煙草煙霧凝集物對(duì)BEAS-2B細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

楊 薩，周洋洋，張佳彤，李中秋，于 琪，栗振凱，殷曉涵，張 巧

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)教研室 鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)醫(yī)院疾病預(yù)防控制科 鄭州 450001

吸煙是一種影響居民健康的不良生活方式，中國(guó)目前擁有世界上最多的吸煙者[1]。煙草的使用是許多疾病病因中最主要的危險(xiǎn)因素之一[2]。煙草燃燒可以產(chǎn)生超過(guò)6 000種的有毒有害物質(zhì)，如自由基、焦油、尼古丁、多環(huán)芳烴等[3]。這些有毒有害物質(zhì)大部分被機(jī)體吸入到肺部后停留在肺部，也有一小部分通過(guò)人體血液循環(huán)到達(dá)全身，因此香煙煙霧可以對(duì)機(jī)體呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等多個(gè)系統(tǒng)造成損害，其中危害多集中在呼吸系統(tǒng)[4-7]。外界刺激物可使機(jī)體產(chǎn)生過(guò)多的活性氧(reactive oxygen species, ROS)，機(jī)體在正常生理?xiàng)l件下的氧化和抗氧化動(dòng)態(tài)平衡被打破，從而發(fā)生氧化應(yīng)激，進(jìn)一步導(dǎo)致機(jī)體的病變[8]。研究[9]發(fā)現(xiàn)，超氧陰離子等強(qiáng)氧化劑大量存在于煙草煙霧中，可以在機(jī)體內(nèi)經(jīng)過(guò)一系列的生化反應(yīng)產(chǎn)生ROS，而ROS因其化學(xué)屬性消耗抗氧化物從而對(duì)細(xì)胞和機(jī)體造成損傷。吸入煙草過(guò)程中產(chǎn)生的煙草煙霧在到達(dá)肺泡上皮細(xì)胞之前最先接觸支氣管上皮細(xì)胞，所以支氣管上皮細(xì)胞會(huì)率先受到損害。基于此，本研究采用急性染毒24 h的方法來(lái)探究煙草煙霧凝集物(cigarette smoke condensate, CSC)是否能夠通過(guò)氧化應(yīng)激的方式對(duì)人正常支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B造成損傷，為進(jìn)一步研究CSC的毒性作用機(jī)制以及預(yù)防和治療煙草煙霧引發(fā)的機(jī)體相關(guān)呼吸系統(tǒng)疾病提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞及試劑BEAS-2B細(xì)胞由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院吳衛(wèi)東教授惠贈(zèng)。CCK-8(日本同仁化學(xué)研究所)，胎牛血清(美國(guó)Gemini公司)，二甲基亞砜(DMSO，美國(guó)Sigma公司)，RPMI 1640培養(yǎng)基(北京索萊寶科技有限公司)，ROS檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒(蘇州科銘生物科技有限公司)。

1.2CSC染毒液的制備CSC是由焦油含量為10 mg的某卷煙(鄭州煙草研究院)制成。分別用 Borgwaldt KCRM20H 轉(zhuǎn)盤(pán)吸煙機(jī)和92 mm 劍橋?yàn)V片抽吸和收集煙氣[3]，以DMSO(美國(guó)Sigma公司)為溶劑來(lái)萃取，得到 10 g/L的CSC母液，使用時(shí)用培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋。

1.3細(xì)胞存活率的測(cè)定采用CCK-8法。PBS洗細(xì)胞2次，每瓶加0.5 mL的胰蛋白酶進(jìn)行消化，96孔板每孔接種100 μL細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，細(xì)胞貼壁后加10 μL染毒液/孔，使CSC最終濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14和0.16 g/L，設(shè)陰性對(duì)照孔和空白孔。染毒24 h后加入10 μL CCK-8/孔，37 ℃孵育4 h，酶標(biāo)儀測(cè)450 nm處吸光度(A)值。細(xì)胞存活率=[(A染毒孔-A空白孔)/(A陰性對(duì)照孔-A空白孔)]×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)、染毒處理和形態(tài)學(xué)觀察將細(xì)胞放在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中，用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。全程必須保證無(wú)菌操作。空白對(duì)照組：用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。DMSO溶劑對(duì)照組：完全培養(yǎng)基中加入0.08 g/L DMSO。CSC染毒組：細(xì)胞用完全培養(yǎng)基配制的0.02、0.04、0.06和0.08 g/L的CSC染毒液處理。培養(yǎng)24 h后用倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)。

1.5細(xì)胞遷移距離的檢測(cè)采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。在6孔板底面均勻劃5條橫線。將細(xì)胞以1×106個(gè)/孔接種到6孔板上，細(xì)胞鋪滿(mǎn)瓶底時(shí)用200 μL槍頭垂直于背面橫線劃痕，PBS洗細(xì)胞2次后加無(wú)血清培養(yǎng)基，0、12、24和48 h后以6孔板背面所劃的橫線與劃痕垂直的位置為觀測(cè)點(diǎn)進(jìn)行觀察拍照，每組選取10張圖片，用Image-Pro Plus 6.0軟件分析遷移距離。某時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞的遷移距離為該時(shí)間點(diǎn)與0 h劃痕間距差值的絕對(duì)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6細(xì)胞ROS水平測(cè)定細(xì)胞按1.4分組、染毒24 h后，1 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞沉淀。用DCFH-DA(無(wú)血清培養(yǎng)基1∶1 000稀釋)重懸細(xì)胞，每5 min混勻1次，共染色20 min。用激光共聚焦顯微鏡和熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度(激發(fā)光波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)525 nm)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7細(xì)胞MDA含量測(cè)定細(xì)胞按1.4分組、染毒24 h后，用含PMSF的RIPA裂解液冰上裂解20 min，4 ℃、12 000×g離心15 min，收集上清液，BCA法定量。每組取30 μg蛋白，補(bǔ)足體積至100 μL，加0.3 mL試劑一后顛倒混勻。95 ℃水浴30 min后冰上冷卻，1 000×g離心10 min后取上清200 μL，于96孔板中測(cè)定A532 nm和A600 nm,計(jì)算ΔA，根據(jù)說(shuō)明書(shū)計(jì)算MDA含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8細(xì)胞SOD活性測(cè)定細(xì)胞按1.4分組、染毒24 h后，冰上裂解20 min，4 ℃離心15 min，取上清，BCA法測(cè)蛋白濃度。按SOD活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。不同組間細(xì)胞內(nèi)ROS水平、SOD活性和MDA含量的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；不同組間不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞遷移距離的比較采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1CSC暴露對(duì)BEAS-2B細(xì)胞形態(tài)和功能的影響

2.1.1 染毒濃度的確定 CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，CSC以劑量依賴(lài)性的方式降低BEAS-2B細(xì)胞的活力；當(dāng)CSC濃度為0.08 g/L時(shí)，BEAS-2B細(xì)胞存活率為56.9%，因此選擇0.02、0.04、0.06和0.08 g/L為CSC染毒的終濃度以確保在接下來(lái)的研究中細(xì)胞活力不會(huì)低于50%。

倒置顯微鏡下可見(jiàn)DMSO溶劑對(duì)照組細(xì)胞及細(xì)胞核的形態(tài)與空白對(duì)照組相比無(wú)明顯差異；與DMSO溶劑對(duì)照組相比，0.02 g/L CSC染毒組少數(shù)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空泡，0.04 g/L CSC染毒組細(xì)胞發(fā)生腫脹，一些細(xì)胞的細(xì)胞核變形增大甚至出現(xiàn)畸形，0.06 g/L CSC染毒組細(xì)胞的細(xì)胞膜間出現(xiàn)針刺樣突起改變，0.08 g/L CSC染毒組細(xì)胞體積明顯增大，結(jié)構(gòu)發(fā)生崩解，細(xì)胞膜和細(xì)胞核輪廓模糊，部分細(xì)胞核碎裂。見(jiàn)圖2。

圖1 CSC暴露后BEAS-2B細(xì)胞存活率的變化

A:空白對(duì)照組；B：DMSO溶劑對(duì)照組；C～F:分別為0.02、0.04、0.06和0.08 g/L CSC染毒組

2.1.2 細(xì)胞遷移能力檢測(cè) 結(jié)果見(jiàn)表1。與空白對(duì)照組、DMSO溶劑對(duì)照組細(xì)胞相比，各濃度CSC染毒組細(xì)胞的遷移距離均增加。

2.2各組BEAS-2B細(xì)胞ROS水平、MDA含量和SOD活性的比較各組細(xì)胞熒光強(qiáng)度激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果見(jiàn)圖3，細(xì)胞內(nèi)ROS熒光信號(hào)強(qiáng)度隨著CSC染毒濃度的增加而增強(qiáng)。各組細(xì)胞ROS水平、MDA含量和SOD活性的比較見(jiàn)表2。

表1 各組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)遷移距離的比較(n=3) mm

FCSC=105.340，P<0.001；F時(shí)間=793.520，P<0.001；F交互=24.555，P<0.001；*：與空白對(duì)照組、DMSO溶劑對(duì)照組相比，P<0.05

A:DMSO溶劑對(duì)照組；B：空白對(duì)照組；C～F:分別為0.02、0.04、0.06和0.08 g/L CSC染毒組

表2 各組細(xì)胞ROS水平、MDA含量和SOD活性的比較(n=3)

*：與空白對(duì)照組、DMSO溶劑對(duì)照組相比，P<0.05；#：與0.02、0.04 g/L CSC染毒組相比，P<0.05

3 討論

煙草煙霧是一種成分非常復(fù)雜的混合物，其中含有大量對(duì)機(jī)體有害的物質(zhì)，可以導(dǎo)致多種與呼吸相關(guān)的疾病，如慢性阻塞性肺疾病和哮喘等[10-12]。有研究[13]表明煙草煙霧引起的氧化應(yīng)激是主要的發(fā)病機(jī)制。研究[14]表明，煙草煙霧可使人肺成纖維細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激并造成遺傳學(xué)損傷。支氣管上皮細(xì)胞是外界環(huán)境與氣道接觸的首道防線，不但可以作為合成、釋放許多細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)的效應(yīng)細(xì)胞參與免疫反應(yīng)和氣道炎癥，還是各種炎性介質(zhì)等作用的靶細(xì)胞。因此，本研究使用CSC對(duì)BEAS-2B細(xì)胞進(jìn)行染毒來(lái)觀察CSC對(duì)BEAS-2B細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響。采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力，發(fā)現(xiàn)CSC可降低細(xì)胞存活率，并存在劑量-效應(yīng)關(guān)系，為保證細(xì)胞存活率達(dá)到50%以上，故選用0.02、0.04、0.06和0.08 g/L作為CSC染毒濃度干預(yù)細(xì)胞24 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

研究結(jié)果顯示，0.02 g/L CSC染毒組BEAS-2B細(xì)胞內(nèi)有空泡出現(xiàn)，隨著CSC染毒濃度的增加，BEAS-2B細(xì)胞發(fā)生腫脹，輪廓也逐漸由清晰變得模糊，部分細(xì)胞核變形、增大甚至出現(xiàn)畸形，細(xì)胞膜的邊緣出現(xiàn)許多針刺樣突起，0.08 g/L CSC染毒組BEAS-2B細(xì)胞出現(xiàn)了核碎裂。同時(shí)，CSC改變了BEAS-2B細(xì)胞的遷移能力，染毒組細(xì)胞遷移距離高于空白對(duì)照組、DMSO溶劑對(duì)照組。這些結(jié)果表明CSC對(duì)BEAS-2B細(xì)胞具有細(xì)胞毒性作用。

MDA是一種脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，當(dāng)機(jī)體對(duì)過(guò)量產(chǎn)生的ROS不能及時(shí)清除時(shí)，其會(huì)使生物膜上發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，產(chǎn)生的MDA會(huì)使機(jī)體細(xì)胞膜流動(dòng)性和通透性發(fā)生改變，這將會(huì)造成機(jī)體細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的變異。因而，MDA的含量一方面可直接反映細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的強(qiáng)度和速率，另一方面也能夠間接地反映細(xì)胞過(guò)氧化損傷的程度。研究[15]發(fā)現(xiàn)，煙草煙霧是一種有效的氧化劑，一次抽吸動(dòng)作可產(chǎn)生1×1017個(gè)氧化物分子。此外，研究[16]發(fā)現(xiàn)香煙煙霧暴露可通過(guò)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)卵泡破壞和卵母細(xì)胞功能障礙。在本研究中，BEAS-2B細(xì)胞內(nèi)ROS水平隨著CSC染毒濃度的升高逐漸增高。DMSO溶劑對(duì)照組ROS水平和MDA含量與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；CSC染毒后，BEAS-2B細(xì)胞內(nèi)ROS水平和MDA含量增高，并隨CSC濃度增加而增高。

SOD是機(jī)體內(nèi)清除自由基的主要抗氧化酶。ROS生成增多可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶類(lèi)的產(chǎn)生，對(duì)過(guò)量產(chǎn)生的ROS進(jìn)行消除，來(lái)抵抗氧化損傷對(duì)細(xì)胞的危害，從而保護(hù)細(xì)胞。因此，SOD活性可代表細(xì)胞的抗氧化損傷能力，SOD活性降低，細(xì)胞的氧化損傷就會(huì)加重。本研究中BEAS-2B細(xì)胞內(nèi)SOD活性隨著CSC染毒濃度的增加而逐漸降低。以上結(jié)果說(shuō)明CSC染毒后BEAS-2B細(xì)胞內(nèi)的氧化平衡狀態(tài)被打破，細(xì)胞受到損傷，與以往報(bào)道[17]結(jié)果一致。

綜上所述，CSC對(duì)BEAS-2B細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，能夠以劑量依賴(lài)性的方式抑制細(xì)胞的活力并改變細(xì)胞形態(tài)。同時(shí)，CSC能夠提高BEAS-2B細(xì)胞內(nèi)ROS水平，加劇過(guò)氧化反應(yīng)，生成大量的MDA，降低細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶SOD的活性，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生，對(duì)細(xì)胞造成損傷。