KLF11過表達(dá)對H2O2誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞活力及氧化應(yīng)激水平的影響

王 濱,王文華,辛傳友,郭龍哲,黃傳奇，郜 陽,寧文龍

1)齊齊哈爾市第一醫(yī)院急診內(nèi)科 黑龍江齊齊哈爾 161000 2)齊齊哈爾市第一醫(yī)院風(fēng)濕科 黑龍江齊齊哈爾 161000 3)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科 哈爾濱 150000

氧化應(yīng)激是指各種原因引起的機(jī)體活性氧(reactive oxygen species,ROS)蓄積過量，可引起細(xì)胞壞死，參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展[1]。近些年的研究[2-3]顯示，心肌細(xì)胞凋亡在心力衰竭、冠心病、心肌缺血再灌注等多種心血管損傷病理過程中發(fā)揮重要作用。自由基清除劑、抗氧化劑等可減輕氧化應(yīng)激，降低心肌細(xì)胞凋亡率，從而改善心功能[4]。因此，探索氧化應(yīng)激引起心肌損傷的作用機(jī)制將為心血管疾病的治療提供極大的幫助。Kruppel樣轉(zhuǎn)錄因子家族(Kruppel-like factors，KLF)是一個高度保守的轉(zhuǎn)錄因子家族。KLF11基因是KLF家族成員之一，參與細(xì)胞增殖、凋亡、周期等活動的調(diào)節(jié)[5]。有研究[6]顯示，過表達(dá)KLF11可抑制小鼠心肌肥厚和纖維化，提示KLF11可能是心血管疾病治療的一個分子靶點(diǎn)。本研究以大鼠H9c2心肌細(xì)胞為研究對象，觀察過表達(dá)KLF11對過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞活力、凋亡的影響，并進(jìn)一步探討可能的分子機(jī)制。

1 材料方法

1.1試劑和儀器pcDNA3.1-KLF11及空載體pcDNA3.1購自上海生工生物工程有限公司。DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素和鏈霉素均購自美國Gibco公司；Lipofectamine 2000試劑盒購自美國Invitrogen公司；MTT試劑盒購自美國Sigma公司；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司；SOD檢測試劑盒和MDA檢測試劑盒均購自南京建成生物有限公司；BCA試劑盒購自中國碧云天公司；鼠抗人KLF11、PI3K、p-AKT、Bcl-2和GAPDH單抗均購自美國CST公司；酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司；流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

1.2H9c2細(xì)胞來源及轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞購自上海中科院細(xì)胞庫，用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清及青霉素和鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基，在體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞達(dá)80%～90%融合時，棄去舊培養(yǎng)基，PBS洗滌，加入胰蛋白酶消化1～2 min，倒置顯微鏡下觀察。細(xì)胞由梭形變圓時終止消化，傳代。取生長至對數(shù)期的第3代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞接種于6孔板(2×105個/孔)，常規(guī)培養(yǎng)，融合度達(dá)50%～70%時，分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-KLF11及pcDNA3.1，操作參考Lipofectamine 2000試劑盒說明。采用Western blot法檢測未轉(zhuǎn)染細(xì)胞、轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-KLF11或pcDNA3.1的細(xì)胞中KLF11蛋白的表達(dá)，確定轉(zhuǎn)染效果。KLF11一抗稀釋度1∶500，以GAPDH為內(nèi)參。

1.3實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分4組。空白組：常規(guī)培養(yǎng)H9c2。H2O2組：采用200 μmol/L的H2O2處理H9c2細(xì)胞6 h?？召|(zhì)粒+H2O2組：pcDNA3.1轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞48 h后，采用200 μmol/L的H2O2處理細(xì)胞6 h。KLF11+H2O2組： pcDNA3.1-KLF11轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞48 h后，采用200 μmol/L的H2O2處理細(xì)胞6 h。

1.44組細(xì)胞活力的測定以1×104個/孔接種H9c2細(xì)胞于96孔板，細(xì)胞長至80%～90%時，按照1.3分組處理后，MTT法測定細(xì)胞活力。每孔加5 g/L的MTT試劑20 μL，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4 h，吸棄上清，每孔加入150 μL的DMSO室溫振蕩10 min，使結(jié)晶能夠充分溶解。用酶標(biāo)儀測定490 nm波長處的吸光度(A)，以A值反映細(xì)胞活力。每組設(shè)置5個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.54組細(xì)胞凋亡率的檢測按照1.3分組處理細(xì)胞后，收集細(xì)胞，用PBS洗滌，以不含EDTA的胰蛋白酶消化1～2 min，待細(xì)胞由梭形皺縮變圓時，終止消化，吹打細(xì)胞成細(xì)胞懸液，收集于離心管中，4 ℃條件下1 000 r/min離心10 min，棄上清，PBS洗滌細(xì)胞。收集(1～5)×105個細(xì)胞，加1×Binding buffer 500 μL懸浮，再加5 μL的Annexin V-FITC及5 μL的 PI，混勻，室溫下避光反應(yīng)5～15 min，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測。每組設(shè)置3個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.64組細(xì)胞中SOD活力及MDA含量檢測分組處理細(xì)胞后，采用SOD檢測試劑盒及MDA檢測試劑盒檢測細(xì)胞中SOD活力及MDA含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.74組細(xì)胞中PI3K、p-AKT和Bcl-2蛋白表達(dá)的檢測分組處理結(jié)束后，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，按照4∶1的比例將蛋白樣品與上樣緩沖液混勻于EP管中，煮沸變性5 min。每孔蛋白上樣40 μg，經(jīng)SDS-PAGE分離，電泳后電轉(zhuǎn)PVDF膜，將膜用50 mL的50 g/L脫脂奶粉溶液于37 ℃封閉2 h。棄掉封閉液，加入經(jīng)封閉液稀釋的一抗(1∶500稀釋的PI3K、p-AKT或Bcl-2抗體，1∶1 000稀釋的GAPDH抗體)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，加經(jīng)封閉液稀釋的HRP標(biāo)記的二抗(1∶2 000稀釋)，于37 ℃恒溫箱中孵育1 h，洗膜。暗室中ECL顯色、顯影。用Quantity One分析各蛋白條帶灰度值。以目的蛋白與內(nèi)參條帶灰度值的比值表示目的蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0進(jìn)行分析，3組間KLF11蛋白表達(dá)水平的比較，4組細(xì)胞活力、凋亡率、SOD活力、MDA含量、PI3K、p-AKT和Bcl-蛋白表達(dá)水平的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1轉(zhuǎn)染效果見圖1。未轉(zhuǎn)染細(xì)胞、pcDNA3.1轉(zhuǎn)染細(xì)胞和pcDNA3.1-KLF11轉(zhuǎn)染細(xì)胞中KLF11蛋白表達(dá)水平分別為(0.102±0.011)、(0.109±0.012)和(0.476±0.051)，3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=143.727，P<0.001);pcDNA3.1-KLF11轉(zhuǎn)染細(xì)胞KLF11蛋白表達(dá)高于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞和pcDNA3.1轉(zhuǎn)染細(xì)胞(P<0.05)，說明pcDNA3.1-KLF11轉(zhuǎn)染效果顯著。

1、2、3：分別為未轉(zhuǎn)染細(xì)胞、pcDNA3.1轉(zhuǎn)染細(xì)胞和pcDNA3.1-KLF11轉(zhuǎn)染細(xì)胞

圖13組H9c2細(xì)胞中KLF11蛋白的表達(dá)

2.24組細(xì)胞活力和凋亡率的比較見表1。與空白組比較，H2O2組細(xì)胞活力降低，凋亡率增加；與H2O2組比較，KLF11+H2O2組細(xì)胞活力增加，凋亡率降低。

表1 4組細(xì)胞活力和凋亡率的比較

*：與空白組比較，P<0.05；#：與H2O2組比較，P<0.05

2.34組細(xì)胞SOD活力和MDA含量的比較見表2。與空白組比較，H2O2組細(xì)胞SOD活力降低，MDA含量增加；與H2O2組比較，KLF11+H2O2組細(xì)胞SOD活力增加，MDA含量降低。

表2 4組細(xì)胞SOD活力和MDA含量的比較

*：與空白組比較，P<0.05；#：與H2O2組比較，P<0.05

2.44組細(xì)胞PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的比較結(jié)果見圖2和表3。H2O2組細(xì)胞PI3K、p-AKT和Bcl-2表達(dá)均較空白組降低，而KLF11+H2O2組細(xì)胞PI3K、p-AKT和Bcl-2表達(dá)較H2O2組升高(P<0.05)。

1、2、3、4：分別為空白組、H2O2組、空質(zhì)粒+H2O2組、KLF11+H2O2組

圖2 4組H9c2細(xì)胞PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

*：與空白組比較，P<0.05；#：與H2O2組比較，P<0.05

3 討論

研究[7]表明，氧自由基(也稱ROS)參與多種心血管疾病的病理進(jìn)程。ROS可由活化的心肌細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等產(chǎn)生。當(dāng)機(jī)體ROS過量產(chǎn)生時，可引起線粒體脂質(zhì)過氧化，抑制線粒體功能，最終導(dǎo)致心肌ATP生成減少[8]，可引起心肌細(xì)胞損傷。此外，ROS過量產(chǎn)生還可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)DNA斷裂，破壞核酸，引起染色體畸變，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[9]。有研究[10]發(fā)現(xiàn)，200 μmol/L的H2O2處理H9c2細(xì)胞，細(xì)胞存活率約為50%，提示該濃度H2O2能兼顧適量的細(xì)胞死亡率及氧化應(yīng)激損傷，因此本研究中選擇該濃度為誘導(dǎo)劑量。

KLF11基因是KLF基因家族成員之一，在肝臟、肌肉、胰腺等多種組織中廣泛表達(dá)，參與細(xì)胞糖脂代謝、增殖等多種生理病理過程。目前對KLF11的研究多集中于腫瘤方面，在心血管方面的研究極少。有研究[11]顯示，KLF11對缺血損傷后的腦血管有保護(hù)作用，過表達(dá)KLF11可抑制小鼠心肌肥厚和纖維化[6]，提示KLF11在心血管疾病進(jìn)程中有重要作用。本研究結(jié)果顯示，H2O2可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞H9c2凋亡，提高其氧化應(yīng)激水平，表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)SOD活力降低，MDA含量增加；而過表達(dá)KLF11可提高H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中SOD活力，降低MDA含量。提示KLF11對心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用與降低氧化應(yīng)激水平有關(guān)。

PI3K/AKT是細(xì)胞內(nèi)一條重要的信號途徑，廣泛參與細(xì)胞增殖、凋亡、分化等生物學(xué)過程的調(diào)控。AKT是PI3K下游的重要激酶，被磷酸化激活后可通過調(diào)節(jié)下游的一系列靶蛋白，參與細(xì)胞生物學(xué)過程的調(diào)控[12-13]。已有大量研究[14-15]表明，激活PI3K/AKT信號通路對心肌損傷有保護(hù)作用。本研究Western blot法檢測結(jié)果顯示，H2O2可降低H9c2細(xì)胞中PI3K、p-AKT和Bcl-2的表達(dá)水平，而過表達(dá)KLF11可增強(qiáng)H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞中PI3K、p-AKT和Bcl-2表達(dá)。提示KLF11可能通過激活PI3K/AKT信號通路，減弱氧化應(yīng)激引起的心肌細(xì)胞損傷。

綜上所述，KLF11可減弱H2O2對H9c2細(xì)胞的活力抑制、凋亡促進(jìn)作用，機(jī)制可能與抑制氧化應(yīng)激和激活PI3K/AKT信號通路有關(guān)。KLF11可能是心血管疾病治療的有效靶點(diǎn)之一。