TCDD對小鼠腭突間充質(zhì)細胞增殖和凋亡的影響

劉蔓蔓，陶宇昌，劉小轉(zhuǎn)，高 湛，張秀麗，譚雪梅，余凱倫，陳 瑤，余增麗

1)鄭州大學公共衛(wèi)生學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學教研室 鄭州 450001 2)河南省人民醫(yī)院臨床單細胞生物醫(yī)學中心 鄭州 450003 3)鄭州大學第五附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 鄭州 450052 4)鄭州大學第一附屬醫(yī)院營養(yǎng)科 鄭州 450052

腭裂是人類最常見的顱頜面部出生缺陷之一，遺傳和環(huán)境因素是其主要的致畸因素[1]。近年來研究[2]表明，腭裂的發(fā)生可能與母親懷孕期間胚胎所處的發(fā)育環(huán)境有關(guān)。2，3，7，8-四氯二苯并對二噁英(2， 3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD)是多氯聯(lián)苯及其類似物中毒性最大的污染物之一[3]，它可以通過食物鏈的富集輕易積聚在人體內(nèi)。研究[4-5]表明TCDD是腭裂的強致畸劑，暴露于TCDD的胎鼠已經(jīng)顯示出腭裂和腎積水，但唇部并無明顯變化。

腭的發(fā)育過程可簡單概括為3個重要階段：形成與垂直生長期、上抬期和接觸融合期。任何直接干擾腭突生長、升高或融合的遺傳或環(huán)境因素，以及破壞周圍顱面結(jié)構(gòu)(例如下頜骨和舌頭)生長或形態(tài)發(fā)生的因素都可以引起腭裂[6]。研究[7]發(fā)現(xiàn)TCDD誘導的腭裂是由于腭突發(fā)育不良造成的，腭突尺寸太小而不能相互接觸被認為是引起腭裂最常見的原因。腭突間充質(zhì)(embryonic palatal mesenchymal，EPM)細胞是構(gòu)成腭部的主體細胞，其正常增殖對于腭器官的發(fā)育至關(guān)重要。本項研究觀察了TCDD暴露對胎鼠腭突生長，以及對體外EPM細胞生長的影響，探索TCDD誘發(fā)腭裂的機制，為預防腭裂的發(fā)生提供思路。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器低速、高速臺式離心機(德國Eppendorf公司)，水平搖床(沃德生物醫(yī)學儀器公司)，JY-SCZ2 型 SDS-PAGE 蛋白電泳儀(北京六一儀器廠)，多功能酶標儀(上海美谷分子儀器有限公司)。5-溴脫氧尿嘧啶核苷(Brdu)、TCDD和二甲基亞砜(美國Sigma公司)，非轉(zhuǎn)基因玉米油(山東三星產(chǎn)業(yè)科技有限公司)，DMEM/F12細胞培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)，胎牛血清(杭州四季青有限公司)，中性蛋白酶(瑞士羅氏公司)。Trizol(美國Life Technologies公司)，UltraSYBR Mixture(北京康為有限公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物工程有限公司)，ABI Fast 7500實時熒光定量PCR儀(美國應用生物系統(tǒng)公司)。ECL 高效化學發(fā)光試劑盒(美國Genview公司)，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG和小鼠抗β-肌動蛋白單克隆抗體(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司)，小鼠抗Bax、Caspase3單克隆抗體和兔抗鼠PCNA抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)。

1.2孕鼠的制備SPF級C57BL/6N小鼠，6～8周齡，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[許可證號：SCXK(京)2016-0006]，置于檢疫室觀察1周無異常后，移入屏障環(huán)境飼養(yǎng)2周。于20：00按雌雄3∶1比例合籠，次日晨8：00檢查雌鼠，查到陰栓者即為妊娠第0天(GD0)。

1.3胎鼠頭部形態(tài)學觀察于GD10，將30只孕鼠隨機分為TCDD組和對照組，每組15只, TCDD組孕鼠于GD10 8：00以64 μg/kg灌胃TCDD，對照組給予等量玉米油。兩組孕鼠分別于GD13、GD14和GD15 10：00用頸椎脫臼法處死5只，剖腹取出胎鼠頭部，多聚甲醛固定48 h后，經(jīng)梯度乙醇脫水，常規(guī)方法加工成石蠟包埋的5 μm冠狀位連續(xù)切片，行HE染色，于光學顯微鏡下觀察。

1.4TCDD對小鼠EPM細胞增殖的影響

1.4.1 小鼠EPM細胞分組 選取GD13未灌胃孕鼠，頸椎脫臼法處死，置體積分數(shù)75%乙醇的無菌缸中浸泡5 min，剖腹取出孕鼠子宮，PBS清洗以除去血污。將胎鼠小心從子宮中剝離，切取胎頭用PBS清洗。從胎鼠口裂處沿口腔水平方向切開，去除舌體和下顎，使雙側(cè)腭板充分暴露。彎頭鑷沿腭板底部輕輕夾取兩側(cè)腭突，迅速放入PBS。將離體腭突放入中性胰蛋白酶消化液的無菌管中37 ℃恒溫水浴15 min，待上皮片和間充質(zhì)分離后，吸去上皮碎片，加入2.5 g/L胰蛋白酶消化液反復吹打直至呈單細胞懸液。加入含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM/F-12 培養(yǎng)基終止消化，PBS洗滌2次，加入含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細胞，并轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶和6孔板，置于細胞培養(yǎng)箱(體積分數(shù)5%CO2、37 ℃飽和濕度)中連續(xù)培養(yǎng)。取第3代EPM細胞，調(diào)整細胞密度為5×103個/mL，按100 μL/孔接種到96孔板，分別加入0.0(對照)、0.1、1.0、10.0 nmol/L TCDD進行染毒，每個劑量設置6個平行孔，72 h后進行指標檢測。以下實驗均重復3次。

1.4.2 細胞增殖抑制率的檢測 以20 μL/孔加入5 μg/L的MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸去培養(yǎng)液，以150 μL/孔加入DMSO溶液，置于恒溫箱中振蕩30 min，用酶標儀在490 nm波長下檢測吸光度(A)值，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=1-(實驗組A-調(diào)零孔A)/(對照A-調(diào)零孔A)×100%。

1.4.3 Brdu陽性率的檢測 在培養(yǎng)結(jié)束前，將細胞與Brdu(10 μmol/L)在黑暗中孵育6 h。培養(yǎng)結(jié)束后，用預冷的40 g/L多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌細胞爬片，用含Triton-100的PBS透化細胞，加體積分數(shù)0.3%H2O2室溫孵育10 min，正常羊血清孵育20 min，加BrdU抗體(1∶20稀釋)，37 ℃孵育2 h，加生物素化二抗，37 ℃孵育30 min，滴加DAPI染液避光室溫封閉10 min，封片，于熒光顯微鏡下觀察。細胞核紅色為陽性細胞。隨機選取10個非重疊視野(200×)計數(shù),計算 BrdU陽性細胞占總細胞數(shù)的比例。

1.4.4 細胞中PCNA、Bax和Caspase-3 mRNA及蛋白的檢測 ①分別收集4組細胞，Trizol法提取總RNA，測定濃度后反轉(zhuǎn)錄得cDNA，于熒光定量PCR儀中進行PCR。PCNA上游引物序列：5’-TTTGAG GCACGCCTGATCC-3’，下游：5’-GGAGACGTGAGACGAGTCCAT-3’；Bax上游引物序列：5’-CAGGAT GCGTCCACCAAGAA-3’，下游：5’-GTTGAAGTTGC CATCAGCAAACA-3’；Caspase-3上游引物序列：5’- CTGCCGGAGTCTGACTGGAA-3’，下游: 5’-ATCAGTCCCACTGTCTGTCTCAATG-3’；內(nèi)參β-actin上游引物序列：5’-GTTGAAGTTGCCATCAGCAAACA-3’；下游：5’-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3’。采用2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA相對表達量。②常規(guī)法提取細胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。蛋白100 ℃變性后，取40 μg進行SDS-PAGE電泳，200 V轉(zhuǎn)膜1.5 h后，用50 g/L脫脂牛奶37 ℃封閉40 min。TBST洗滌3次，加入稀釋的一抗(稀釋度1∶2 500)于4 ℃孵育過夜。TBST洗滌3次，加入二抗，37 ℃孵育2 h。TBST洗滌3次，ECL發(fā)光。采用Image J軟件分析圖像，計算目的蛋白與 β-actin條帶灰度值的比值，表示目的蛋白表達水平。

1.5統(tǒng)計學處理采用SPSS 17.0進行分析，各組細胞增殖抑制率，Brdu陽性率，PCNA、Bax、Caspase-3 mRNA和蛋白表達的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1胎鼠頭部組織學表現(xiàn)見圖1。GD13，對照組和TCDD組的腭突沿著舌體兩側(cè)垂直生長。GD14，對照組舌體位置開始下降，雙側(cè)腭突抬升到舌體上方，并向中線水平生長；TCDD組雙側(cè)腭突雖能抬升到舌體上方，但沒有相互接觸，發(fā)育遲緩，留下相對較大的縫隙。GD15，與對照組形成完整的次級腭相比，TCDD組腭突仍然不能融合，證實腭裂表型的發(fā)生。

A、C、E：分別為對照組GD13、GD14、GD15；B、D、F：分別為TCDD組GD13、GD14、GD15；PS：腭板；T：舌體；N：鼻

圖1兩組胎鼠的腭發(fā)育(HE, ×40)

2.24組小鼠EPM細胞增殖狀況的比較見圖2、表1。隨著TCDD作用濃度的增加，小鼠EPM細胞增殖抑制率逐漸升高，Brdu陽性率逐漸降低。

A、B、C、D：分別為0.0、0.1、1.0、10.0 nmol/L TCDD組

表1 4組小鼠EPM細胞增殖抑制率和Brdu陽性率的比較 %

*：與0.0 nmol/L組比較，P<0.05; #： 與0.1 nmol/L組比較，P<0.05

2.34組小鼠EPM細胞中PCNA、Bax和Caspase-3mRNA和蛋白表達的比較見圖3和表2、3。隨著TCDD作用濃度的增加，小鼠MEPM細胞中PCNA mRNA和蛋白表達降低，Bax、Caspase-3 mRNA和蛋白表達增加(P<0.05)。

1、2、3、4：分別為0.0、0.1、1.0、10.0 nmol/L TCDD組

c(TCDD)/(nmol/L)nPCNABaxCaspase-30.031.02±0.03 1.02±0.021.01±0.020.130.85±0.091.41±0.13?1.19±0.121.030.64±0.031.81±0.08?#1.30±0.1610.030.49±0.08?2.43±0.12?#△1.92±0.27?#△F33.570114.36916.689P<0.001<0.001<0.001

*：與0.0 nmol/L組比較，P<0.05；#：與0.1 nmol/L組比較，P<0.05；△：與1.0 nmol/L組比較，P<0.05

表3 4組小鼠EPM細胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白的表達

*：與0.0 nmol/L組比較，P<0.05；#：與0.1 nmol/L組比較，P<0.05；△：與1.0 nmol/L組比較，P<0.05

3 討論

哺乳動物腭的發(fā)育是由一系列復雜過程構(gòu)成的，其中間充質(zhì)細胞的生長是一個至關(guān)重要的過程。在腭發(fā)育過程中，間充質(zhì)細胞的正常增殖受到任何外源性致畸因子的影響，都將引起腭的異常發(fā)育，最終導致腭裂的發(fā)生[8]。TCDD是一種潛在的環(huán)境毒物和致癌物質(zhì)，TCDD暴露可能導致各種癌癥、發(fā)育缺陷、免疫異常、造血功能障礙、神經(jīng)細胞損傷、生殖和內(nèi)分泌失調(diào)等[9-10]。 TCDD可通過調(diào)節(jié)細胞增殖、分化和細胞外軟骨形成來干擾胚胎發(fā)育[11]。已經(jīng)證實[12-13]TCDD能有效誘導小鼠腭裂的發(fā)生。一些研究[7,14]表明，TCDD不會改變中嵴上皮細胞分化，但會在初次接觸前抑制腭突的發(fā)育和延遲腭突的抬升。還有研究[15]發(fā)現(xiàn)，EPM細胞的生長異常與腭發(fā)育早期腭裂的形成相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)， TCDD組GD14～GD15胎鼠雙側(cè)腭突未能相互接觸和融合。MTT比色法常用于檢測細胞存活和生長，而Brdu是反映細胞增殖及跟蹤監(jiān)測增殖細胞的理想指標，對細胞動力學的研究具有重要意義。本研究結(jié)合兩種方法來檢測小鼠EPM細胞增殖情況，結(jié)果顯示TCDD能有效抑制小鼠EPM細胞增殖，顯著降低細胞增殖活力。這與TCDD單獨暴露后抑制人乳腺癌MCF-7和卵巢癌細胞增殖的結(jié)果一致[10,16]。

增殖和凋亡過程會涉及一系列基因的激活、表達和調(diào)控。在人類滋養(yǎng)層樣JAR細胞中，TCDD介導的細胞凋亡可能歸因于線粒體功能障礙[17]。PCNA與細胞DNA合成密切相關(guān)，是異常細胞增殖的關(guān)鍵蛋白[18]。最近的證據(jù)[19]表明，PCNA是許多重要細胞過程的核心，例如DNA復制、DNA的損傷修復、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)維持、染色體分離和細胞周期進展等。Bcl-2家族蛋白構(gòu)成了不可逆細胞損傷上游的關(guān)鍵檢查點，被認為是細胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[20]。作為Bcl-2家族的成員，Bax過表達可抑制Bcl-2的功能并促進細胞凋亡[20]。在線粒體途徑中，促凋亡蛋白被激活后，作為凋亡主要執(zhí)行環(huán)節(jié)的Caspase蛋白酶發(fā)生級聯(lián)反應，Caspase-3位于凋亡級聯(lián)反應的下游，其激活標志著凋亡進入不可逆階段[21]。對人宮頸癌HeLa細胞的實驗[22]表明，細胞凋亡伴隨著Bax的上調(diào)，線粒體細胞色素的釋放，Caspase-9和Caspase-3的激活。本實驗結(jié)果顯示，TCDD可以降低小鼠EPM細胞中PCNA的表達，提高Bax、Caspase-3的表達；提示TCDD誘導的EPM細胞增殖-凋亡失衡可能與線粒體凋亡途徑的激活有關(guān)。

綜上所述，本研究表明TCDD可能是通過抑制EPM細胞的增殖，促進其凋亡誘發(fā)腭裂。