重癥肌無力患者胸腺組織中差異表達(dá)信號(hào)通路分子的篩查

宋 歌, 劉萍萍，李 靜，李倩如，高 峰，張清勇，崔新征，杜 英

1)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系 鄭州 450001 2)河南省紅十字血液中心 鄭州 450008 3)鄭州大學(xué)醫(yī)藥科學(xué)研究院 鄭州 450052 4)河南省人民醫(yī)院重癥肌無力綜合診療中心 鄭州 450003

重癥肌無力(myasthenia gravis，MG)是由針對(duì)乙酰膽堿受體(acetylcholine receptor，AChR)的高親和力IgG抗體(AChR-Ab)介導(dǎo)的自身免疫性疾病[1]，骨骼肌收縮無力為其主要癥狀。已證實(shí)胸腺是MG患者產(chǎn)生AChR-Ab的主要部位，MG患者胸腺不僅存在T細(xì)胞亞群比例異常,還存在異位生發(fā)中心，且能從其中分離出產(chǎn)生自身抗體的B細(xì)胞，切除胸腺能使病情得到緩解[2-3]。這些證據(jù)都提示胸腺與MG的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，但其機(jī)制迄今仍不清楚。研究[4]顯示T細(xì)胞與胸腺發(fā)育分化中一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程密切相關(guān)[5-6]，而且多種信號(hào)通路分子與T細(xì)胞亞群形成相關(guān)[7]。目前在疾病狀態(tài)下T細(xì)胞在胸腺分化異常中的機(jī)制尚不清楚。為進(jìn)一步探討MG的發(fā)病機(jī)制、揭示MG胸腺組織中影響免疫細(xì)胞分化的關(guān)鍵分子，本研究應(yīng)用人信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)現(xiàn)者基因芯片篩查MG胸腺差異表達(dá)分子，并分析信號(hào)通路在MG患者T細(xì)胞異常分化中的作用，為進(jìn)一步研究指明方向。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象臨床確診的MG患者3例(來自河南省人民醫(yī)院重癥肌無力綜合診療中心)，自身抗體AChR-Ab水平均高于正常，年齡12～17歲，男1例，女2例，患者均接受胸腺切除術(shù)，胸腺組織病理學(xué)分型為胸腺增生型對(duì)照組3例，男1例，女2例，年齡6～20歲，均為非自身免疫性心臟病患者(來自鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院胸外科)，在接受心臟手術(shù)時(shí)因暴露手術(shù)視野切除部分胸腺組織。研究取材經(jīng)鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)和患者知情同意。

1.2主要試劑Trizol試劑和cDNA合成反轉(zhuǎn)錄酶為Invitrogen公司產(chǎn)品，RNA純化試劑盒為Qiagen公司產(chǎn)品，RNase Inhibitor為Epicentre公司產(chǎn)品，2×SuperArray PCR master mix (Cat. No. PA-112)和人信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)現(xiàn)者基因芯片為SABiosciences公司產(chǎn)品。Tris-HCl、EDTA、瓊脂糖等購(gòu)自華美生物工程公司，氯仿、異丙醇、乙醇、乙酸鈉、甲醛等購(gòu)自上?；瘜W(xué)試劑有限公司。

1.3胸腺組織RNA抽提、純化和cDNA合成每例均取50 mg胸腺組織，加入1 mL Trizol試劑研磨制成勻漿。常規(guī)提取RNA，經(jīng)乙醇清洗、干燥，用不含RNA酶的水溶解。按照產(chǎn)品說明書將RNA溶液過柱(RNeasy MinElute Spin Column)、洗脫，獲得純化RNA，并檢測(cè)RNA質(zhì)量和純度。取1.5 μg RNA，加入500 mg/L oligo(dT)1 μL，10 nmol/L dNTPs Mix 1 μL，加滅菌水至13 μL，混勻，置65 ℃ 5 min，冰上1 min，離心后依次加入5×First-Strand Buffer 4 μL、0.1 mol/L DTT 1 μL、RNase Inhibitor 1 μL、SuperScript Ⅲ RT 1 μL，混勻，50 ℃溫育60 min，70 ℃ 15 min使酶失活。每20 μL cDNA加91 μL滅菌水混勻，-20 ℃保存。

1.4胸腺組織信號(hào)通路差異表達(dá)基因的檢測(cè)分別取2組已稀釋的cDNA 102 μL，加入2× SuperArray PCR master mix 550 μL，ddH2O 448 μL。取10 μL混合液加至人信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)現(xiàn)者基因芯片(表1)，加蓋密封，置于實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)。95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。收集熒光，進(jìn)行溶解曲線分析。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的表達(dá)水平。

表1 人信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)現(xiàn)者基因芯片所含信號(hào)通路及基因

1.5qRT-PCR驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步證實(shí)芯片的檢測(cè)結(jié)果，針對(duì)FOSL1、SOCS3、CCL5基因進(jìn)行qRT-PCR。取留存的胸腺組織提取RNA，經(jīng)qRT-PCR分析，結(jié)果與芯片結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。所用引物序列如下，SOCS3：5’-CCCCAGAAGAGCCTATTACAT-3’,5’-TCCAGGAACTCCCGAGTG-3’;FOSL1: 5’-CTGCTGCTACTCTTGCGATG-3’,5’-TGACCACACACCCTCCCTAACT-3’; CCL5:5’-CCATATTCCTCGGACACCAC-3’,5’-GGTGACAAAGACGACTGCTG-3’。按照SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa公司)產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作。同上計(jì)算目的基因表達(dá)水平。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0處理數(shù)據(jù)。采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較2組基因表達(dá)的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1RNA質(zhì)量鑒定對(duì)照組和MG組胸腺組織總RNA經(jīng)變性電泳，所有樣本均顯示出28S、18S和5S核糖體RNA條帶，并可見彌散的mRNA，說明所提RNA樣本符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

2.2MG胸腺組織中信號(hào)通路差異基因的篩選芯片檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，MG組18個(gè)基因表達(dá)升高，4個(gè)表達(dá)降低，見表2。

表2 MG組與對(duì)照組胸腺組織差異表達(dá)基因的表達(dá)水平

2.3驗(yàn)證結(jié)果見表3。MG組胸腺組織SOCS3、FOSL1的表達(dá)高于對(duì)照組，而兩組CCL5的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與芯片結(jié)果基本一致。

表3 SOCS3、FOSL1和CCL5mRNA表達(dá)的qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果

3 討論

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是決定T細(xì)胞發(fā)育、分化成熟和功能的關(guān)鍵因素。本研究對(duì)MG患者胸腺組織信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行基因芯片檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)20多種差異表達(dá)的信號(hào)分子，涉及Notch、WNT、JAK/STAT、NF-κB、TGF-β等多條信號(hào)通路。文獻(xiàn)[8]顯示，細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制分子SOCS1和SOCS3是早期胸腺細(xì)胞發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其缺乏會(huì)干擾胸腺發(fā)育。缺乏干擾素調(diào)節(jié)因子1(IRF1)的小鼠表現(xiàn)為胸腺和外周淋巴器官中成熟CD8+T細(xì)胞數(shù)量減少，說明IRF1在CD8+T細(xì)胞分化中起關(guān)鍵作用[9]。HES1是轉(zhuǎn)錄因子發(fā)狀分裂相關(guān)增強(qiáng)子中的一個(gè)成員，是Notch信號(hào)通路中影響T細(xì)胞分化的關(guān)鍵分子[10]。WNT通路中FOS樣抗原1(FOS-like antigen 1,FOSL1)的作用是與Jun蛋白形成二聚體，組成激活蛋白1，通過激活蛋白1與DNA結(jié)合，參與細(xì)胞的增殖和分化，抑制細(xì)胞凋亡[11]。上皮膜蛋白1(epithelial membrane protein 1，EMP1)、生長(zhǎng)阻滯和DNA損傷誘生蛋白45B(growth arrest and DNA-damage-inducible protein 45β，GADD45B)是TGF-β信號(hào)通路分子。有報(bào)道[12]顯示EMP1與細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化、惡化相關(guān)，也有報(bào)道[13]EMP1抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡，這些結(jié)果的不一致提示EMP1在不同細(xì)胞中可能以不同的方式發(fā)揮作用。GADD45B是抑制細(xì)胞凋亡的基因， 主要通過調(diào)控p53和JNK發(fā)揮作用[14]；GADD45B還是TGF-β的下游基因，即TGF-β通過調(diào)控GADD45B而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)及促進(jìn)凋亡[15]。阻斷GADD45B表達(dá)，TGF-β對(duì)M1細(xì)胞的促凋亡作用降低[16]。另外，在T細(xì)胞中，GADD45B基因可由TCR或炎癥信號(hào)快速誘導(dǎo)產(chǎn)生，缺乏GADD45B的CD4+T細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞受體刺激或炎癥細(xì)胞因子的反應(yīng)性降低，產(chǎn)生細(xì)胞因子的能力也降低[17]。Castellani等[18]發(fā)現(xiàn)，ADM及其共受體蛋白R(shí)AMP2存在于新生兒胸腺上皮細(xì)胞(thymic epithelial cells, TECs)內(nèi)，并通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)ADM在大鼠TECs中通過與細(xì)胞核內(nèi)受體相互作用，調(diào)節(jié)NF-κB基因轉(zhuǎn)錄，減少IL-6分泌；因此認(rèn)為ADM在自身免疫病中起保護(hù)作用，且TECs的ADM系統(tǒng)可能是免疫調(diào)節(jié)藥物的一個(gè)新的潛在靶點(diǎn)。絲氨酸蛋白酶抑制劑家族E成員1(serine proteinase inhibitor family E member 1，SERPINE1)是一種損傷早期的反應(yīng)因子，在細(xì)胞成熟和增殖中具有調(diào)節(jié)作用[19]。

綜上所述，芯片篩查結(jié)果顯示SOCS3、IRF1、HES1、FOSL1、EMP1、GADD45B、ADM、SERPINE1等在MG患者胸腺組織中的表達(dá)升高，提示它們與胸腺異常及MG疾病的發(fā)生有關(guān)。上述分子涉及不同信號(hào)通路，通過不同方式調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡。本研究結(jié)果有助于開拓MG研究的新方向，也將為深入研究胸腺細(xì)胞異常發(fā)育、MG胸腺異常及疾病發(fā)生機(jī)制提供新思路。