低氧模擬劑預(yù)處理提高預(yù)構(gòu)皮瓣成活率的實(shí)驗(yàn)研究

李玢 程辰 李華 昝濤

預(yù)構(gòu)皮瓣是指通過(guò)在皮瓣內(nèi)植入軸型血管，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的再血管化后，將隨意皮瓣變?yōu)檩S型血管皮瓣。皮瓣預(yù)構(gòu)技術(shù)不僅能擴(kuò)大游離皮瓣供區(qū)的選擇，還能夠按照一定的設(shè)計(jì)和構(gòu)想，將皮瓣改造成具有一定功能和特性的皮瓣，使其更便于修復(fù)大面積器官缺損，尤其適合面頸部大面積燒傷后的重建[1]。該技術(shù)結(jié)合皮膚軟組織擴(kuò)張器的運(yùn)用，能夠形成一面積大、厚度薄、色澤質(zhì)地與頭面部較為接近的軸型皮瓣，用于全面部燒傷的重建[2]。

盡管預(yù)構(gòu)皮瓣已是修復(fù)復(fù)合缺損的理想手段，但是皮瓣壞死的風(fēng)險(xiǎn)仍是亟待解決的問(wèn)題。作為人為制造的軸型皮瓣，預(yù)構(gòu)皮瓣的有效血運(yùn)范圍很難預(yù)估，其存活依賴(lài)于植入血管與受區(qū)組織的再血管化。因此，促進(jìn)預(yù)構(gòu)皮瓣的再血管化，可提高其存活率并減少并發(fā)癥。

許多因素都能促進(jìn)組織再血管化，組織缺氧是血管新生最重要的刺激因素，血管新生本身就是組織對(duì)抗低氧的一種表現(xiàn)。在組織創(chuàng)傷、失血、缺氧等病理狀態(tài)下，機(jī)體組織的低氧誘導(dǎo)因子（Hypoxia Inducing Factor,HIF）轉(zhuǎn)錄活性上調(diào)，其下游所調(diào)控的效應(yīng)蛋白中有很大一部分是與血管化相關(guān)的細(xì)胞因子,如VEGF等，可促進(jìn)機(jī)體新生血管，以獲得更多的氧供[3]。而HIF的活性，是由脯氨酸羥化酶（prolyl hydroxylase domain-containing enzymes,PHDs）起總調(diào)控作用，其中尤以PHD2對(duì)HIF-1α的調(diào)控最為重要[4]。PHD2是一個(gè)能感受環(huán)境氧濃度的分子，在亞鐵離子和抗壞血酸的輔助下，可直接感受氧濃度的變化并作出反應(yīng)，能通過(guò)將脯氨酸羥化抑制HIF-1α的活性，發(fā)揮一系列重要的生物學(xué)效應(yīng)，如血管新生、紅細(xì)胞增多等，來(lái)對(duì)抗組織的缺血、缺氧狀態(tài)，在機(jī)體組織氧代謝平衡中起核心調(diào)控作用[5]。文獻(xiàn)證實(shí)，使用基因治療手段將PHD2基因抑制，可提高細(xì)胞HIF-1α轉(zhuǎn)錄水平，促進(jìn)血管新生，提高缺血下肢抵抗缺氧的能力，并且這種作用是通過(guò)HIF-1α介導(dǎo)的[6]。有研究認(rèn)為，利用ADSC治療能有效促進(jìn)預(yù)構(gòu)皮瓣血管化，并觀察到治療后預(yù)構(gòu)皮瓣VEGF水平增高[7]。 去鐵胺（Defetoxamine，DFO）是一種鐵離子螯合劑，而PHD2發(fā)揮生物活性需鐵離子作為共同底物，所以螯合鐵離子能夠抑制PHD2的活性[8-9]。文獻(xiàn)證實(shí)，利用低氧模擬劑去鐵胺能夠促進(jìn)隨意皮瓣的成活，降低缺血壞死的發(fā)生率，并且組織細(xì)胞的VEGF水平和細(xì)胞增殖活力在DFO干預(yù)后明顯提高[10]。文獻(xiàn)報(bào)道，應(yīng)用PHD抑制劑DMOG在小鼠缺血皮瓣模型上，可觀察到防止皮瓣缺血壞死的治療效果[11]。因此，如能證實(shí)DFO促進(jìn)預(yù)構(gòu)皮瓣血管化，有可能為預(yù)構(gòu)皮瓣更加安全地運(yùn)用于臨床增添一種輔助手段，有利于預(yù)構(gòu)皮瓣技術(shù)在基層醫(yī)院的推廣。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

雄性 Wistar大鼠，8～12 周齡，體質(zhì)量 280～300g（上海斯萊克公司）。所購(gòu)動(dòng)物飼養(yǎng)于華東師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（SPF級(jí)別），常規(guī)分籠飼養(yǎng)。注射用甲磺酸去鐵胺 （商品名得斯芬，Novartis Pharma Stein AG,Switzerland）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠腹部預(yù)構(gòu)皮瓣模型的建立

建立大鼠腹部預(yù)構(gòu)皮瓣模型：一期手術(shù)時(shí)將股動(dòng)、靜脈血管束植入腹壁皮下進(jìn)行預(yù)構(gòu)（圖1）。4周后（二期）掀起以預(yù)構(gòu)的血管束為蒂的島狀皮瓣，原位縫合（圖 2）。

圖1 大鼠腹部預(yù)構(gòu)皮瓣一期手術(shù)示意圖Fig.1 Surgical procedures of flap prefabrication on a rat model:stage I

圖2 大鼠腹部預(yù)構(gòu)皮瓣二期手術(shù)示意圖Fig.2 Surgical procedures of flap prefabrication on a rat model:stage II

1.2.2 實(shí)驗(yàn)干預(yù)及分組

造模成功的大鼠隨機(jī)分為 4組 （n=13）：①對(duì)照組，無(wú)干預(yù)；②去鐵胺腹腔注射組：一期術(shù)中及術(shù)后3 d給予腹腔注射去鐵胺（20 mg/Kg）；③去鐵胺皮下注射組：一期術(shù)中及術(shù)后3 d在轉(zhuǎn)位的血管蒂周?chē)共科は伦⑸淙ヨF胺（20 mg/Kg）；④延遲組：在二期手術(shù)前一周，按照二期手術(shù)的切口設(shè)計(jì)（圖3），將大鼠腹部?jī)蓚?cè)的縱行皮膚切口切開(kāi)并原位縫合。

圖3 二期手術(shù)前延遲切口示意圖Fig.3 Delay procedure before the 2ndstage operation

1.2.3 預(yù)構(gòu)皮瓣成活率評(píng)估

預(yù)構(gòu)皮瓣二期術(shù)后即刻，用半透明紙拓下皮瓣面積，作為預(yù)構(gòu)皮瓣的總面積；二期手術(shù)后第5～7天，當(dāng)壞死區(qū)域界限明顯時(shí)，將大鼠麻醉處死，以半透明紙拓下皮瓣存活面積。皮瓣壞死標(biāo)準(zhǔn)為皮瓣的顏色變黑、組織回縮、質(zhì)地變硬或液化壞死形成創(chuàng)面。照片用Image Pro Plus軟件分析面積，存活面積除以皮瓣總面積即為皮瓣存活率。

1.2.4 皮瓣微血管密度計(jì)數(shù)

在評(píng)估完皮瓣成活率之后，將皮瓣切下，切取植入的股血管束末端近旁成活的皮瓣組織，在10%中性甲醛緩沖液中固定24 h，而后置于30%蔗糖溶液中脫水48 h，PBS沖洗，75%乙醇浸泡保存。脫水、石蠟包埋，垂直于皮瓣平面連續(xù)切片（厚度8 μm，使用防脫片劑），VEGF免疫組化染色，鏡下觀察：每個(gè)皮瓣選擇一張靠近皮瓣中間位置的切片，隨機(jī)選擇一個(gè)視野計(jì)數(shù)染色陽(yáng)性的血管數(shù)量。

1.2.5 大鼠皮膚成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)

選取出生7 d內(nèi)的Wistar大鼠，處死后75%乙醇浸泡15 min消毒。將老鼠皮膚浸入0.2%中性蛋白酶溶液中，4℃過(guò)夜。次日小心剝除表皮組織，將真皮組織充分切碎，經(jīng)37℃，0.2%膠原酶充分消化。過(guò)濾后離心，重懸沉淀于含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)80%～90%時(shí)，以1∶3或1∶4的比例傳代。

1.2.6 大鼠皮膚成纖維細(xì)胞去鐵胺干預(yù)及定量PCR分析

第2代的大鼠皮膚成纖維細(xì)胞加入去鐵胺進(jìn)行聯(lián)合培養(yǎng)，培養(yǎng)至80%以上融合時(shí)，提取RNA行定量PCR檢測(cè)，與單獨(dú)培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞比較。所使用 的 引 物 序 列 如 下 ：NF-KB-Forward，5'CATGCGTTTCCGTT ACAAGTGCGA3'；NF-KB-Reverse，5'TGGGTGCGTCTTAGTGGTATCTGT3'；ANG-Forward，5'AATGGCTAGACATACCCAGCA3'；ANG-Reverse，5'GCCTAAGCAGTTCACTTCCAC3'；GAPDH-Forward，5'AATGGATTTGGACGCATTGGT3'；GAPDH-Reverse，5'TTTGCACTGGTACGTGTTGAT3'；VEGF-Forward，5'CAACGTCACTATGCAGATCATGCG3'；VEGF-Reverse，5'GGTCTAGTTCCCGAAACCCTGAG3'；PHD2-Forward，5'GATGCCCAGAAGCACGATGT 3'；PHD2-Reverse，5'TAGAGAGTCTCGAACTCGCAG 3'。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。皮瓣成活率及PCR實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用（x±s）來(lái)表示，組間差異比較：當(dāng)方差齊時(shí)，采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；若方差不齊，則采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，多重檢驗(yàn)校正采用Bonferroni校正，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。皮瓣血管計(jì)數(shù)采用中位數(shù)Median（P25，P75）進(jìn)行描述，多組間差異比較采用Kruskal Wallis檢驗(yàn)，兩兩組間比較采用Mann-Whitney檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 預(yù)構(gòu)皮瓣成活率對(duì)比

預(yù)構(gòu)皮瓣二期術(shù)后第5天左右，壞死面積已穩(wěn)定清晰，此時(shí)描記皮瓣存活面積，行皮瓣存活率分析，結(jié)果顯示：去鐵胺皮下注射和腹腔注射組的皮瓣存活率皆高于對(duì)照組（P＜0.001），與延遲組療效相當(dāng)，且兩種給藥方式的療效無(wú)明顯差異（P=0.104）。各組的皮瓣成活率：對(duì)照組為26.66%±8.85%；DFO腹腔注射組為 52.48%±11.49%；DFO皮下注射組為60.83%±9.59%；手術(shù)延遲組為 51.74%±20.51%（圖4）。

圖4 去鐵胺治療后各組預(yù)構(gòu)皮瓣的成活率(*P<0.001)Fig.4 Comparison of flap survival rate among groups after DFO treatment(*P<0.001)

2.2 預(yù)構(gòu)皮瓣微血管計(jì)數(shù)對(duì)比

鏡下觀察，注射了去鐵胺的實(shí)驗(yàn)組其血管口徑較對(duì)照組要粗，而延遲組血管數(shù)目明顯多于其他3組，但口徑較細(xì)（圖5）。

圖5 大鼠預(yù)構(gòu)皮瓣VEGF免疫組化染色（40×）Fig.5 Immunohistochemistry staining of VEGF for the prefabricated flaps(40×)

各組血管計(jì)數(shù)的結(jié)果使用中位數(shù)（P25，P75）進(jìn)行描述，對(duì)照組、腹腔用藥組、皮下給藥組及手術(shù)延遲組的血管計(jì)數(shù)分別為：1（1，2）、3（2，5.5）、5.5（4，7）和20.5（14.25，33）。各組間兩兩比較血管密度計(jì)數(shù)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

2.3 體外實(shí)驗(yàn)PCR結(jié)果

定量PCR結(jié)果：經(jīng)去鐵胺處理的大鼠成纖維細(xì)胞，其PHD2的表達(dá)明顯降低；同時(shí)，促血管化因子HIF-1α、VEGF 和 NF-κ B 的表達(dá)明顯上調(diào)（圖 6）。

圖6 大鼠皮膚成纖維細(xì)胞PCR結(jié)果（*P<0.01;**P<0.001）Fig.6 Quantitative-PCR assay of the rat fibroblasts（*P<0.01;**P<0.001）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在預(yù)構(gòu)皮瓣一期手術(shù)時(shí)應(yīng)用低氧模擬劑去鐵胺，可促進(jìn)預(yù)構(gòu)皮瓣的血管化，提高預(yù)構(gòu)皮瓣的生存活力，其效果相當(dāng)于在預(yù)構(gòu)皮瓣二期手術(shù)之前進(jìn)行了一次延遲手術(shù)。這個(gè)發(fā)現(xiàn)具有很好的臨床價(jià)值和意義：首先，實(shí)驗(yàn)中所使用的去鐵胺是臨床已應(yīng)用多年的藥物，是治療地中海貧血的一線藥物，很多患者需終身用藥，無(wú)明顯毒副作用及對(duì)重要臟器的損害。因此，相比其他促進(jìn)血管化的方法（細(xì)胞治療、基因治療、細(xì)胞因子等），是更加安全、簡(jiǎn)便、可行的方法，易于普及，能促進(jìn)預(yù)構(gòu)皮瓣技術(shù)的推廣。其次，臨床上大面積皮瓣轉(zhuǎn)移之前，為了保證皮瓣的存活，常先給予延遲手術(shù)，增強(qiáng)皮瓣血流之后再行皮瓣轉(zhuǎn)移術(shù)，給患者增加了手術(shù)痛苦，也多占用了醫(yī)療資源，而且由于延遲手術(shù)的切口范圍是憑借經(jīng)驗(yàn)估計(jì)的，有可能在真正的皮瓣轉(zhuǎn)移術(shù)中會(huì)發(fā)現(xiàn)皮瓣的面積不足以覆蓋受區(qū)缺損等尷尬局面，甚至有將皮瓣的重要側(cè)支循環(huán)切斷，使其失去supercharge增強(qiáng)血流的機(jī)會(huì)的可能。而本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證實(shí)預(yù)構(gòu)一期手術(shù)時(shí)給予去鐵胺，效果相當(dāng)于二期手術(shù)前做了一次延遲。

低氧模擬劑預(yù)處理對(duì)組織細(xì)胞抗缺血缺氧能力的提高在多種動(dòng)物模型中已有報(bào)道，同類(lèi)研究一般都在組織缺血損傷之前用藥，而本實(shí)驗(yàn)則在一期預(yù)構(gòu)皮瓣的術(shù)中及術(shù)后用藥。因?yàn)轭A(yù)構(gòu)皮瓣 （一期手術(shù)）模型與其他（如下肢缺血、心肌梗死、隨意皮瓣等）缺血模型有一個(gè)顯著的不同，即造模后組織不發(fā)生壞死，也就是說(shuō)模型本身對(duì)組織造成的缺血、缺氧損傷程度較輕。在其他模型中，若在組織已經(jīng)發(fā)生缺氧損傷后用藥，存在加重組織缺血壞死的顧慮，而在預(yù)構(gòu)皮瓣（一期手術(shù)）模型中則不存在這樣的顧慮。相較以往的預(yù)構(gòu)皮瓣動(dòng)物模型[7,12]，本實(shí)驗(yàn)改進(jìn)了一期手術(shù)的切口設(shè)計(jì)，使之更符合臨床應(yīng)用的設(shè)計(jì)方式，對(duì)腹部皮瓣造成的破壞更小，更加不存在術(shù)后缺血壞死的可能，所以我們可以在術(shù)中甚至術(shù)后給予去鐵胺干預(yù)，這種差異是動(dòng)物模型的不同造成的。

本實(shí)驗(yàn)中，皮瓣存活率的對(duì)比和血管計(jì)數(shù)的對(duì)比結(jié)果不完全一致：皮瓣成活率對(duì)照組與其他3組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。不論是皮下注射還是腹腔注射去鐵胺，亦或在二期手術(shù)前先進(jìn)行延遲，其皮瓣存活率均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；然而，血管計(jì)數(shù)的結(jié)果顯示4組之間兩兩比較都是有差異的，這提示我們，血管計(jì)數(shù)的結(jié)果并不一定能完全反映最終的皮瓣活力與治療效果。此外，我們還發(fā)現(xiàn)兩個(gè)有趣的現(xiàn)象。首先，經(jīng)過(guò)治療處理的實(shí)驗(yàn)組，不論使用的是去鐵胺還是手術(shù)延遲，其微血管的口徑都普遍比對(duì)照組粗，也就是說(shuō)這些干預(yù)治療措施都刺激了小血管擴(kuò)張。其次，手術(shù)延遲組的毛細(xì)血管數(shù)量明顯多于另外2組，大量的細(xì)小血管出現(xiàn)在延遲組的組織切片上，推測(cè)這是由于延遲主要引起了choke vessel的開(kāi)放所致?？梢?jiàn)，雖然低氧模擬劑與手術(shù)延遲都能起到相同的促進(jìn)預(yù)構(gòu)皮瓣血管化的效果，但其作用機(jī)理是不同的：延遲主要是通過(guò)開(kāi)放choke vessel，增加側(cè)枝血流，重塑皮瓣內(nèi)部的血流方向來(lái)增加皮瓣的血流，同時(shí)也存在小血管口徑的增粗；而低氧模擬劑則主要通過(guò)刺激小血管口徑增粗來(lái)增強(qiáng)皮瓣的血流。這個(gè)現(xiàn)象通過(guò)低氧模擬劑的信號(hào)傳導(dǎo)通路也較容易理解。去鐵胺螯合鐵離子，能夠競(jìng)爭(zhēng)性地抑制PHD2活性，導(dǎo)致HIF-1α的快速堆積，轉(zhuǎn)錄活性升高，引起下游的一系列效應(yīng)分子的表達(dá)水平上調(diào)和釋放，其中最有代表性的就是VEGF，而VEGF的作用之一就是強(qiáng)烈地?cái)U(kuò)張小血管平滑肌，增加血管通透性。通過(guò)低氧模擬劑的這種作用通路，亦可表明其相對(duì)于細(xì)胞因子的優(yōu)越性：細(xì)胞因子是單一的下游效應(yīng)分子，而低氧模擬劑則調(diào)控了處于血管化最上游的開(kāi)關(guān)PHD分子，能引起一系列級(jí)聯(lián)式反應(yīng)，其作用更加均衡、全面；此外，細(xì)胞因子是蛋白制劑，成本高，價(jià)格昂貴，還存在過(guò)敏反應(yīng)可能；而去鐵胺是化學(xué)藥物，成本低廉，易存貯和運(yùn)輸，應(yīng)用安全性相對(duì)較高。

4 結(jié)論

使用低氧模擬劑去鐵胺，在預(yù)構(gòu)皮瓣一期手術(shù)時(shí)運(yùn)用，能顯著提高預(yù)構(gòu)皮瓣的血管化并增強(qiáng)皮瓣活力，其作用相當(dāng)于在二期皮瓣轉(zhuǎn)位前進(jìn)行了一次延遲手術(shù)。