常見真菌毒素的解讀及其檢測(cè)方案

真菌毒素在自然界中廣泛存在，有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界每年約有25%的食物受到不同程度的真菌毒素污染，每年由于霉變污染導(dǎo)致真菌毒素引起的農(nóng)產(chǎn)品和工業(yè)原料的損失達(dá)數(shù)百億美元。由此可見，真菌毒素會(huì)對(duì)谷物類食品的生產(chǎn)者和消費(fèi)者造成巨大損害。我國(guó)谷物霉變主要發(fā)生在長(zhǎng)江以南地區(qū)，每年約使糧食減產(chǎn)3%～7%。據(jù)調(diào)查，除糧食、飼料外，在油料作物、種子、水果、干果、蔬菜、調(diào)味品、煙草、麻類、乳和乳制品、發(fā)酵產(chǎn)品中都發(fā)現(xiàn)了不同程度的真菌毒素，其引起的疾病及傷害可以說給人們帶來了巨大的人員傷亡和財(cái)產(chǎn)損失。

1 什么是真菌毒素

真菌毒素是真菌在適宜溫度、濕度條件下產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，在糧食和飼料衛(wèi)生安全領(lǐng)域又俗稱為霉菌毒素。真菌為喜好氧氣的微生物，在厭氧條件下幾乎不能生存，因此谷物貯存時(shí)使用抽真空或充氮?dú)獾确椒ǘ寄苡行П苊庹婢舅氐淖躺?。目前，己?jīng)分離和鑒定出400多種真菌毒素，而在糧食行業(yè)中最常見的真菌毒素主要有4種，即黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素和赫曲霉毒素A。

2 來源及特點(diǎn)

2.1 真菌毒素的來源

真菌毒素的來源大體可分為兩個(gè)部分，即收獲前真菌毒素的來源與收獲后真菌毒素的來源。

2.1.1 收獲前真菌毒素的來源

任何生長(zhǎng)中的農(nóng)作物，包括飼草和谷物等，都容易在受到真菌污染時(shí)產(chǎn)生真菌毒素。真菌在隨農(nóng)作物由田間向飼料加工廠再向飼料槽的轉(zhuǎn)換過程中可能不會(huì)存活，即使有些真菌毒素被完整地保留下來，但飼料原料看上去顏色及外觀都不錯(cuò)，常見指標(biāo)檢測(cè)分析結(jié)果也不錯(cuò)，而往往就是這些“不錯(cuò)”的原料可能早就已經(jīng)成為真菌毒素的避風(fēng)港。

2.1.2 收獲后真菌毒素的來源

收獲后的農(nóng)作物如果其貯存、運(yùn)輸、加工、保藏的外部環(huán)境滿足真菌的生長(zhǎng)條件，則真菌會(huì)繼續(xù)生長(zhǎng)產(chǎn)毒。糧食飼料在收獲時(shí)未被充分干燥或貯運(yùn)過程中溫/濕度過高，糧食飼料上污染的真菌就會(huì)迅速生長(zhǎng)，此時(shí)真菌毒素會(huì)一直積累疊加，最終危害動(dòng)物機(jī)體而不自知。

2.2 真菌毒素的特點(diǎn)

2.2.1 高效性

較低毒素濃度（μg/kg）的真菌毒素即能產(chǎn)生明顯毒性。在污染比較嚴(yán)重的幾種真菌毒素中，黃曲霉毒素B1（AFB1）具有強(qiáng)毒性——是氰化鉀的10倍、砒霜的68倍，被世界衛(wèi)生組織的腫瘤研究機(jī)構(gòu)列為Ⅰ類致癌物質(zhì)。然而，AFB1的存在極為普遍——在農(nóng)作物和飼料中廣泛存在，其主要損害肝臟功能并具有強(qiáng)烈的致癌、致畸、致突變作用，能引起肝癌，甚至誘發(fā)骨癌、腎癌、直腸癌、乳腺癌、卵巢癌等。

2.2.2 高穩(wěn)定性

低分子化合物非常穩(wěn)定，可耐高溫。黃曲霉素具有較為穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)，對(duì)熱不敏感——即便在100℃下暴露20小時(shí)也不能將其完全去除，只有在280℃以上的高溫下才能被破壞。

2.2.3 富集性

真菌毒素所具有的抗化學(xué)生物制劑及物理滅活作用可以幫助其在生物鏈中不斷傳播、富集——原本殘留在土壤中的真菌毒素會(huì)被后來種植的谷物吸收，從而引起更多真菌毒素污染及感染的問題。

2.2.4 特異性

分子結(jié)構(gòu)不同，毒性相差較大。如黃曲霉毒素族有黃曲霉毒素B1、B2、M1、M2，各毒素的毒性均不同。

2.2.5 相加性

兩種以上的真菌毒素混合在一起造成的傷害遠(yuǎn)超單一毒素產(chǎn)生毒害作用的總和。由于農(nóng)作物可能被幾種真菌共同污染，因此飼料中可能同時(shí)存在多種真菌毒素。

2.2.6 污染地域性

動(dòng)物飼料及農(nóng)產(chǎn)品中真菌毒素的產(chǎn)生具有一定的地域性。例如，熱帶和亞熱帶區(qū)域是曲霉菌生長(zhǎng)的最佳環(huán)境。盡管如此，飼料和農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易的全球化導(dǎo)致真菌毒素在全世界范圍內(nèi)傳播。

2.2.7 隱蔽性

真菌毒素檢測(cè)時(shí)常受到小分子物質(zhì)（如糖苷、葡糖苷酸、脂肪酸酯和蛋白質(zhì)）的掩蓋，這些小分子物質(zhì)與真菌毒素結(jié)合在一起，導(dǎo)致檢測(cè)值顯示為錯(cuò)誤的陰性結(jié)果。最終，這些被掩蓋的真菌毒素不能被傳統(tǒng)的分析方法檢測(cè)出來。但這些結(jié)合到真菌毒素上的分子可能在消化過程中被解除，從而釋放出真菌毒素，危害動(dòng)物及人體健康。

3 四種常見的真菌毒素

3.1 黃曲霉毒素

黃曲霉毒素是一類由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，性質(zhì)較為穩(wěn)定，溶點(diǎn)為268～269℃，高溫下可穩(wěn)定存在，常規(guī)加熱和巴氏殺菌均不能將其有效去除。已知的黃曲霉毒素有20多種，包括直接由真菌代謝產(chǎn)生的AFB1、AFB2、AFG1和AFG2，以及集體攝入黃曲霉毒素后所代謝產(chǎn)生的AFM1和AFM2。其中，以AFB1最為常見且毒性最強(qiáng)——是迄今為止已知毒性最強(qiáng)的物質(zhì)之一。

黃曲霉毒素B1具有強(qiáng)致癌和致突變性，動(dòng)物體肝臟為其主要損傷器官，可引發(fā)肝炎、肝壞死、肝硬化等疾病，最終造成肝衰竭甚至死亡，現(xiàn)已被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)列為I類致癌物。黃曲霉毒素B1的污染范圍較廣，玉米、小麥、大豆、大米、花生、飼料及乳制品等農(nóng)產(chǎn)品均可檢出，其中，玉米、小麥、大豆和飼料受黃曲霉毒素B1的污染情況較為嚴(yán)重。在高溫、高濕的熱帶和亞熱帶地區(qū)，農(nóng)產(chǎn)品和食品中黃曲霉毒素具有較高的檢出率；國(guó)外發(fā)達(dá)國(guó)家包括歐洲地區(qū)、北美、日本等地，食品、飼料、奶制品中的AFB1超標(biāo)率較低；中東及非洲等發(fā)展中國(guó)家的AFB1污染率較高。國(guó)外，黃曲霉毒素超標(biāo)較為嚴(yán)重的食品為玉米，其黃曲霉毒素含量高時(shí)可達(dá)4.8mg/kg，超過限量200多倍。國(guó)外AFM1的污染情況與AFB1類似，發(fā)達(dá)國(guó)家或地區(qū)超標(biāo)率非常低，而中東及非洲等發(fā)展中國(guó)家的AFM1超標(biāo)率則相對(duì)較多；且國(guó)外有大量關(guān)于母乳中AFM1含量的報(bào)告。

在我國(guó)，花生及制品、食用油、餅粕及飼料和玉米、大米等農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉毒素污染比較嚴(yán)重，且歐盟的限量標(biāo)準(zhǔn)遠(yuǎn)低于我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)，故已引發(fā)多起因黃曲霉毒素超標(biāo)而導(dǎo)致的農(nóng)產(chǎn)品國(guó)際貿(mào)易糾紛。如2000年我國(guó)出口到歐盟的花生約40%存在黃曲霉毒素超標(biāo)情況，因而遭到退貨或被迫轉(zhuǎn)口貿(mào)易，致使我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)出口貿(mào)易受到巨大損失，不僅使我國(guó)對(duì)歐盟的花生出口貿(mào)易嚴(yán)重受限，而且極大影響了其他地區(qū)消費(fèi)者對(duì)我國(guó)花生質(zhì)量安全的信任，直接影響我國(guó)花生出口貿(mào)易的競(jìng)爭(zhēng)力。

3.2 嘔吐毒素

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON），主要由禾谷鐮刀菌、黃色鐮刀菌和燕麥鐮刀菌產(chǎn)生，是單端孢霉烯B族毒素。

1973年，Vesohder從引起母豬拒食和嘔吐的玉米中分離得到該毒素，并根據(jù)它能引發(fā)動(dòng)物嘔吐的特征將其定名為嘔吐毒素（Vomitoxin，VT）。DON是雪腐鐮刀菌稀醇的脫氧衍生物，也是一種全球性的谷物污染物。

DON的主要產(chǎn)生菌是禾谷鐮刀菌，其為小麥赤霉病與玉米穗腐病的重要病原菌，大多于低溫、潮濕和收割季節(jié)，在谷物莊稼中慢慢生長(zhǎng)。DON一般在大麥、小麥、玉米、燕麥中含有較高的濃度，而在黑麥、高梁、大米中的濃度較低。DON對(duì)糧谷類的污染狀況與產(chǎn)毒菌株、溫度、濕度、通風(fēng)、日照等因素有關(guān)。其熱反應(yīng)較為穩(wěn)定，一般的烹調(diào)及加熱不能破壞其毒性，但它對(duì)堿性環(huán)境比較敏感，用碳酸鈉溶液洗滌糧食可除掉70%左右的DON。

由于糧食中往往存在多種真菌毒素，因此會(huì)出現(xiàn)毒素間的協(xié)同作用、相加作用等不同情況。DON與玉米赤霉烯酮存在協(xié)同作用，能夠引起潛在的繁殖功能障礙。雪腐鐮刀菌烯醇和DON存在相加作用，同時(shí)攝入這兩種毒素的動(dòng)物會(huì)出現(xiàn)較重的臨床癥狀。

3.3 玉米赤霉烯酮

玉米赤霉烯酮（ZEN）是由多種鐮刀菌（主要由禾谷鐮刀產(chǎn)生）在代謝過程中產(chǎn)生的一種非類固醇結(jié)構(gòu)產(chǎn)物。此外，玉米赤霉烯酮在許多高等植物體內(nèi)存在，并作為植物體內(nèi)的一種激素來調(diào)控植物的生長(zhǎng)，例如小麥、大豆、棉花等在開花時(shí)玉米赤霉烯酮也達(dá)到峰值。

玉米赤霉烯酮可被胃腸道持續(xù)吸收，肝腸循環(huán)可使其在胃腸道滯留時(shí)間延長(zhǎng)，其主要隨糞便排出，少量可由乳汁排泄。ZEN在動(dòng)物體內(nèi)與葡萄糖醛酸結(jié)合后還原為玉米赤霉烯醇，該毒素主要污染物為谷物及其制品，可發(fā)生于農(nóng)作物的生長(zhǎng)、收獲、貯存和加工等各環(huán)節(jié)。濕度較高的環(huán)境條件下鐮刀菌更易生長(zhǎng)繁殖，因此雨量充沛、相對(duì)濕度較高的地區(qū)，玉米赤霉烯酮污染情況較為嚴(yán)重。

玉米赤霉烯酮為雌激素類似物，急性毒性較低，主要作用于生殖系統(tǒng)，故具有生殖毒性，可造成生殖激素系統(tǒng)紊亂，嚴(yán)重影響動(dòng)物機(jī)體的繁殖機(jī)能。

3.4 赭曲霉毒素A

赭曲霉毒素是由曲霉屬和青霉屬的某些霉菌結(jié)合產(chǎn)生的真菌毒素，主要有7種結(jié)構(gòu)類似物，分別是赭曲霉毒素A、赭曲霉毒素B、赭曲霉毒素C、赭曲霉毒素D、甲酯化的赭曲霉毒素A及甲酯化或乙酯化的赭曲霉毒素B。從對(duì)谷物的污染率、污染水平及對(duì)人畜的毒性考慮，赭曲霉毒素A是其中最重要的且具有衛(wèi)生學(xué)意義的霉菌代謝產(chǎn)物。

赭曲霉素的污染范圍較廣，幾乎可污染玉米、小麥在內(nèi)的所有谷物。正常條件下，小麥和玉米受污染的機(jī)率較小，約1%～5%，其含量為0.01～5mg/kg；大麥和燕麥被污染的機(jī)率較高，約為10%，其含量一般在0.1mg/kg以下。

4 維德維康真菌毒素檢測(cè)方案-真菌毒素檢測(cè)系統(tǒng)

北京維德維康生物技術(shù)有限公司（以下簡(jiǎn)稱“維德維康”）是一家專注于食品中有害化合物殘留快速檢測(cè)技術(shù)、動(dòng)物疫病快速診斷技術(shù)研究及相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)的中關(guān)村高新技術(shù)企業(yè)、國(guó)家高新技術(shù)企業(yè)、國(guó)家火炬計(jì)劃重點(diǎn)高新技術(shù)企業(yè)和北京市專利示范單位。多年來，維德維康深諳市場(chǎng)規(guī)律與用戶切身需求，致力于為食品生產(chǎn)、加工、流通領(lǐng)域的企業(yè)及政府監(jiān)管部門提供先進(jìn)的檢測(cè)技術(shù)、產(chǎn)品及綜合解決方案。

目前，維德維康擁有系統(tǒng)性的真菌毒素檢測(cè)手段，能夠?yàn)橛脩籼峁┩晟频恼婢舅亟鉀Q方案和服務(wù)，現(xiàn)有檢測(cè)產(chǎn)品包括：真菌毒素膠體金定性或半定量檢測(cè)卡、酶聯(lián)免疫吸附（Elisa）試劑盒和熒光定量快速檢測(cè)卡，以及高效液相色普（HPLC）與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀器確證平臺(tái)。上述3種免疫學(xué)快速檢測(cè)方法的優(yōu)勢(shì)在于：均可使用70%甲醇水統(tǒng)一提取糧食中常檢的4項(xiàng)毒素（嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮、黃曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A），單次提取可同時(shí)檢測(cè)多種真菌毒素，較大程度的減少了前處理的工作量，提高了檢測(cè)效率。食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2761-2017所規(guī)定的上述4項(xiàng)真菌毒素限量標(biāo)準(zhǔn)分別為：嘔吐毒素≤1000ppb；玉米赤霉烯酮≤60ppb；黃曲霉毒素B1≤5～20ppb；赭曲霉毒素A≤5ppb。

4.1 膠體金檢測(cè)試紙條

膠體金檢測(cè)試紙條具備操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)間短、不需要儀器設(shè)備進(jìn)行結(jié)果讀取的優(yōu)點(diǎn)；但其只能進(jìn)行定性或半定量檢測(cè)，靈敏度相對(duì)較低，且結(jié)果判定易受主觀因素影響。膠體金檢測(cè)卡適用于大批量樣本的初次篩選，后續(xù)可使用ELISA或儀器方法進(jìn)行驗(yàn)證。

4.2 酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒

酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒的操作相對(duì)復(fù)雜， 檢測(cè)結(jié)果易受人為操作影響，且檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)（>30min），不適用于少量樣本的檢測(cè)（成本高、耗時(shí)長(zhǎng)）。但該產(chǎn)品靈敏度相對(duì)較高，可借助于酶標(biāo)儀讀取并計(jì)算得到定量的檢測(cè)數(shù)據(jù)，適用于大批量樣本的同時(shí)檢測(cè)。

4.3 真菌毒素?zé)晒舛靠焖贆z測(cè)系統(tǒng)

根據(jù)糧食安全監(jiān)測(cè)工作的實(shí)際需要，按照簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、便攜和經(jīng)濟(jì)等原則，維德維康熒光定量快速檢測(cè)系統(tǒng)集中整合了熒光定量快速檢測(cè)卡、必要的前處理設(shè)備、熒光免疫定量分析儀和云端數(shù)據(jù)監(jiān)管平臺(tái)，將糧食真菌毒素的檢測(cè)統(tǒng)一于相同的前處理操作，并與搭建的云端監(jiān)管平臺(tái)結(jié)合鏈接，實(shí)現(xiàn)了“樣品采集-樣本處理-真菌毒素提取-定量檢測(cè)-數(shù)據(jù)實(shí)時(shí)上傳”，且該過程可以進(jìn)行全程監(jiān)管。

4.3.1 真菌毒素?zé)晒舛靠焖贆z測(cè)箱

真菌毒素?zé)晒舛靠焖贆z測(cè)箱包含多種日常使用的儀器：熒光免疫定量分析儀FQ-S2、檢測(cè)卡孵育器、掌上離心機(jī)、粉碎機(jī)（毛刷）、旋渦振蕩儀、天平（千分之一）、20～200μL微量移液器、100～1000μL微量移液器、1～5mL微量移液器、稱量勺/稱量紙、100mL量筒、計(jì)時(shí)器、10mL/50mL離心管、1.5mL離心管、1.5mL&10mL&50 mL管架、200μL槍頭/盒、1mL槍頭/盒、儀器使用說明書。

4.3.2 熒光定量快速檢測(cè)卡

熒光定量檢測(cè)卡同時(shí)兼具了膠體金檢測(cè)卡操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)時(shí)間短（8min），以及Elisa試劑盒靈敏度高、可定量的優(yōu)點(diǎn)，還可借助于熒光免疫定量分析儀將檢測(cè)結(jié)果直接實(shí)時(shí)傳輸至云端數(shù)據(jù)監(jiān)管平臺(tái)。

檢測(cè)原理為，將處理好的樣品滴加至加樣孔后，樣品中的目標(biāo)物與釋放墊中的熒光微球標(biāo)記抗體結(jié)合并向前層析，當(dāng)達(dá)到檢測(cè)區(qū)域后，檢測(cè)線（T線）上固定的抗原與剩余的部分熒光微球標(biāo)記抗體結(jié)合，T線上結(jié)合的熒光微球標(biāo)記抗體量與樣品中目標(biāo)物的濃度成反比，C線上結(jié)合的熒光標(biāo)記物樣品中待測(cè)物的含量無關(guān)。8min層析結(jié)束后，使用熒光免疫定量分析儀讀取T線和C線的熒光強(qiáng)度并計(jì)算T/C值，儀器結(jié)合T/C值和二維碼上的標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計(jì)算出樣品中待測(cè)物的含量。為滿足用戶的檢測(cè)需求，維德維康在研發(fā)時(shí)將實(shí)際檢測(cè)工作中的痛點(diǎn)問題納入考量，熒光定量快速檢測(cè)卡才有了無與倫比的檢測(cè)優(yōu)勢(shì)：

①采用時(shí)間分辨熒光微球作為抗體標(biāo)記物，檢測(cè)靈敏度更高；

②時(shí)間分辨熒光的Stokes位移約290nm，抗背景干擾能力強(qiáng)；

③附帶的二維碼包含檢測(cè)項(xiàng)目、檢測(cè)樣本、檢測(cè)限等信息；

④40℃溫度層析，反應(yīng)速度快，減少檢測(cè)時(shí)間，提高檢測(cè)效率；

⑤檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定性高，可保證在5～10min層析時(shí)間內(nèi)結(jié)果穩(wěn)定。

4.3.3熒光免疫定量分析儀（FQ-S2）

熒光免疫定量分析儀（FQ-S2）有如下特點(diǎn)：

①儀器配置方面，8寸1200×1920 IPS顯示屏和1.5GHz八核處理器，2G內(nèi)存；

②操作系統(tǒng)方面，熒光免疫定量分析儀的操作軟件支持自動(dòng)檢測(cè)，在線升級(jí)；

③信號(hào)識(shí)別方面，儀器可自動(dòng)識(shí)別檢測(cè)卡上的二維碼信息，并進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果計(jì)算；

④存儲(chǔ)空間方面，存儲(chǔ)空間達(dá)16GB，可保存海量的檢測(cè)數(shù)據(jù)，便于結(jié)果查詢；

⑤數(shù)據(jù)傳輸方面，檢測(cè)數(shù)據(jù)可通過無線WIFI實(shí)時(shí)傳輸?shù)皆贫藬?shù)據(jù)監(jiān)管平臺(tái)；

⑥結(jié)果打印方面，儀器自帶熱敏打印機(jī)，檢測(cè)結(jié)果可實(shí)時(shí)打印。

4.3.4 云端數(shù)據(jù)監(jiān)管平臺(tái)

維德維康監(jiān)測(cè)監(jiān)管系統(tǒng)能與檢測(cè)儀器上傳的數(shù)據(jù)交互，利用互聯(lián)網(wǎng)技術(shù)實(shí)現(xiàn)檢測(cè)數(shù)據(jù)實(shí)時(shí)上傳，監(jiān)管平臺(tái)對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析和分類匯總，可實(shí)現(xiàn)食品安全關(guān)鍵點(diǎn)的信息化監(jiān)控，構(gòu)建省級(jí)、市級(jí)、區(qū)縣級(jí)的數(shù)據(jù)化、信息化監(jiān)測(cè)監(jiān)督體系，為管理者提供強(qiáng)大的系統(tǒng)數(shù)據(jù)支撐。