重組人MG53蛋白激活A(yù)kt/GSK-3β通路降低LPS誘導(dǎo)的hUC-MSCs氧化損傷

王亞蘋(píng)，張振坤，李 喆，劉騰飛，黃團(tuán)結(jié)，周馨魁， 麻建杰，關(guān)方霞，馬珊珊

1)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 鄭州450001 2)美國(guó)俄亥俄州立大學(xué)戴維斯心肺研究所 哥倫布市 43210

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)是一種常見(jiàn)的種子細(xì)胞，為創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)等難治性疾病的治療帶來(lái)希望。但是，TBI后由于組織缺血和炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平上升，繼而引起組織病變和細(xì)胞死亡，抑制外源干細(xì)胞的遷移和存活，降低了干細(xì)胞的治療效果。MG53蛋白(mitsugumin53 protein)是心肌、骨骼肌特異性蛋白，主要存在于細(xì)胞漿和細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)。在細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)損傷后，MG53 蛋白可在胞外鈣的作用下由胞漿轉(zhuǎn)移到胞膜破裂位點(diǎn)，修復(fù)受損細(xì)胞[1]。外源性給予重組人MG53蛋白，還可修復(fù)非肌細(xì)胞的膜損傷，對(duì)多種細(xì)胞和組織損傷具有保護(hù)作用[2-4]。研究[5]證明，MG53蛋白能夠和磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)的p85亞基結(jié)合，使其下游的Akt和GSK-3β的磷酸化增加，激活RISK信號(hào)通路，從而減輕心肌梗死的嚴(yán)重程度。我們的前期研究[6]發(fā)現(xiàn)重組人MG53蛋白對(duì)H2O2誘導(dǎo)的hUC-MSCs氧化損傷具有保護(hù)作用。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)能夠引起多種細(xì)胞氧化損傷。本研究利用LPS誘導(dǎo)hUC-MSCs氧化損傷細(xì)胞模型，評(píng)價(jià)重組人MG53對(duì)hUC-MSCs氧化損傷的保護(hù)作用，探討可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料hUC-MSCs由課題組前期培養(yǎng)凍存。重組人MG53蛋白(相對(duì)分子質(zhì)量53 000，干粉)由美國(guó)俄亥俄州立大學(xué)麻建杰教授贈(zèng)送，LPS購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(FBS)、DMEM/F-12(HAM)1∶1培養(yǎng)基和磷酸鹽緩沖液(PBS)購(gòu)于以色列BI公司，CCK-8試劑盒購(gòu)于蘇州宇恒生物科技有限公司，AO-EB試劑盒和JC-1 線粒體膜電位熒光探針購(gòu)于北京索萊寶公司，ROS檢測(cè)試劑盒購(gòu)于碧云天公司，丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)酶標(biāo)法測(cè)定試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所，β-actin兔多克隆抗體購(gòu)于武漢三鷹生物有限公司，磷酸化(p-)Akt、Akt、p-GSK-3β和GSK-3β兔多克隆抗體購(gòu)于萬(wàn)類(lèi)生物有限公司。

1.2hUC-MSCs氧化損傷模型的建立第3代hUC-MSCs 培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，用胰蛋白酶消化，接種于96孔板，每孔加入100 μL(密度為2.5×103個(gè)/mL)細(xì)胞懸液，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。16～18 h后，待細(xì)胞融合度達(dá)60%，棄去原培養(yǎng)液，PBS清洗2次，加入完全培養(yǎng)基配制的不同質(zhì)量濃度的LPS(0.5、1.0、10.0、25.0、50.0、100.0、200.0 mg/L)，每個(gè)濃度組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；分別于24、48和72 h后，棄培養(yǎng)液，每孔加入100 μL含體積分?jǐn)?shù)10% CCK-8溶液的無(wú)血清培養(yǎng)基，37 ℃繼續(xù)孵育2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)。以不加LPS處理的細(xì)胞為對(duì)照。空白孔只加含體積分?jǐn)?shù)10%CCK-8的培養(yǎng)基。存活率=[(A實(shí)驗(yàn)孔-A空白孔)/(A陰性對(duì)照孔-A空白孔)]×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，后續(xù)實(shí)驗(yàn)條件設(shè)定為200 mg/L LPS處理hUC-MSCs 48 h。

1.3CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活力取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hUC-MSCs接種于96孔板。實(shí)驗(yàn)設(shè)4組，分別為CON組(不處理)、LPS組(加入200 mg/L LPS)、MG53組(加入30 mg/L重組人MG53蛋白)和LPS+MG53組(同時(shí)加入重組人MG53蛋白和LPS)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。處理48 h后CCK-8法測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處的A，計(jì)算細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4細(xì)胞凋亡檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hUC-MSCs 接種于6孔板，按1.3分組處理48 h后，棄去原培養(yǎng)基，PBS洗去殘余培養(yǎng)基和未貼壁細(xì)胞，加入1 mL PBS。將AO溶液和EB溶液按1∶1混合成工作液(現(xiàn)用現(xiàn)配)。每孔添加20 μL工作液，輕輕搖勻，室溫放置5 min后，在熒光顯微鏡下觀察、拍照。細(xì)胞凋亡率為紅綠熒光的比值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5線粒體膜電位檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hUC-MSCs 接種于6孔板，按1.3分組處理48 h后，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗2次，將細(xì)胞與5 μmol/L JC-1在37 ℃下孵育20 min，棄上清，然后用JC-1染色緩沖液洗滌2次，洗去未反應(yīng)的探針，每孔加入2 mL細(xì)胞培養(yǎng)基，30 min內(nèi)于熒光顯微鏡下觀察和拍照。熒光強(qiáng)度使用Image J軟件分析。用綠紅熒光的比值來(lái)衡量線粒體去極化的比例，代表線粒體膜電位。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6細(xì)胞內(nèi)ROS水平檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hUC-MSCs 接種于6孔板，按1.3分組處理48 h后，收集細(xì)胞，用以無(wú)血清培養(yǎng)液按1∶1 000稀釋的DCFH-DA懸浮細(xì)胞，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。期間每隔3 min上下顛倒混勻一次，使探針和細(xì)胞充分接觸。裝載完成后用無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，充分去除多余的DCFH-DA。30 min后，設(shè)置488 nm激發(fā)波長(zhǎng)，525 nm發(fā)射波長(zhǎng)，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，代表ROS水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7細(xì)胞內(nèi)MDA含量、SOD活性和CAT活性測(cè)定取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hUC-MSCs接種于96孔板，按1.3分組處理48 h后，收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL，超聲波細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞，用微量分光光度計(jì)測(cè)定蛋白濃度，按照MDA、SOD和CAT測(cè)定試劑盒的說(shuō)明書(shū)操作。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8Western blot法檢測(cè)Akt/GSK-3β信號(hào)通路蛋白的表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hUC-MSCs 接種于6孔板，按1.3分組處理48 h后，收集細(xì)胞提取蛋白，利用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，隨后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，然后在室溫下用80 g/L(TBST)脫脂乳封閉2 h，加一抗 (β-actin兔多克隆抗體按1∶2 000稀釋，p-Akt、Akt、p-GSK-3β和GSK-3β兔多克隆抗體按1∶500稀釋)，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，加二抗(山羊抗兔HRP按1∶2 000稀釋)室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，化學(xué)發(fā)光法顯色，暗室曝光，所得條帶用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 19.0處理數(shù)據(jù)。采用3×7析因設(shè)計(jì)的方差分析比較不同質(zhì)量濃度LPS作用不同時(shí)間后hUC-MSCs存活率的差異；4組細(xì)胞存活率、凋亡率、線粒體膜電位、ROS水平、MDA含量、SOD活性和CAT活性以及相關(guān)蛋白表達(dá)的比較采用2×2析因設(shè)計(jì)的方差分析；檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1hUC-MSCs氧化損傷模型的建立結(jié)果見(jiàn)表1。LPS對(duì)hUC-MSCs的損傷和抑制作用具有濃度和時(shí)間依賴性。200 mg/L LPS處理48 h后，hUC-MSCs存活率接近50%，故選用此實(shí)驗(yàn)條件用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 不同質(zhì)量濃度LPS對(duì)hUC-MSCs存活率的影響(n=3) %

F時(shí)間=279.770,F濃度=360.018,F交互=22.900,P均<0.001

2.2重組人MG53蛋白對(duì)LPS誘導(dǎo)的 hUC-MSCs細(xì)胞活力和凋亡的影響結(jié)果見(jiàn)表2。與LPS組相比，LPS+MG53組細(xì)胞存活率升高，凋亡率下降。

2.3重組人MG53蛋白對(duì)LPS誘導(dǎo)的 hUC-MSCs線粒體膜電位變化的影響由圖1和表3可知，與CON組相比，LPS組線粒體膜電位升高，而LPS+MG53組較LPS組降低。

2.4重組人MG53蛋白對(duì)LPS誘導(dǎo)的hUC-MSCs內(nèi)ROS水平、MDA含量、SOD和CAT活性的影響結(jié)果見(jiàn)表3，由表3可知，與CON組相比，LPS組hUC-MSCs內(nèi)ROS和MDA含量增加，SOD和CAT活性降低。然而，重組人MG53蛋白處理較好地逆轉(zhuǎn)了LPS誘導(dǎo)的這些變化。

2.5重組人MG53蛋白對(duì)LPS誘導(dǎo)的hUC-MSCs Akt/GSK-3β信號(hào)通路的影響由圖2和表4可知，LPS抑制p-Akt和p-GSK-3β的表達(dá)，而LPS+MG53組 p-Akt 和p-GSK-3β表達(dá)增加，但是Akt和GSK-3β的表達(dá)沒(méi)有明顯變化。

表2 4組hUC-MSCs存活率、凋亡率的比較 %

組別線粒體膜電位ROS水平MDA含量/(nmol/mg)SOD活性/(U/mg)CAT活性/( U/mg)CON組7.60±0.2573 075.77±2 842.030.52±0.16610.39±18.67637.34±4.18LPS組42.95±2.57125 393.30±5 410.000.95±0.01284.09±9.86377.18±11.49MG53組7.68±0.5561 488.07±3 341.130.54±0.09644.60±27.55727.50±4.99LPS+MG53組19.75±3.6484 088.23±3 694.470.65±0.01415.68±39.45570.25±20.06FLPS(P)403.836(<0.001)301.615(<0.001)31.172(<0.001)351.079(<0.001)1 001.982(<0.001) FMG53(P)95.998(<0.001)150.341(<0.001)8.841(0.018)31.308(<0.001)461.338(<0.001)F交互(P)97.343(<0.001)47.457(<0.001)10.722(0.011)10.798(0.011)60.912(<0.001)

1～4：分別為CON組、LPS組、MG53組、LPS+MG53組

表4 4組hUC-MSCs Akt/GSK-3β信號(hào)通路蛋白表達(dá)的比較(n=3)

3 討論

重組人MG53蛋白在組織損傷和細(xì)胞膜損傷修復(fù)中發(fā)揮關(guān)鍵性的作用，應(yīng)用于神經(jīng)退行性疾病、缺血再灌注損傷、心肌損傷和骨骼肌損傷中均顯示出損傷修復(fù)的作用[7-8]。本研究建立了LPS誘導(dǎo)hUC-MSCs氧化損傷的細(xì)胞模型，與LPS誘導(dǎo)骨髓干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞損傷表現(xiàn)[9-11]一致。本研究發(fā)現(xiàn)，重組人MG53蛋白顯著改善了受損的hUC-MSCs的存活，并抑制了凋亡。此外，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與線粒體途徑功能障礙有關(guān)[12]。我們發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)hUC-MSCs損傷后，細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位降低，而重組人MG53蛋白則可改善這種情況。ROS為氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵因素，本課題組前期實(shí)驗(yàn)[13]證明重組人MG53蛋白對(duì)LPS處理后的HT22細(xì)胞發(fā)揮了抗氧化作用，降低了細(xì)胞內(nèi)ROS水平。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示重組人MG53蛋白同樣可逆轉(zhuǎn)LPS刺激hUC-MSCs產(chǎn)生的ROS水平升高。在正常情況下，氧自由基的產(chǎn)生和消除由SOD、CAT和MDA等抗氧化物來(lái)維持平衡[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示重組人MG53蛋白升高了受損細(xì)胞中SOD和CAT活性，降低了MDA含量，減輕了LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。

PI3K/Akt信號(hào)通路是非常重要的凋亡信號(hào)通路。報(bào)道[5]顯示MG53通過(guò)與PI3K的p85亞基相結(jié)合來(lái)調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路，進(jìn)而對(duì)缺血再灌注的損傷心肌發(fā)揮保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)損傷的hUC-MSCs中p-Akt水平下降，其下游的信號(hào)分子p-GSK-3β水平也降低；重組人MG53蛋白干預(yù)治療后，GSK-3β與Akt磷酸化水平在一定程度上得到恢復(fù)。

綜上所述，重組人MG53蛋白可能通過(guò)激活A(yù)kt/GSK-3β信號(hào)通路，保護(hù)hUC-MSCs免受LPS刺激導(dǎo)致的氧化損傷。重組人MG53蛋白處理可能是一種促進(jìn)植入臍帶干細(xì)胞進(jìn)行組織修復(fù)的有效方法。