黑枸杞花青素提取工藝優(yōu)化和含量測(cè)定

鞏芳芳，廖碧芳，董佳佳，于 斐，劉利娥，李文杰

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室 鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院 鄭州 450001

花青素是普遍存在于深色植物中的一類水溶性天然色素，具有抗氧化、抗腫瘤、降低血栓形成風(fēng)險(xiǎn)等多種功能[1-2]，近年來(lái)引起諸多學(xué)者的關(guān)注。黑枸杞是傳統(tǒng)的中藥，成熟漿果呈現(xiàn)黑色，花青素含量極其豐富，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的花青素含量最多的天然野生植物，是提取天然花青素的最佳原材料。但天然花青素化學(xué)結(jié)構(gòu)缺少一個(gè)電子，極易受到活性氧基團(tuán)和自由電子攻擊而降解，穩(wěn)定性較差，不同pH、光照、氧、溶劑、溫度變化以及蛋白質(zhì)和一些金屬離子都會(huì)引起花青素結(jié)構(gòu)和組成發(fā)生變化，給花青素的提取帶來(lái)了很大的挑戰(zhàn)。

目前花青素的提取方法主要有有機(jī)溶劑提取、超聲波輔助提取、微波輔助提取、超臨界流體萃取和酶輔助法提取等。用正交實(shí)驗(yàn)或響應(yīng)面可對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。采用單一pH法、pH示差法[3-6]、差減法和高效液相色譜法等可對(duì)花青素含量和組分進(jìn)行測(cè)定。正交實(shí)驗(yàn)所需的實(shí)驗(yàn)次數(shù)少，數(shù)據(jù)點(diǎn)分布均勻，但是無(wú)法找到因素和響應(yīng)值之間明確的函數(shù)表達(dá)式。相較于正交實(shí)驗(yàn)，響應(yīng)面分析法得到的回歸方程精準(zhǔn)度高，可以明確找到各因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值。測(cè)定花青素的方法中，單一pH法和差減法操作簡(jiǎn)單，但是準(zhǔn)確率較低；高效液相色譜法準(zhǔn)確率較高，但標(biāo)準(zhǔn)品昂貴且不穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)以體積分?jǐn)?shù)70%酸性乙醇為提取液，采用超聲波輔助法提取黑枸杞中的花青素，采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，應(yīng)用pH示差法測(cè)定花青素含量，并比較不同產(chǎn)地黑枸杞中花青素含量的差異，以期為天然產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)利用提供一定的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1主要儀器與試劑UV-1601分光光度計(jì)、UV-1000紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京華科儀科技股份有限公司)，高速粉碎機(jī)(廣州旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司)，KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司)，電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱(深圳大都工業(yè)有限公司)。氯化鉀(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)，醋酸鈉(北京康普匯維科技有限公司)，醋酸、體積分?jǐn)?shù)95%乙醇、鹽酸(洛陽(yáng)市昊華化學(xué)試劑有限公司)，實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。黑枸杞產(chǎn)地分別為寧夏中衛(wèi)和石嘴山，新疆阿克蘇、庫(kù)爾勒、阿勒泰、喀什、吐魯番和哈密，青海德令哈、諾木洪和格爾木，內(nèi)蒙古烏拉特前旗、額濟(jì)納旗和烏蘭察布，甘肅酒泉、敦煌、武威市和白銀，西藏拉薩、山南和日喀則。

1.2樣品前處理去除黑枸杞根部，置恒溫干燥箱中，60 ℃干燥至恒重后密閉冷卻，用高速粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40目篩，收集后放置在具塞廣口瓶中密封避光保存。

1.3花青素的提取

1.3.1 提取工藝 稱取吐魯番黑枸杞粉末1 g，采用體積分?jǐn)?shù)為70%的酸化乙醇提取。初步設(shè)定料(g)液(mL)比為1∶20，超聲波提取功率為50%，提取溫度為40 ℃，提取時(shí)間為20 min，保持其中3個(gè)因素不變，改變另一個(gè)因素。隨后取花青素提取液3 mL，5 000 r/min離心3 min。轉(zhuǎn)移上清至另一個(gè)離心管中，錫箔紙包裝，密封，放置在冰箱中冷藏。采用文獻(xiàn)[7]的方法分析料液比、超聲波提取功率、提取溫度和提取時(shí)間對(duì)黑枸杞中花青素提取率的影響，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2 優(yōu)化方法 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇單因素最適濃度范圍，用Box-Behnken設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)提取黑枸杞花青素。

表1 響應(yīng)面因素水平

1.4花青素含量的測(cè)定

1.4.1 波長(zhǎng)確定 將花青素提取液用UV-1601分光光度計(jì)在400～700 nm范圍內(nèi)掃描，測(cè)定花青素提取液分別在pH 1.0和pH 4.5緩沖溶液中的吸光度，吸光度出現(xiàn)最大差值時(shí)所處的波長(zhǎng)(525 nm)為測(cè)定的最佳波長(zhǎng)。對(duì)于渾濁樣品，則需要同時(shí)測(cè)定樣品在700 nm處的吸光度[6]。

1.4.2 花青素含量的測(cè)定 取樣品提取液80 μL，分別加入pH 1.0的緩沖溶液和pH 4.5的緩沖溶液稀釋至8 mL，搖勻后置40 ℃的恒溫水浴鍋中平衡，pH 1.0的緩沖溶液平衡時(shí)間為30 min，pH 4.5的緩沖溶液平衡時(shí)間為20 min。隨后測(cè)定兩種不同pH提取液在525 nm和700 nm處的吸光值，按公式[4]計(jì)算花青素的提取率和含量，每個(gè)樣品測(cè)量3次，取均值。

2 結(jié)果

2.1花青素提取工藝的單因素結(jié)果見(jiàn)圖1?；ㄇ嗨靥崛÷孰S著提取溫度、提取時(shí)間、提取功率、料液比增大均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。故在提取溫度30～50 ℃，提取時(shí)間20～30 min，提取功率為60%，料液比1∶20～1∶40范圍進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

2.2花青素提取工藝優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的因素和水平，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)與結(jié)果

利用Design-Expert 軟件進(jìn)行回歸擬合和方差分析，花青素提取率的回歸方程為：Y=1.71-0.041A+0.14B-0.029C+0.05AB-0.077AC+0.042BC-0.065A2-0.1B2-0.16C2?；貧w模型的R2=0.951 6，RAdj=0.889 5，說(shuō)明該模型與實(shí)際擬合程度較好。交互作用分析圖見(jiàn)圖2。從模型分析結(jié)果可知，一次項(xiàng)因素B、交互項(xiàng)AC和二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)黑枸杞花青素提取率的影響顯著(F=55.200、8.031、6.081、14.960、35.202，P=0.001、0.025、0.043、0.006、0.001)。以上3個(gè)因素對(duì)花青素提取率的作用不是直接的線性關(guān)系，其對(duì)花青素提取率影響為提取時(shí)間>提取溫度>料液比。

通過(guò)回歸方程確定的最佳提取工藝為：提取溫度39.41 ℃，提取時(shí)間28.38 min，料液比1.00∶30.13。此條件下花青素提取率的理論值最大為1.755%。為方便實(shí)際操作，最佳提取工藝設(shè)定為提取溫度39 ℃，提取時(shí)間28 min，料液比1∶30。取6份等量的吐魯番黑枸杞粉末按最佳提取工藝進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，平均提取率為1.701%，與理論值的相對(duì)誤差為3.17%，偏差較小。

A:料液比和提取溫度；B：提取時(shí)間和料液比；C：提取溫度和提取時(shí)間

2.3不同產(chǎn)地黑枸杞中花青素含量的測(cè)定西藏的山南和日喀則的黑枸杞中花青素的含量最高，分別為0.030 1和0.025 3 g/g。內(nèi)蒙古的烏蘭察布、額濟(jì)納旗，甘肅的武威市和寧夏的石嘴山花青素含量也較高，分別為0.027 9、0.021 2、0.020 4、0.022 3 g/g。新疆的阿克蘇、庫(kù)爾勒、阿勒泰、喀什、吐魯番和哈密，青海的德令哈、諾木洪和格爾木，內(nèi)蒙古的烏拉特前旗，西藏的拉薩和寧夏的中衛(wèi)的黑枸杞中花青素含量較為平均，差異較小，分別為0.015 6、0.017 8、0.015 4、0.015 1、0.017 1、0.016 9、0.015 6、0.016 7、0.018 2、0.016 7、0.019 3、0.017 9 g/g。甘肅的酒泉、敦煌和白銀的花青素含量較低，分別為0.012 5、0.014 8、0.015 4 g/g。這可能是不同產(chǎn)地的氣候條件和土壤因素有差異，導(dǎo)致黑枸杞得到的光照、降水量和營(yíng)養(yǎng)成分不同，對(duì)花青素的合成和積累造成影響。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用超聲輔助法提取黑枸杞中天然花青素，并對(duì)提取工藝進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。得到提取花青素的最佳工藝為：提取溫度39 ℃，提取時(shí)間28 min，料液比1∶30，超聲功率60%。經(jīng)驗(yàn)證后，理論值與實(shí)際值的偏差較小，可用于實(shí)際樣品中天然花青素的提取。采用此工藝，對(duì)不同產(chǎn)地的黑枸杞中花青素進(jìn)行提取和測(cè)定，結(jié)果表明黑枸杞中花青素的含量豐富，其中產(chǎn)自西藏的黑枸杞花青素含量最高，產(chǎn)自甘肅的黑枸杞花青素含量較低。導(dǎo)致差異的原因可能是西藏地區(qū)海拔較高，日照時(shí)間較長(zhǎng)，晝夜溫差較大，土壤有機(jī)質(zhì)沉積明顯，降水量分布都有利于黑枸杞的生長(zhǎng)發(fā)育，使得黑枸杞中含有豐富的花青素；而甘肅的光照雖然充分，但其氣候干燥少雨，氣溫較低。相較而言，西藏的氣候和土壤條件更能滿足黑枸杞對(duì)水量和光照的要求，說(shuō)明產(chǎn)地的氣候條件和土壤條件會(huì)對(duì)黑枸杞中花青素含量產(chǎn)生影響。本論文可為黑枸杞中天然花青素提取和開(kāi)發(fā)利用提供一定理論依據(jù)。