBT2不僅可以用于肉葡萄球菌和木糖葡萄球菌的基因敲除，也可以用于金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌。本實(shí)驗(yàn)室[10-11]用pBT2成功敲除表皮葡萄球菌雙組分系統(tǒng)lytSR和arlRS。PCR擴(kuò)增lytSR和(或)arlRS上/下游同源臂(lytSR同源臂約1.8 kb，arlRS同源臂約0.9 kb～1.2 kb)，克隆形成pBT2-△lytSR/△arlRS重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒經(jīng)金黃色葡萄球菌RN4220限制性修飾后轉(zhuǎn)入表皮葡萄球菌SE1457。30 ℃培養(yǎng)(BM培養(yǎng)基，Erm 10～20 g/mL)至穩(wěn)定期末，1∶100轉(zhuǎn)接(BM，Erm 2.5 g/mL)，42 ℃培養(yǎng)過夜，再經(jīng)多次轉(zhuǎn)接后(BM，無抗生素)取適量涂板，紅霉素耐藥(2.5 g/mL)和氯霉素敏感(10 g/mL)的克隆為疑似突變株。疑似突變株經(jīng)PCR、RT-PCR及測(cè)序鑒定敲除成功。該方法篩選工作繁瑣，敲除效率比上述文獻(xiàn)報(bào)道的明顯偏低，往往需要幾個(gè)月的篩選才能得到突變株。

3 pMAD重組質(zhì)粒在葡萄球菌基因敲除中的應(yīng)用

3.1pMAD重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其特點(diǎn) 一般敲除突變株的篩選是通過同源重組將質(zhì)粒上的抗性基因與宿主菌基因組中的靶基因進(jìn)行置換，使宿主菌在缺失靶基因的同時(shí)獲得抗性基因，通過抗性標(biāo)記直接篩選疑似突變株，這種方法稱為正向選擇或陽性選擇(positive selection)[12]。但由于同源重組的概率非常低，發(fā)生單交換的質(zhì)粒從基因組中切除較困難，給篩選工作帶來巨大的麻煩。Tamura等[13-14]首先使用反向選擇(counter-selection)來篩選疑似突變株，如將與蔗糖(sacB)或谷氨酰胺代謝相關(guān)的基因(glnQ)克隆至重組質(zhì)粒中，重組質(zhì)粒切除不成功的菌株在適當(dāng)?shù)孜镒饔孟赂弑磉_(dá)sacB或glnQ基因，導(dǎo)致毒性代謝產(chǎn)物堆積而生長(zhǎng)抑制，平板上不能形成克隆，重組質(zhì)粒與菌株基因組進(jìn)行二次交換，成功敲除靶基因的菌株生長(zhǎng)不受影響而更容易被篩選出來。但由于葡萄球菌基因組中含有與蔗糖和谷氨酰胺代謝相關(guān)的基因，不能通過基因sacB或glnQ的表達(dá)來反向選擇。

Arnaud等[15]成功構(gòu)建了可通過反向選擇來敲除葡萄球菌靶基因的重組質(zhì)粒pMAD。首先，用限制性內(nèi)切酶ClaI將質(zhì)粒pE194ts(pE194來源，溫度敏感型復(fù)制起始子)線性化，克隆至質(zhì)粒pBR322中，形成穿梭質(zhì)粒pE194ts：pBR322。在NruI和EcoRV之間插入3個(gè)PCR片段：1)從質(zhì)粒pMTL22來源的多克隆位點(diǎn)，NaeI和BglII的酶切片段；2)以金黃色葡萄球菌(S.aureusRN6390)基因組為模板，PCR擴(kuò)增clpB基因(編碼Clp-Hsp100 ATP酶)的啟動(dòng)子區(qū)，并加上BglII和BamHI酶切位點(diǎn)；3)嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillusstearothermophilus)不含啟動(dòng)子區(qū)的bgaB基因(編碼耐熱半乳糖苷酶)，BamHI和StuI的酶切片段。上述3個(gè)片段連接入質(zhì)粒pE194ts：pBR322，獲得重組質(zhì)粒pMAD(G-菌中氨芐青霉素抗性，G+菌中紅霉素抗性)。pMAD質(zhì)粒帶有pE194ts復(fù)制起始子(溫度敏感性)和bgaB基因，通過clpP啟動(dòng)子(pclpB)，編碼耐熱的半乳糖苷酶，在含X-gal平板上形成藍(lán)色菌落。這技術(shù)本身并不能影響同源重組的頻率，但對(duì)于質(zhì)粒丟失或從基因組中切除菌株的篩選非常有利。

3.2pMAD重組質(zhì)粒在葡萄球菌基因敲除中的應(yīng)用 Arnaud等[15]利用pMAD敲除金黃色葡萄球菌vraFG基因。PCR擴(kuò)增vraFG上/下游同源臂(約0.6 kb和0.9 kb)，壯觀霉素耐藥基因spc(1.3 kb，pIC333質(zhì)粒來源)，重組PCR將3個(gè)PCR片段克隆至pMAD，構(gòu)成重組質(zhì)粒pMAD△FG，經(jīng)鑒定后電擊轉(zhuǎn)入金黃色葡萄球菌(S.aureusMu3)。從TSA平板(含X-gal)上挑取1個(gè)藍(lán)色菌落轉(zhuǎn)接于無抗性TSB培養(yǎng)基，30 ℃震蕩培養(yǎng)2 h后變溫至42 ℃繼續(xù)培養(yǎng)6 h，取適量涂板于TSA(含X-gal和抗生素)，42 ℃過夜培養(yǎng)。壯觀霉素(100 g/mL)耐藥、紅霉素(5 g/mL)敏感的白色菌落即為vraFG疑似突變株。據(jù)統(tǒng)計(jì)，1%～5%白色菌落為敲除突變株，還有大量的淡藍(lán)色菌落，可能由于單交換重組后質(zhì)粒DNA與宿主菌基因組整合形成。作者還用pMAD敲除金黃色葡萄球菌sarA、sigB基因。

本實(shí)驗(yàn)室[16-17]用pMAD質(zhì)粒敲出表皮葡萄球菌SE1457雙組分系統(tǒng)saeRS。PCR擴(kuò)增saeRS上/下游同源臂(約1.0 kb和1.3 kb)，同源臂間連接壯觀霉素耐藥基因spc，酶切片段克隆至pMAD載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMAD△saeRS，轉(zhuǎn)入宿主菌SE1457中。挑取藍(lán)色單菌落于BM培養(yǎng)基(Spc 50 g/mL)，43.5 ℃震蕩培養(yǎng)24 h，取適量菌液涂于BM平板(含X-gal及抗生素)，43.5 ℃培養(yǎng)過夜，壯觀霉素耐藥，紅霉素敏感的無色菌落即為敲除突變株；涂板同時(shí)，轉(zhuǎn)種于新鮮BM培養(yǎng)基，相同條件下繼續(xù)震蕩培養(yǎng)，直至篩選出突變株為止。該技術(shù)通過藍(lán)白斑篩選，大大降低篩選的工作量，通常也需要1～2月可獲得突變株。

pMAD質(zhì)粒還可用于一些G+菌的基因敲除，如單核細(xì)胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)和蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)等[18-19]，但由于pE194來源的復(fù)制起始子在鏈球菌、腸球菌、乳球菌中不工作，限制了該質(zhì)粒的應(yīng)用。

4 pKOR1重組質(zhì)粒在葡萄球菌基因敲除中的應(yīng)用

pMAD質(zhì)粒的使用，通過顏色反應(yīng)更容易實(shí)現(xiàn)同源重組突變株的篩選，但該質(zhì)粒對(duì)重組概率及突變株篩選均無直接影響[15]。SecY是一種膜蛋白，屬于SecYEG轉(zhuǎn)位酶家族中的成分之一，能將含有前體蛋白的信號(hào)肽通過細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移至細(xì)胞外，與細(xì)胞蛋白的分泌密切相關(guān)，SecY的表達(dá)是細(xì)菌生長(zhǎng)所必需的[20-21]。因此，通過secY反義RNA的表達(dá)能夠抑制平板上菌落的形成。pKOR1重組質(zhì)粒就是利用secY反義RNA的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)對(duì)敲除突變株的反向選擇，大大地提高了同源重組的概率和突變株篩選的效率[21]。

4.1pKOR1重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其特點(diǎn) 為構(gòu)建secY反義RNA基因盒，通過PCR從金黃色葡萄球菌RN4220基因組中擴(kuò)增含有核糖體結(jié)合位點(diǎn)的secY基因(570 bp)，PCR產(chǎn)物經(jīng)SmaI酶切后反向插入pYJ335質(zhì)粒中Pxyl/tetO啟動(dòng)子的下游，形成重組質(zhì)粒p335Y-R，并將p335Y-R電擊轉(zhuǎn)入RN4220后，在脫水四環(huán)素(ATc)誘導(dǎo)作用下，平板上無克隆形成證實(shí)該質(zhì)粒中secY反義RNA能正常工作[22]。

PCR擴(kuò)增p335Y-R質(zhì)粒中反義secY基因盒，酶切后連接入pTS1質(zhì)粒，形成pTS1-HF質(zhì)粒(含四環(huán)素抗性基因tetR，同時(shí)含有與復(fù)制基因rep轉(zhuǎn)錄相反的secY基因)。PCR擴(kuò)增pDONR221質(zhì)粒(Invitrogen)噬菌體基因盒，經(jīng)T4 DNA聚合酶和多聚核苷酸激酶處理后插入pTS1-HF質(zhì)粒(破壞了抗性標(biāo)記cat基因)，形成pHF-ccd質(zhì)粒。PCR擴(kuò)增pC194質(zhì)粒中的cat基因，克隆至pHF-ccd質(zhì)粒，形成重組質(zhì)粒pKOR1。

pKOR1質(zhì)粒具有噬菌體基因盒(Gateway technology, Invitrogen)，不需要限制性內(nèi)切酶和連接酶即能實(shí)現(xiàn)同源序列的快速克隆。重組盒子有2個(gè)關(guān)鍵成分(attP位點(diǎn)和ccdB位點(diǎn))。在噬菌體整合酶和大腸桿菌整合宿主因子(E.coliintegration host factor, IHF)的作用下，attP序列能與DNA插入序列上的attB序列進(jìn)行重組，形成新的重組質(zhì)粒。ccdB基因編碼大腸桿菌解旋酶抑制劑，當(dāng)DNA片段與pKOR1整合后，重組形成的pKOR1質(zhì)粒丟失ccdB基因，重組子生長(zhǎng)不受影響而大量增殖；整合不成功的pKOR1質(zhì)粒，通過ccdB基因的表達(dá)生長(zhǎng)受到抑制，簡(jiǎn)化了重組質(zhì)粒pKOR1的構(gòu)建。

4.2pKOR1重組質(zhì)粒在葡萄球菌基因敲除中的應(yīng)用 Bae等[22]在不使用抗性標(biāo)記的條件下，用pKOR1質(zhì)粒對(duì)金黃色葡萄球菌(S.aureusNewman)rocA進(jìn)行框內(nèi)敲除(in-frame deletion，即基因敲除范圍限于開放讀碼框內(nèi))。PCR分別擴(kuò)增(引物5′端加上attB序列)金黃色葡萄球菌rocA基因上/下游同源臂(約1.0 kb)，同源臂片段間通過SacII連接后直接與pKOR1質(zhì)粒進(jìn)行重組(BP ClonaseTMenzyme mix, Invitrogen)，獲得重組質(zhì)粒pKOR1-△rocA，電擊轉(zhuǎn)化入金黃色葡萄球菌中，得到菌株NM(pKOR1-△rocA)。菌株NM(pKOR1-△rocA)過夜培養(yǎng)物1∶1 000接種于預(yù)熱TSB(Cm 10 g/mL)，43 ℃(非容許溫度，質(zhì)粒DNA整合至宿主菌基因組中)震蕩培養(yǎng)過夜，取適量劃線接種于TSA(預(yù)熱，Cm 7.5 g/mL)，43 ℃培養(yǎng)過夜。挑取1個(gè)菌落接種于TSB(含Cm 10 g/mL)，30 ℃培養(yǎng)過夜。取適量菌液稀釋(10-4)后分別涂于不同脫水四環(huán)素濃度TSA平板(ATc=0, 1, 2 g/mL)，30 ℃培養(yǎng)2 d。在不含ATc的TSA平板上有大量的菌落形成，在ATc為2 g/mL TSA平板上無菌落形成(可能是葡萄球菌的最低抑菌濃度)，1 g/mL TSA平板上約1%的細(xì)胞形成菌落，菌落大小不一，提示1 g/mL ATc是誘導(dǎo)反義secYRNA表達(dá)，選擇pKOR1質(zhì)粒缺失菌株的最佳濃度。隨機(jī)挑選10個(gè)疑似突變株，經(jīng)PCR驗(yàn)證8株成功敲除rocA基因(獲得突變株效率80%)。作者比較了傳統(tǒng)pTS1質(zhì)粒和pKOR1質(zhì)粒在金黃色葡萄球菌prsA基因敲除中的效率，前者介導(dǎo)的同源重組中，累積7000個(gè)單交換整合的菌株中均未篩選出prsA突變株；后者介導(dǎo)同源重組概率約4%，進(jìn)一步提示pKOR1是葡萄球菌同源重組敲除靶基因效率較高的質(zhì)粒。

本實(shí)驗(yàn)室[23-25]利用pKOR1成功敲除表皮葡萄球菌(SE1457)呼吸相關(guān)雙組分系統(tǒng)srrAB、萬古霉素耐藥相關(guān)雙組分系統(tǒng)vraSR、磷酸鹽代謝調(diào)節(jié)子phoU以及聚集生物膜形成調(diào)節(jié)子abfR基因等，敲除效率約30%～80%。此外，還用pKOR1成功敲除金黃色葡萄球菌臨床株(SA75)附屬基因調(diào)節(jié)子agr[26]。一般1～2周可獲得敲除突變株。

5 結(jié) 語

利用同源重組技術(shù)進(jìn)行基因敲除是研究單基因功能的理想方法，該技術(shù)在G-桿菌中應(yīng)用非常廣泛，如大腸桿菌中噬菌體Red同源重組系統(tǒng)，該系統(tǒng)所需同源臂小(40～60 bp)，可以直接設(shè)計(jì)在引物上，重組效率高。葡萄球菌是常見的G+球菌代表，由于細(xì)胞結(jié)構(gòu)及胞內(nèi)酶系統(tǒng)的差異，導(dǎo)致基因敲除效率較G-桿菌困難。本室常采用以質(zhì)粒為基礎(chǔ)的同源重組技術(shù)來敲除葡萄球菌的致病基因，不同實(shí)驗(yàn)者或同一實(shí)驗(yàn)者敲除不同的靶基因，敲除效率差別很大。據(jù)報(bào)道，宿主菌的生長(zhǎng)時(shí)相，培養(yǎng)基的類型，篩選溫度及同源臂大小等因素均可影響敲除效率，但尚不清楚敲除效率與上述因素的直接量效關(guān)系。通常情況下，選擇TSB或BM培養(yǎng)基；常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)選擇37 ℃，質(zhì)粒DNA整合入宿主基因組溫度為42 ℃～43 ℃，質(zhì)粒切除或丟失溫度為30 ℃；同源臂大小約1 kb左右(0.3～2.0 kb)。早期使用pBT2質(zhì)粒進(jìn)行同源重組，通過抗性基因正向選擇突變株，pMAD引入顯色系統(tǒng)，通過反向選擇，更容易篩選突變株，亦可加入抗性標(biāo)記；pKOR1質(zhì)粒用于同源重組，克隆構(gòu)建便捷，并通過secY反義RNA的表達(dá)來反向篩選突變株，敲除效率最高，且不需引入抗性基因，不改變宿主菌遺傳背景，是葡萄球菌基因敲除的理想選擇。

利益沖突：無

引用本文格式：武有聰，孟媛媛，丁百興，等.以質(zhì)粒為基礎(chǔ)的同源重組技術(shù)在葡萄球菌基因敲除中的應(yīng)用[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2019，35(7)：580-586. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.69