室旁核IL-1β介導(dǎo)CRH神經(jīng)元敏化參與大鼠慢性內(nèi)臟痛

陳自洋 饒竹青 孫曉迪 李競進

（南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科，南京 210009）

慢性內(nèi)臟痛是多因素導(dǎo)致的高發(fā)性和頑固性疾病，嚴(yán)重影響患病人的生活質(zhì)量且耗費大量醫(yī)療資源[1]。由于引起慢性內(nèi)臟痛的確切分子生物學(xué)機制尚不清楚，目前臨床仍缺乏有效的藥物治療。下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸(hypothalamic-pituitary-adrenal, HPA)是聯(lián)系腦和腸道的關(guān)鍵軸，參與腸道功能調(diào)控，HPA軸功能亢進可導(dǎo)致慢性內(nèi)臟痛病人內(nèi)臟高敏[2]。促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotrophin-releasing hormone, CRH)是HPA軸最高級中樞下丘腦室旁核(paraventricular nucleus, PVN)分泌的重要應(yīng)激激素，且參與慢性內(nèi)臟痛調(diào)控[3,4]。研究顯示，PVN內(nèi)CRH神經(jīng)元敏化介導(dǎo)了慢性內(nèi)臟痛的發(fā)生與發(fā)展，但觸發(fā)PVN內(nèi)CRH神經(jīng)元敏化的上游分子機制仍不明確。IL-1β是重要的促炎性細(xì)胞因子，在慢性疼痛的產(chǎn)生與維持過程中發(fā)揮重要作用，其主要通過增加神經(jīng)元的興奮性導(dǎo)致中樞敏化[5～7]。本文主要目的是首先觀察PVN內(nèi)IL-1β在慢性內(nèi)臟痛中的作用，探討PVN內(nèi)IL-1β是否敏化CRH神經(jīng)元，從而參與慢性內(nèi)臟痛的調(diào)節(jié)，進而明確IL-1β是CRH神經(jīng)元敏化的上游分子，為臨床慢性內(nèi)臟痛的防治提供新靶點及理論依據(jù)。

方 法

1.動物選擇及分組

本研究獲南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心倫理委員會批準(zhǔn)。清潔級健康雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠32只，8日齡，采用隨機數(shù)字表法分為4組(n= 8)：假手術(shù)+ PBS組（Sham + PBS組）、假手術(shù) + IL-1β抑制劑組（Sham + Gevokizumab組）、模型+ PBS組（CRD + PBS組）、模型+ IL-1β抑制劑組（CRD + Gevokizumab組）。同窩子鼠平均分入各組，Sham組大鼠不進行結(jié)直腸擴張，CRD組制備大鼠慢性內(nèi)臟痛模型；出生后第8周，通過立體定位法室旁核微量注射0.5 μl的IL-1β抑制劑Gevokizumab 5 μg或PBS，2 h后測定內(nèi)臟痛閾值；所有新生大鼠均與母鼠同籠直到第28 d，鼠乳喂養(yǎng)。母嬰分離后，每4只子鼠1籠，保持室溫23±1℃及12 h/12 h明暗光照，自由進食和進水。于出生后第8周評估大鼠內(nèi)臟痛行為。

2.主要試劑和儀器

小鼠抗大鼠CRH（100 μg，35748，Abcam公司，美國），Alexa 488 驢抗鼠 IgG （500 μl，A21202，Life Technologies公司，美國），兔抗大鼠c-Fos（100 μl，190289，Abcam公司，美國），Alexa594驢抗兔IgG（500 μl，A21207，Life Technologies公司，美國），IL-1β抑制劑Gevokizumab（052，XOMA公司，美國），熒光顯微鏡（Olympus IX-81，日本），鼠腦立體定位儀（瑞沃德，深圳）。

3.慢性內(nèi)臟痛模型制備

參照文獻[8]，通過對新生期大鼠反復(fù)結(jié)直腸擴張(colorectal distension, CRD)制備慢性內(nèi)臟痛模型。新生大鼠于出生后第8、10、12 d，每天上午固定時間給予兩次結(jié)直腸擴張，兩次時間間隔30 min。結(jié)直腸擴張是將直徑3 mm，長20 mm的血管成形術(shù)導(dǎo)管從肛門插入至清醒新生大鼠的降結(jié)腸，用0.3 ml水?dāng)U張產(chǎn)生60 mmHg的壓力在結(jié)腸內(nèi)留置1 min后，將其減壓退出。Sham組大鼠除未進行結(jié)直腸擴張外，其它操作均與CRD組相同。

4.PVN內(nèi)微量注射

各組大鼠飼養(yǎng)到第8周，體重200～250 g，七氟醚麻醉后，取仰臥位固定，備皮，碘伏消毒，固定于腦立體定位儀上，沿正中線切開頭皮，骨膜，在相應(yīng)位置用手術(shù)刀片縱行切開一個長切口，雙氧水脫去骨膜，通過立體定位儀定位，亞甲藍標(biāo)記后用消毒過的微型鉆頭鉆孔，術(shù)野滴少量人工腦脊液以防干燥。通過立體定位儀分別將載有IL-1β抑制劑Gevokizumab或 PBS 0.5 μl的微量注射器針尖緩慢（約1 min）插至下丘腦PVN (AP -1.6 mm,R ± 0.4 mm, H -7.8 mm)，緩慢（約3 min）注射藥物，留針10 min后緩慢（約1 min）拔出針尖。骨蠟封閉鉆孔，縫合傷口，并用抗生素處理。

5.痛閾測定

大鼠出生后第8周，PVN內(nèi)給藥后2 h時，七氟醚麻醉后，將未充氣的球囊涂石蠟油后插入結(jié)直腸內(nèi)，將大鼠放置在20 cm×6 cm×8 cm的玻璃箱內(nèi)觀察，約15 min大鼠完全適應(yīng)后開始實驗。壓力擴張范圍10 mmHg～80 mmHg，每次擴張壓力重復(fù)3次，取平均值，通過注射器持續(xù)、勻速緩慢加壓，每10 mmHg為一壓力梯度，每個壓力停留10 s，間隔4 min，以肉眼觀察出現(xiàn)明顯的下腹壁抬離箱底或明顯收縮變平時的最小壓力為痛閾。

6.免疫熒光染色檢測

內(nèi)臟痛行為學(xué)測試結(jié)束后，七氟醚麻醉大鼠，迅速開胸暴露心臟經(jīng)升主動脈插管，依次灌注0.9%生理鹽水200 ml及4%多聚甲醛300 ml，大鼠灌注后取腦，多聚甲醛后固定于4 ℃ 過夜，然后放入30%蔗糖中脫水。腦組織冠狀冰凍連續(xù)切片（厚度30 μm），貼片室溫晾干后 PBS 漂洗，用含有0.3%Triton X-100的10%驢血清室溫封閉2 h，加入兔抗大鼠c-Fos抗體以及小鼠抗大鼠CRH抗體，4℃孵育過夜后，PBS漂洗10 min×3 遍，暗室內(nèi)加入Alexa 594驢抗兔IgG和Alexa 488驢抗鼠IgG，二抗室溫孵育2 h，PBS漂洗10 min×5遍，室溫避光晾干后，無水甘油封片，IX-81共聚焦顯微鏡下觀察拍片、計數(shù)。

7.統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜ 0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.PVN內(nèi)微量注射IL-1β抑制劑Gevokizumab對大鼠內(nèi)臟痛行為的影響

與Sham + PBS組(59.1±4.2)、Sham + Gevokizumab組(55.9±3.8)相比，CRD + PBS組(38.3±3.1)大鼠痛閾值明顯降低（P＜ 0.05，見圖1）；CRD +Gevokizumab組(46.2±4.3)較CRD + PBS組大鼠痛閾值明顯增加（P＜ 0.05，見圖1）。表明PVN內(nèi)IL-1β參與了大鼠慢性內(nèi)臟痛的調(diào)節(jié)。

圖1 各組大鼠痛閾值比較(n = 8,±SD)*P ＜ 0.05，與 Sham + PBS 組、Sham + Gevokizumab組相比；#P ＜ 0.05，與CRD + PBS組相比Fig.1 Comparison of pain thresholds in rats of different groups (n = 8,±SD)*P ＜ 0.05, compared with Sham + PBS group and Sham + Gevokizumab group; #P ＜ 0.05, compared with CRD + PBS group.

2.PVN內(nèi)微量注射IL-1β抑制劑Gevokizumab對c-Fos表達的影響

c-Fos是神經(jīng)元活化的標(biāo)志物，免疫熒光結(jié)果 顯 示， 與 Sham + PBS組 (61.2±8.1)、Sham +Gevokizumab組 (60.5±5.3)相 比，CRD + PBS組(101.3±8.9)大鼠PVN內(nèi)c-Fos表達明顯增加（P＜0.05，見圖2）；CRD + Gevokizumab (80.8±4.8)組較CRD + PBS組大鼠c-Fos表達明顯降低（P＜ 0.05，見圖2）。表明PVN內(nèi)IL-1β介導(dǎo)神經(jīng)元敏化參與了大鼠慢性內(nèi)臟痛的調(diào)節(jié)。

3.PVN內(nèi)微量注射IL-1β抑制劑Gevokizumab對CRH神經(jīng)元敏化的影響

免疫熒光結(jié)果顯示，與Sham + PBS組(26.5±3.3)、Sham + Gevokizumab 組 (23.8±4.0)相比，CRD + PBS組 (58.2±6.5)大 鼠 PVN內(nèi) CRH與c-Fos共標(biāo)比例明顯增加（P＜ 0.05，見圖3）；CRD + Gevokizumab組 (42.1±3.4)較 CRD + PBS組大鼠CRH與c-Fos共標(biāo)比例明顯降低（P＜ 0.05，見圖3）。表明PVN內(nèi)IL-1β介導(dǎo)CRH神經(jīng)元敏化參與了大鼠慢性內(nèi)臟痛的調(diào)節(jié)。

討 論

隨著人們對高質(zhì)量生活的追求，內(nèi)臟性疼痛被更多的人們所重視。早期不良生活經(jīng)歷是導(dǎo)致成年后慢性內(nèi)臟痛的重要因素，尤其是新生期，為傷害性感覺神經(jīng)回路發(fā)育的關(guān)鍵時期，此時的傷害性刺激可以導(dǎo)致新生個體神經(jīng)傳入通路永久性的改變[9]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，慢性內(nèi)臟痛病人與健康對照受試者相比，多有童年期不良生活應(yīng)激的經(jīng)歷[10]。動物實驗也顯示，大鼠新生期CRD可導(dǎo)致其成年后慢性內(nèi)臟高敏，是慢性內(nèi)臟高敏的常用動物模型[11]。

大腦與遠(yuǎn)離它的腸道有豐富的網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系，其中HPA軸是聯(lián)系腦和腸道的關(guān)鍵環(huán)節(jié)， HPA軸持續(xù)亢進，可導(dǎo)致外周腸道釋放多種促炎介質(zhì)，激活內(nèi)臟痛覺傳導(dǎo)通路，從而引起慢性內(nèi)臟痛[2]。HPA軸的最高級中樞位于PVN，既往研究顯示PVN區(qū)是調(diào)控疼痛的關(guān)鍵腦區(qū)，在神經(jīng)病理性疼痛、炎性疼痛中發(fā)揮重要作用[12,13]。最近研究發(fā)現(xiàn)，PVN區(qū)也參與了慢性內(nèi)臟痛的調(diào)控[7]。目前大量研究證實，PVN內(nèi)CRH神經(jīng)元敏化是慢性內(nèi)臟痛發(fā)病的重要機制[3,4,7]，但介導(dǎo)CRH神經(jīng)元敏化的上游分子機制尚不明確。

促炎細(xì)胞因子可以增強其周圍神經(jīng)元的興奮性，產(chǎn)生興奮后突觸后電位，導(dǎo)致慢性疼痛的產(chǎn)生與維持[5]。其中IL-1β是一種典型的多功能促炎細(xì)胞因子，是引起炎癥及免疫反應(yīng)的關(guān)鍵因子之一，在內(nèi)臟痛、神經(jīng)病理性疼痛、炎性痛等慢性疼痛中發(fā)揮重要作用[11,14]。研究報道，慢性內(nèi)臟痛大鼠

PVN內(nèi)IL-1β表達明顯增加[7]；本研究進一步發(fā)現(xiàn)，PVN內(nèi)微量注射IL-1β抑制劑Gevokizumab可緩解慢性內(nèi)臟痛大鼠的內(nèi)臟高敏。表明，PVN內(nèi)IL-1β參與了大鼠慢性內(nèi)臟痛的調(diào)控。然而， PVN內(nèi)IL-1β是否通過介導(dǎo)CRH神經(jīng)元敏化參與大鼠慢性內(nèi)臟痛的調(diào)節(jié)仍不明確。

圖2 各組大鼠c-Fos的表達數(shù)量(n = 4,±SD)*P ＜ 0.05，與Sham + PBS組、Sham + Gevokizumab組相比；#P ＜ 0.05，與CRD + PBS組相比Fig.2 Comparison of the number of c-Fos expression between different groups (n = 4,±SD)Representative images of immuno fl uorescence labeling for c-Fos (Red) in PVN (outlined by white dashed lines).A: Sham + PBS group; B: Sham + Gevokizumab group; C: CRD + PBS group; D: CRD + Gevokizumab group; E:quantitative analysis of c-Fos expression in PVN. *P ＜ 0.05, compared with Sham + PBS group and Sham + Gevokizumab group; #P ＜ 0.05, compared with CRD + PBS group.

圖3 各組大鼠CRH神經(jīng)元的活化率(n = 4,±SD)*P ＜ 0.05，與Sham + PBS組、Sham + Gevokizumab組相比；#P ＜ 0.05，與CRD + PBS組相比Fig.3 Comparison of the activation rate of CRH neurons between different groups (n = 4,±SD)Representative images of immuno fl uorescence labeling for CRH (Green) and c-fos (Red) in PVN (outlined by white dashed lines). A: Sham + PBS group; B: Sham + Gevokizumab group; C: CRD + PBS group; D: CRD + Gevokizumab group; E:quantitative analysis of the activation rate of CRH neurons in PVN. *P ＜ 0.05, compared with Sham + PBS group and Sham + Gevokizumab group; #P ＜ 0.05, compared with CRD + PBS group.

本研究檢測了c-Fos，作為即刻早期基因，其是神經(jīng)元活化的標(biāo)志物，可介導(dǎo)神經(jīng)信號的一系列反應(yīng)，在一些刺激所致的大腦區(qū)域被明顯激活[15]。本研究結(jié)果顯示，慢性內(nèi)臟痛大鼠PVN內(nèi)c-Fos表達較對照組明顯增加；PVN內(nèi)微量注射IL-1β抑制劑Gevokizumab可降低慢性內(nèi)臟痛大鼠c-Fos表達的數(shù)量，提示PVN內(nèi)IL-1β可導(dǎo)致神經(jīng)元興奮性增加，從而參與大鼠慢性內(nèi)臟痛調(diào)節(jié)。我們進一步明確是否PVN內(nèi)IL-1β介導(dǎo)了CRH神經(jīng)元的興奮性增加。結(jié)果顯示，慢性內(nèi)臟痛大鼠PVN內(nèi)CRH神經(jīng)元與c-Fos共標(biāo)的比例明顯增加；PVN內(nèi)微量注射IL-1β抑制劑Gevokizumab可降低慢性內(nèi)臟痛大鼠CRH神經(jīng)元與c-Fos共標(biāo)的比例，表明PVN內(nèi)IL-1β介導(dǎo)了CRH神經(jīng)元敏化?；谏鲜鰧嶒?，我們認(rèn)為PVN內(nèi)IL-1β介導(dǎo)了CRH神經(jīng)元敏化，進而參與了大鼠慢性內(nèi)臟痛的發(fā)生與發(fā)展。既往研究發(fā)現(xiàn)，PVN內(nèi)不存在IL-1β受體，其可能通過間接作用促進了CRH神經(jīng)元敏化[16]，其確切機制需進一步研究。

綜上所述，PVN內(nèi)IL-1β介導(dǎo)了CRH神經(jīng)元敏化，進而參與大鼠慢性內(nèi)臟痛的調(diào)節(jié)。本研究對進一步認(rèn)識慢性內(nèi)臟痛的病理生理機制，以及對臨床上慢性內(nèi)臟痛病人針對IL-1β這一潛在靶點進行干預(yù)從而緩解其內(nèi)臟高敏具有重要的意義。然而，本實驗只是從形態(tài)學(xué)方面觀察了CRH神經(jīng)元活化的特性，進一步的研究將應(yīng)用電生理記錄CRH神經(jīng)元的放電頻率，從而證實IL-1β與CRH神經(jīng)元的相關(guān)性。