異丙酚對卵巢癌SKOV3細(xì)胞克隆形成、侵襲、EMT和miR-143表達(dá)的影響

田文珺，劉士佳，劉曉明，吳 越

大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科 遼寧大連 116000

異丙酚化學(xué)名2,6-二異丙基苯酚，是麻醉誘導(dǎo)、麻醉維持和重癥監(jiān)護(hù)室鎮(zhèn)靜常用的靜脈用麻醉藥物。越來越多的研究[1-3]證實，異丙酚具有抑制肺癌、肝癌和胰腺癌等腫瘤細(xì)胞惡性增殖和轉(zhuǎn)移的作用。微小RNAs(miRNAs)是一類與細(xì)胞生物學(xué)行為關(guān)系密切的非編碼RNA，miR-143是miRNAs中的重要成員，被證實在乳腺癌、食管癌和骨肉瘤等腫瘤中可通過調(diào)控細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)等功能，發(fā)揮抑癌基因的作用[4-6]。已有研究[7-8]指出異丙酚可通過上調(diào)miR-143表達(dá)抑制骨肉瘤MG63細(xì)胞增殖和侵襲。本研究通過觀察異丙酚對卵巢癌SKOV3細(xì)胞克隆形成、侵襲、EMT和miR-143表達(dá)的影響，探討異丙酚與卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的關(guān)系和可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1研究對象SKOV3細(xì)胞株(美國ATCC公司)，miR-143抑制劑及其陰性對照(廣州瑞博生物公司)，異丙酚(美國Sigma公司)，Trizol試劑、Lipofectamine 2000和反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Invitrogen公司)，RPMI 1640培養(yǎng)基、 胎牛血清、青霉素、鏈霉素(美國Gibco公司)，兔抗人 E-cadherin和Vimentin 單克隆抗體(武漢三鷹生物公司)，鼠抗人β-actin單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，HRP標(biāo)記山羊抗兔/鼠 IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。PCR相關(guān)試劑(北京康為世紀(jì)生物公司)，總蛋白提取試劑盒(上海碧云天生物公司)。倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，7500型熒光定量PCR儀 (美國ABI公司)，Transwell小室(美國Corning公司)，恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(德國 Thermo公司)。

1.2SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)和處理將SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)在含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 mg/L鏈霉素和100 U/mL青霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，常規(guī)培養(yǎng)條件為相對濕度為95%、體積分?jǐn)?shù)5%CO2和溫度37 ℃。將對數(shù)生長期的SKOV3細(xì)胞以105個/mL和每孔200 μL接種至96孔細(xì)胞板上，在常規(guī)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)過夜。分別以0.0、2.5、5.0和10.0 μmol/L異丙酚刺激SKOV3細(xì)胞48 h后，收集各組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗，每組設(shè)3個復(fù)孔。

1.3軟瓊脂集落形成實驗檢測SKOV3細(xì)胞克隆形成能力收集各組細(xì)胞，以每組103個細(xì)胞接種至頂層含3 g/L、底層含5 g/L瓊脂糖的軟瓊脂上，常規(guī)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)2周后，收集各組細(xì)胞，于顯微鏡下觀察，統(tǒng)計克隆形成數(shù)。以細(xì)胞數(shù)大于50作為有效克隆。以克隆形成數(shù)與接種細(xì)胞數(shù)的百分比表示克隆形成率。實驗重復(fù)3次。

1.4Transwell小室實驗檢測SKOV3細(xì)胞侵襲能力以濃度為250 mg/L的 Matrigel溶液100 μL包被孔徑為8 μm的Transwell小室上、下室間的聚碳酸酯微孔膜。各組SKOV3細(xì)胞采用無血清培養(yǎng)基稀釋至104個/mL。在小室下室中加入含胎牛血清的培養(yǎng)基500 μL，上室中加入細(xì)胞懸液200 μL，置于常規(guī)條件下培養(yǎng)過夜。取出小室，小心拭去上室濾膜上的細(xì)胞，并以40 g/L多聚甲醛對濾膜下層細(xì)胞進(jìn)行固定，結(jié)晶紫染色。顯微鏡下觀察并統(tǒng)計穿膜細(xì)胞數(shù)。以選取的5個視野細(xì)胞數(shù)的均值表示侵襲細(xì)胞數(shù)。實驗重復(fù)3次。

1.5Western blot檢測SKOV3細(xì)胞E-cadherin和Vimentin的表達(dá)將各組SKOV3細(xì)胞參照總蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白。向蛋白樣品中加入2×loading buffer煮沸5 min后，以每孔60 μg上樣至SDS-PAGE中進(jìn)行電泳，使用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。室溫下，以50 g/L脫脂奶粉封閉膜1 h。以PBST洗膜，加入1∶500稀釋的E-cadherin和Vimentin抗體，4 ℃下孵育過夜。洗膜，室溫下加入1∶1 000稀釋的HRP標(biāo)記山羊抗兔/鼠IgG孵育1 h。再次洗膜，滴加發(fā)光液避光顯影。以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行凝膠成像系統(tǒng)掃描分析。實驗重復(fù)3次。以目的蛋白與內(nèi)參灰度值的比值作為目的蛋白的表達(dá)水平。

1.6實時熒光定量RT-PCR檢測SKOV3細(xì)胞中miR-143的表達(dá)收集各組SKOV3細(xì)胞，使用Trizol試劑提取總RNA，并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。其中，miR-143引物(上游：5’-CAGTGCGT GTCGTGGAG-3’，下游：5’-GCGGTGAGATGAAGCACT-3’)和內(nèi)參U6引物(上游：5’-CTCAGAGCGT GGTTCTCCGTCAC-3’，下游：5’-TATAAATCTTTAC CCTGTTGGCAGT-3’)由南京金斯瑞生物公司合成。取cDNA 1 μL、2×SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL、PCR上下游引物各0.4 μL、50×ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL和ddH2O28.8 μL配制成總體積為20 μL的PCR體系。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性20 s;94 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，共45個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算miR-143的相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次。

1.7下調(diào)miR-143對異丙酚刺激的SKOV3細(xì)胞的影響將SKOV3細(xì)胞按照每孔3×105個接種至6孔細(xì)胞板上，常規(guī)條件下培養(yǎng)過夜，當(dāng)細(xì)胞融合大于70%時，參照Lipofectamine 2000說明書分別將miR-143抑制劑及其陰性對照轉(zhuǎn)至SKOV3細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染24 h后加入終濃度為10.0 μmol/L異丙酚刺激48 h。另設(shè)未經(jīng)任何處理的SKOV3細(xì)胞作為對照組，只給予10.0 μmol/L異丙酚處理而未轉(zhuǎn)染的SKOV3細(xì)胞作為異丙酚組。待處理結(jié)束后，收集各組細(xì)胞，采用軟瓊脂集落形成實驗和Transwell小室實驗檢測細(xì)胞克隆形成能力和侵襲能力，Western blot法分別檢測EMT相關(guān)E-cadherin和Vimentin蛋白的表達(dá)。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 22.0進(jìn)行分析，各組間細(xì)胞克隆形成率、侵襲細(xì)胞數(shù)、E-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平、miR-143表達(dá)水平的比較使用單因素方差分析和SNK-q檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1異丙酚對SKOV3細(xì)胞克隆形成和侵襲能力的影響見表1。

2.2異丙酚對SKOV3細(xì)胞E-cadherin和Vimentin表達(dá)的影響見圖1和表1。

2.3異丙酚對SKOV3細(xì)胞中miR-143表達(dá)的影響見表1。

表1 各組細(xì)胞克隆形成率，侵襲細(xì)胞數(shù)，E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)和miR-143表達(dá)的比較(n=3)

各指標(biāo)組間兩兩比較，P均<0.05

1～4：分別為0.0、2.5、5.0和10.0 μmol/L異丙酚組

2.4下調(diào)miR-143對異丙酚處理的SKOV3細(xì)胞的影響見圖2和表2。

1～4：分別為對照組、異丙酚組、miR-143陰性對照組和miR-143抑制組

圖2各組細(xì)胞中E-cadherin和Vimentin蛋白的表達(dá)

表2 各組細(xì)胞miR-143的表達(dá)、克隆形成和侵襲能力、E-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)的比較(n=3)

*：與對照組比較 ,P<0.05；#：與異丙酚和miR-143陰性對照組比較，P<0.05

3 討論

目前，麻醉藥在腫瘤中的作用是有害還是有益逐漸引起人們的關(guān)注。隨著研究的不斷深入，常用的靜脈用麻醉藥物異丙酚在腫瘤中的作用逐漸被發(fā)現(xiàn)和了解。Yang等[9]在關(guān)于胃癌的研究中指出，異丙酚可通過上調(diào)ING3表達(dá)抑制癌細(xì)胞的體外生長和存活。Du等[10]發(fā)現(xiàn)，異丙酚可通過下調(diào)SOX4表達(dá)抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Liu等[1]研究指出，異丙酚可能通過上調(diào)miR-1284抑制肺癌A549細(xì)胞的存活、遷移、侵襲和EMT過程。Sun等[11]發(fā)現(xiàn)，異丙酚可通過下調(diào)miR-372抑制肺癌A549細(xì)胞的生長、遷移和侵襲。以上研究證實異丙酚可通過不同的作用機(jī)制抑制腫瘤細(xì)胞惡性增殖與轉(zhuǎn)移。

miR-143是一個與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切的miRNA，可通過多個靶基因抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，發(fā)揮抑癌基因的作用[12]。Zhai等[13]認(rèn)為異常低表達(dá)的miR-143可通過下調(diào)ERK5在乳腺癌EMT進(jìn)程和腫瘤生長過程中發(fā)揮抑制作用。Lei等[14]研究發(fā)現(xiàn)，miR-143可通過靶向MYO6調(diào)節(jié)EMT，從而抑制胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。研究[7，15]證實，miR-143在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著類似抑癌基因的作用。Ye等[8]指出，上調(diào)miR-143表達(dá)是異丙酚抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖和侵襲的重要機(jī)制。盡管已有研究[16]證實，異丙酚對卵巢癌細(xì)胞生長和侵襲有一定的抑制作用，但其是否通過miR-143參與抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移尚不完全清楚，而EMT是癌細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學(xué)過程，其中間質(zhì)指標(biāo)Vimentin蛋白表達(dá)升高，上皮指標(biāo)E-cadherin蛋白表達(dá)降低是EMT發(fā)生重要標(biāo)志。本研究以異丙酚刺激卵巢癌SKOV3細(xì)胞48 h，發(fā)現(xiàn)異丙酚可呈濃度依賴性地抑制SKOV3細(xì)胞克隆形成和侵襲能力，下

調(diào)Vimentin和上調(diào)E-cadherin表達(dá)，并促進(jìn)miR-143表達(dá)；而轉(zhuǎn)染miR-143抑制劑后，異丙酚對SKOV3細(xì)胞的上述作用明顯逆轉(zhuǎn)。以上結(jié)果提示，miR-143表達(dá)上調(diào)是異丙酚抑制SKOV3細(xì)胞轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制。

綜上所述，異丙酚可能通過上調(diào)miR-143表達(dá)抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞轉(zhuǎn)移，該結(jié)果為異丙酚成為卵巢癌手術(shù)治療中的理想麻醉藥提供了參考。