miR-422a過表達(dá)聯(lián)合EPO對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞活力、凋亡及PI3K/AKT信號(hào)通路的影響

顧 然，王 露，唐 蔓，胡 曉

貴州省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 貴陽(yáng) 550002

有研究[1-2]表明，帕金森病、阿爾茨海默癥等多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展與氧化應(yīng)激密切相關(guān)。過氧化氫(H2O2)是一種氧化性較強(qiáng)的活性氧，可誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一類高度保守、長(zhǎng)18～25個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA，可通過與目標(biāo)基因的3’-UTR結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)目標(biāo)基因表達(dá)[3]。miR-422a是miRNAs家族成員之一，有研究[4]表明，在H2O2誘導(dǎo)的大鼠腎上腺嗜鉻瘤細(xì)胞PC12細(xì)胞凋亡模型中，miR-422a的表達(dá)降低，提示miR-422a可能在神經(jīng)損傷過程中有重要作用。促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin,EPO)是一種具有抗氧化、調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成、抗炎、抗細(xì)胞凋亡等多種生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子;在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型中發(fā)揮保護(hù)作用，其保護(hù)作用機(jī)制可能與抗氧化應(yīng)激、抗凋亡、抗炎作用等有關(guān)[5-6]。本研究旨在分析過表達(dá)miR-422a和EPO單獨(dú)或聯(lián)合作用對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞活力和凋亡的影響，并進(jìn)一步研究其作用機(jī)制，以探討miR-422a是否可增強(qiáng)EPO對(duì)氧化損傷的PC12細(xì)胞的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，胎牛血清(FBS)購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司，MTT試劑盒、DMSO均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，鼠抗人AKT、p-AKT抗體均購(gòu)自美國(guó)CST公司，細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、流式細(xì)胞儀均購(gòu)自美國(guó)BD公司，總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自日本TaKaRa公司,miR-422a mimics 及空質(zhì)粒均購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，LipofectamineTM2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)PC12細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞在體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37 ℃條件下，用含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。2～3 d換液一次。細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，用胰蛋白酶消化、傳代。

1.3實(shí)驗(yàn)分組及處理將PC12細(xì)胞分為6組?？瞻捉M：細(xì)胞不經(jīng)特殊處理；H2O2組：細(xì)胞用300 μmol/L H2O2處理4 h；miR-NC組：H2O2刺激前細(xì)胞轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒48 h；miR-422a組：H2O2刺激前細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-422a mimics 48 h(100 nmol/L)；EPO組：H2O2刺激前用1 IU/mL EPO處理細(xì)胞2 h；miR-422a+EPO組：H2O2刺激前用miR-422a mimics及EPO同上處理細(xì)胞(先轉(zhuǎn)染，后加EPO)。將PC12細(xì)胞以2×105個(gè)/孔接種于6孔板，于培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞達(dá)50%～70%生長(zhǎng)融合度時(shí)開始轉(zhuǎn)染，參照LipofectamineTM2000試劑盒說明操作。

1.4qRT-PCR檢測(cè)miR-422a的表達(dá)用總RNA提取試劑盒提取空白組、H2O2組、miR-NC組、miR-422a組細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。miR-422a及內(nèi)參U6引物由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)并合成。miR-422a上游引物為5’-GGGACTGGACTTAGGGTCA-3’，下游引物為5’-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3’，產(chǎn)物63 bp；U6上游引物為5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’，下游引物為5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’，產(chǎn)物78 bp。反應(yīng)體系(20 μL)：2×SYBR premix Ex TaqTMⅡ 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，ROX Reference Dyell 0.4 μL， cDNA模板2.0 μL，ddH2O 6.6 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40個(gè)循環(huán)。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，取Ct均值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-422a相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5細(xì)胞活力檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×104個(gè)/mL，以每孔100 μL接種于96孔板，過夜培養(yǎng)。按1.3中實(shí)驗(yàn)分組處理后，每孔加MTT溶液(5 g/L)10 μL，繼續(xù)孵育4 h，吸去培養(yǎng)液，每孔加150 μL DMSO，繼續(xù)孵育10 min，酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm處的吸光度(A)值，代表細(xì)胞活力。每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6細(xì)胞凋亡檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞，以3×104個(gè)/孔接種于24孔板，常規(guī)培養(yǎng)24 h。按1.3中實(shí)驗(yàn)分組處理后，以預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞，加Annexin V binding buffer懸浮細(xì)胞，混勻，加5 μL的Annexin V-FITC及5 μL PI，輕柔混勻，避光室溫反應(yīng)15 min，加200 μL Annexin V binding buffer 400 μL，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7AKT、p-AKT蛋白檢測(cè)收集各處理組細(xì)胞，加適量裂解液提取總蛋白，BCA法定量蛋白濃度。蛋白經(jīng)100 ℃變性后，上樣，每孔道40 μg，經(jīng)120 g/L SDS-PAGE分離、轉(zhuǎn)NC膜、50 g/L脫脂奶粉封閉，使用封閉液稀釋一抗(鼠抗AKT、p-AKT抗體及內(nèi)參GAPDH抗體均按1∶1 000稀釋)，室溫?fù)u床孵育3～4 h，洗膜，加HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG抗體(按1∶5 000稀釋)，37 ℃孵育1 h，洗膜，ECL顯色，顯影。Quantity One軟件分析蛋白條帶灰度值。目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 21.0處理數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析比較各組以上指標(biāo)的差異，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1轉(zhuǎn)染miR-422a mimics對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞miR-422a表達(dá)的影響如表1所示，H2O2刺激可降低PC12細(xì)胞miR-422a表達(dá)，轉(zhuǎn)染miR-422a mimics后PC12細(xì)胞中miR-422a表達(dá)較H2O2組升高。

表1 4組細(xì)胞miR-422a 表達(dá)的比較

F=339.935,P<0.001;*：與空白組比較，P<0.05；#：與H2O2組比較，P<0.05

2.2過表達(dá)miR-422a或EPO對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞活力的影響如表2所示，H2O2刺激可降低PC12細(xì)胞活力，而過表達(dá)miR-422a及EPO均可提高細(xì)胞活力，兩者合用對(duì)細(xì)胞活力的增強(qiáng)作用更強(qiáng)。

2.3過表達(dá)miR-422a或EPO對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡的影響如表2所示，H2O2刺激可誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡，而過表達(dá)miR-422a及EPO均可降低細(xì)胞凋亡率，兩者合用對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用更強(qiáng)。

2.4過表達(dá)miR-422a或EPO對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞AKT及p-AKT蛋白表達(dá)的影響如圖1和表2所示，H2O2刺激可下調(diào)PC12細(xì)胞p-AKT表達(dá)，而過表達(dá)miR-422a及EPO均可上調(diào)細(xì)胞p-AKT表達(dá)，兩者合用對(duì)細(xì)胞p-AKT表達(dá)的上調(diào)作用更強(qiáng)。

1～6：分別為空白組、H2O2組、miR-NC組、miR-422a組、EPO組、miR-422a+EPO組

圖1過表達(dá)miR-422a或EPO對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞AKT、p-AKT蛋白表達(dá)的影響

表2 6組細(xì)胞細(xì)胞活力、凋亡率及AKT、p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

*:與空白組比較，P<0.05；#:與H2O2組比較，P<0.05；△:與miR-422a組及EPO組比較，P<0.05

3 討論

機(jī)體內(nèi)活性氧過多可觸發(fā)細(xì)胞的自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，損傷細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，影響酶功能、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及基因表達(dá)，引起細(xì)胞的氧化損傷[7-8]。H2O2、谷氨酸鹽、t-BHP等常用于制作氧化損傷模型，由于H2O2具有易于取得、性質(zhì)比較穩(wěn)定等特點(diǎn)，應(yīng)用最為廣泛[9]。PC12細(xì)胞可長(zhǎng)出類似神經(jīng)元細(xì)胞的突觸，有神經(jīng)細(xì)胞的特性，又有增殖快的特點(diǎn)，因此成為神經(jīng)細(xì)胞生理病理研究常用的細(xì)胞模型[10]。有研究[11]表明，300 μmol/L H2O2處理PC12細(xì)胞4 h，可抑制近一半的細(xì)胞活力，因此，本研究使用300 μmol/L H2O2刺激PC12細(xì)胞，建立細(xì)胞氧化損傷模型，研究結(jié)果顯示，H2O2可抑制PC12細(xì)胞活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，說明建立的PC12細(xì)胞氧化損傷模型成功。

miRNA在不同生物中有高度保守性，參與調(diào)控細(xì)胞凋亡、脂肪代謝、細(xì)胞分化、神經(jīng)元發(fā)育等多種病理生理過程。miR-422a是miRNA大家族成員之一，與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、肺癌等多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)有關(guān)[12-13]。在H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡模型[5]中，miR-422a表達(dá)下調(diào)，提示miR-422a可能參與PC12細(xì)胞凋亡調(diào)控。本研究結(jié)果亦顯示，H2O2可下調(diào)PC12細(xì)胞miR-422a表達(dá)，而過表達(dá)miR-422a可增強(qiáng)氧化損傷的PC12細(xì)胞的活力，抑制細(xì)胞凋亡，從而減弱氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。

EPO是主要在肝臟和腎臟產(chǎn)生的一種糖蛋白生血因子，能促進(jìn)紅細(xì)胞生成。有研究[14]證實(shí)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在EPO及其受體基因表達(dá)，且EPO具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用。研究[15]顯示，EPO有強(qiáng)大的神經(jīng)保護(hù)作用，如EPO可明顯增強(qiáng)1-甲基-4苯基吡啶離子等誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞活力，降低細(xì)胞凋亡率。本研究結(jié)果顯示，EPO可增強(qiáng)H2O2誘導(dǎo)氧化損傷的PC12細(xì)胞活力，抑制凋亡，而過表達(dá)miR-422a與EPO聯(lián)合作用在增強(qiáng)細(xì)胞活力和抑制細(xì)胞凋亡方面均優(yōu)于單用。

PI3K/AKT是細(xì)胞內(nèi)一條重要的信號(hào)通路，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，該信號(hào)通路是神經(jīng)元存活的主要途徑之一[16]。有研究[17]表明，PI3K/AKT信號(hào)通路活化對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡起保護(hù)作用。AKT是PI3K/AKT信號(hào)通路的中心環(huán)節(jié)，AKT活化后可通過調(diào)節(jié)下游相關(guān)基因表達(dá)而影響細(xì)胞生物學(xué)過程[18]。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-422a及EPO均可上調(diào)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的p-AKT水平，兩者合用對(duì)p-AKT水平上調(diào)作用更強(qiáng)。提示miR-422a及EPO可能通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受氧化損傷。

綜上所述，過表達(dá)miR-422a及EPO均可抵抗H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化損傷，兩者合用效應(yīng)更強(qiáng)，其機(jī)制可能與激活PI3K/AKT信號(hào)通路有關(guān)；miR-422a可能是神經(jīng)損傷治療的分子靶點(diǎn)之一。