黃芪總黃酮對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥因子分泌的影響

任偉亮，焦永偉，張 健，王 響，齊立卿，杜雙慶

河北省中醫(yī)院骨三科 石家莊 050011

骨關(guān)節(jié)炎是一種常見(jiàn)的退行性疾病，其發(fā)生與關(guān)節(jié)軟骨損傷有關(guān)。正常的軟骨組織由軟骨細(xì)胞和軟骨基質(zhì)組成，其中軟骨細(xì)胞不僅可以清除壞死退變的基質(zhì)，還可以不斷合成新的基質(zhì)，維持關(guān)節(jié)軟骨的正常功能[1]。黃芪總黃酮是一種從蒙古黃芪中分離出來(lái)的抗氧化活性成分，研究[2-4]顯示，黃芪總黃酮具有抗腫瘤、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗損傷等生物學(xué)作用。研究[5]還顯示，黃芪總黃酮具有治療關(guān)節(jié)炎的作用，黃芪總黃酮處理可以減少關(guān)節(jié)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，抑制炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分離骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞，探討黃芪總黃酮對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的作用，為黃芪總黃酮治療骨關(guān)節(jié)炎提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料本實(shí)驗(yàn)所用的骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織均來(lái)源于2017年3月河北省中醫(yī)院膝關(guān)節(jié)置換術(shù)患者，標(biāo)本保存在液氮中。超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物研究所；谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海哈靈生物科技有限公司；NF-κB p65亞型(NF-κBp65)抗體購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；基質(zhì)金屬蛋白酶-13(MMP-13)抗體購(gòu)自上海研晶生物技術(shù)有限公司；白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京熱景生物技術(shù)股份有限公司；黃芪總黃酮購(gòu)自西安恒堡生物科技有限公司。

1.2骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)參照文獻(xiàn)[6]分離培養(yǎng)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞，在無(wú)菌條件下將骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織用1.5 g/L的膠原酶消化以后，用含青、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液(培養(yǎng)液中添加體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清)培養(yǎng)。以22目細(xì)胞篩過(guò)濾以后，1 000×g離心10 min。用不含血清的DMEM將細(xì)胞懸浮，1 000×g離心10 min，棄上清。把分離的細(xì)胞種植到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每3 d換液1次，細(xì)胞融合度超過(guò)90%時(shí)，用2.5 g/L的胰蛋白酶消化傳代。

1.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力取第3代骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)孔中添加3 000個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)過(guò)夜以后，將細(xì)胞培養(yǎng)液換成含有0、5、10、20 mg/L的黃芪總黃酮細(xì)胞培養(yǎng)液，每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)72 h以后，將培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱中取出，每孔添加20 μL MTT溶液，常規(guī)方法培養(yǎng)4 h以后，把孔內(nèi)的液體吸除，添加DMSO溶液150 μL，振蕩孵育10 min后，將培養(yǎng)板置于酶標(biāo)儀中，將波長(zhǎng)調(diào)整為490 nm，測(cè)定每孔的OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清中IL-6、IL-1β水平取第3代骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞，經(jīng)過(guò)0、5、10、20 mg/L的黃芪總黃酮細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)72 h以后，收集培養(yǎng)上清，ELISA法檢測(cè)上清中IL-6、IL-1β含量，步驟同試劑盒說(shuō)明。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5細(xì)胞培養(yǎng)上清中SOD、GSH-Px活性檢測(cè)取第3代骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞，經(jīng)過(guò)0、5、10、20 mg/L的黃芪總黃酮細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)72 h以后，收集培養(yǎng)上清，用WST-8法檢測(cè)SOD活性，用ELISA法檢測(cè)GSH-Px活性，步驟均參照試劑盒說(shuō)明。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6Western blot檢測(cè)NF-κBp65、MMP-13蛋白表達(dá)水平0、5、10、20 mg/L的黃芪總黃酮處理72 h以后，收集各組細(xì)胞，在細(xì)胞中添加含有1 mmol/L PMSF的裂解液，置于冰上裂解。4 ℃高速離心以后，取上清液轉(zhuǎn)移到離心管中，保存于-80 ℃。在蛋白中按照1∶4的體積比添加適量的Loading Buffer混勻后煮沸5 min。用BCA法進(jìn)行定量。配制100 g/L的分離膠、50 g/L的濃縮膠。按照蛋白樣品50 μg進(jìn)行上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜電流為250 mA。將NC膜置于一抗反應(yīng)液(NF-κBp65以1∶600稀釋、MMP-13以1∶800稀釋)中反應(yīng)過(guò)夜后，再置于二抗反應(yīng)液中室溫孵育2 h，二抗以1∶2 000稀釋，滴加ECL發(fā)光液。采用Quantity-One軟件分析條帶的灰度值，以β-actin作為參照，目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0進(jìn)行分析。4組細(xì)胞OD值，培養(yǎng)上清中IL-6、IL-1β含量及SOD、GSH-Px活性，MMP-13、NF-κBp65蛋白表達(dá)水平的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.14組細(xì)胞增殖能力的比較MTT結(jié)果顯示，細(xì)胞OD值隨著黃芪總黃酮濃度的升高而升高。見(jiàn)表1。

表1 4組細(xì)胞OD值及培養(yǎng)上清中IL-6、IL-1β含量的比較(n=3)

*：與0 mg/L組比較，P<0.05；#：與5 mg/L組比較，P<0.05；△：與10 mg/L組比較，P<0.05

2.24組細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6、IL-1β含量的比較ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6、IL-1β含量隨著黃芪總黃酮濃度的升高而降低。見(jiàn)表1。

2.34組細(xì)胞培養(yǎng)上清中SOD、GSH-Px活性的比較結(jié)果顯示，細(xì)胞培養(yǎng)上清中SOD、GSH-Px活性隨著黃芪總黃酮濃度的升高而升高。見(jiàn)表2。

表2 4組細(xì)胞培養(yǎng)上清中SOD、GSH-Px活性及MMP-13、NF-κBp65蛋白表達(dá)水平的比較(n=3)

*：與0 mg/L組比較，P<0.05；#：與5 mg/L組比較，P<0.05；△：與10 mg/L組比較，P<0.05

2.44組細(xì)胞MMP-13、NF-κBp65蛋白表達(dá)水平的比較Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，細(xì)胞中MMP-13、NF-κBp65蛋白表達(dá)水平隨著黃芪總黃酮濃度的升高而降低。見(jiàn)圖1和表2。

1：0 mg/L組；2：5 mg/L組；3：10 mg/L組；4：20 mg/L組

3 討論

黃芪屬于豆科黃芪屬植物，其含有多種活性成分，黃芪總皂苷、黃芪總黃酮、黃芪總多糖等是其主要的活性成分，其中黃芪總黃酮含有6種單體，具有提高免疫細(xì)胞活性、減輕氧化損傷、抑制突變、抗失血性休克等功效[7]。有研究[8]報(bào)道，黃芪總黃酮具有保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨的作用，其可以減輕關(guān)節(jié)軟骨炎癥因子釋放。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃芪總黃酮處理后的關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖活性升高，細(xì)胞培養(yǎng)上清中炎癥因子IL-6、IL-10水平降低，說(shuō)明黃芪總黃酮具有抑制關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞炎癥因子釋放的作用。

骨關(guān)節(jié)炎是一種慢性疾病，關(guān)節(jié)功能破壞是其主要的病理變化，氧化應(yīng)激是關(guān)節(jié)軟骨損傷發(fā)生的重要原因[9]。氧化應(yīng)激是指機(jī)體受到炎癥因子等各種有害刺激以后產(chǎn)生過(guò)量的氧自由基或?qū)е聶C(jī)體內(nèi)抗氧化能力降低，從而引起氧自由基在機(jī)體內(nèi)積累，導(dǎo)致機(jī)體氧化還原狀態(tài)受到破壞，引起氧化損傷[10-12]。SOD、GSH-Px是抗氧化酶，可以將細(xì)胞內(nèi)過(guò)量的氧自由基清除，是機(jī)體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分[13]。黃芪總黃酮具有清除氧自由基、抗氧化損傷的作用，目前在肝損傷、紫外線損傷等過(guò)程中已被證實(shí)[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃芪總黃酮處理后的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞培養(yǎng)上清中SOD、GSH-Px活性升高，提示黃芪總黃酮可以通過(guò)提高細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的活性發(fā)揮保護(hù)關(guān)節(jié)細(xì)胞的作用。

正常情況下，軟骨細(xì)胞可以分泌大量的蛋白多糖，這些蛋白多糖能夠被基質(zhì)金屬蛋白酶降解，從而維持細(xì)胞支撐力量的循環(huán)和平衡；受損的軟骨細(xì)胞可以分泌過(guò)量的基質(zhì)金屬蛋白酶，導(dǎo)致上述平衡受到破壞，引起軟骨細(xì)胞支撐力量缺失，誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[15]。基質(zhì)金屬蛋白酶是細(xì)胞外基質(zhì)降解的重要源頭，MMP-13能夠?qū)ⅱ蛐湍z原、Ⅰ型膠原和蛋白聚糖等降解，其中Ⅱ型膠原是軟骨膠原的主要組成部分，其與蛋白聚糖共同維持軟骨的彈性[16]。本研究結(jié)果表明，黃芪總黃酮能夠抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中MMP-13的表達(dá)，黃芪總黃酮可以通過(guò)抑制細(xì)胞外基質(zhì)降解發(fā)揮抗骨關(guān)節(jié)炎的作用。

NF-κB是一個(gè)與炎癥、細(xì)胞生長(zhǎng)、氧化損傷等密切相關(guān)的信號(hào)通路，其可以誘導(dǎo)下游炎癥因子釋放，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，引起細(xì)胞氧化應(yīng)激。NF-κBp65是NF-κB二聚體形成的必需組成單位，也是NF-κB信號(hào)功能發(fā)揮的關(guān)鍵[17]。NF-κB在骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織中過(guò)度激活，NF-κBp65在骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織中的表達(dá)水平升高，白藜蘆醇等藥物可以通過(guò)下調(diào)NF-κB信號(hào)的激活抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織的炎癥反應(yīng)[18-19]。黃芪總黃酮具有抗炎和負(fù)調(diào)控NF-κB信號(hào)的作用[20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃芪總黃酮處理后骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中的NF-κBp65蛋白表達(dá)水平降低，提示黃芪總黃酮可以通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路激活發(fā)揮抗炎、抗氧化的作用。

綜上，黃芪總黃酮能夠抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，其作用機(jī)制可能與下調(diào)NF-κB信號(hào)有關(guān)。這為以后研究黃芪總黃酮抗骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制提供了依據(jù)，為骨關(guān)節(jié)炎的治療提供了參考。