p97抑制劑NMS-873對Eca109細胞增殖、凋亡及遷移能力的影響

張璐玉，崔艷艷，王文杰，張彥婷，劉艷霞，馬珊珊，劉紅濤，張 樂，劉騰飛，周建康，王亞蘋，關方霞

鄭州大學生命科學學院 鄭州 450001

食管鱗狀細胞癌(食管鱗癌)是我國常見的消化系統(tǒng)腫瘤，患者生存期短，預后差[1]。研究[2]表明，與正常細胞相比，癌細胞更依賴于蛋白質質量控制系統(tǒng)，以維持蛋白質穩(wěn)態(tài)平衡；打破癌細胞內蛋白質穩(wěn)態(tài)平衡已成為腫瘤治療的新方向。p97蛋白，又稱含纈酪肽蛋白，作為AAA+ATP酶家族的一員在細胞中廣泛存在，參與了多種重要的細胞生物學過程，包括蛋白質穩(wěn)態(tài)調控、自噬、染色質重塑、轉錄活性調節(jié)、免疫信號傳導等[3-5]。p97蛋白作為泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system，UPS)的重要組分，在蛋白質穩(wěn)態(tài)調控中發(fā)揮關鍵作用[4]。研究[6-8]表明，p97在多種腫瘤細胞中高表達，抑制p97活性能夠在體內外水平抑制非小細胞肺癌、結直腸癌、漿細胞癌等多種腫瘤細胞的增殖。然而，目前尚未見到p97與食管鱗癌的相關研究。因此，本研究觀察了p97抑制劑NMS-873[9]對食管鱗癌Eca109細胞增殖、凋亡及遷移的影響，旨在從細胞水平探討p97與食管鱗癌細胞生物學行為的關系。

1 材料與方法

1.1主要材料Eca109細胞株為實驗室前期凍存，NMS-873購自美國Selleck公司，CCK-8檢測試劑盒購自日本同仁公司，EdU細胞增殖檢測試劑盒購自中國廣州銳博生物公司，DMSO購自美國Sigma公司，AnnexinV-FITC/PI 雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物公司，DMEM培養(yǎng)基購自HyClone公司,磷酸鹽緩沖液、胎牛血清(FBS)購自以色列BI公司，胰蛋白酶消化液購自碧云天公司，Transwell小室購自美國Corning公司。NMS-873用DMSO配制成5 mmol/L的母液備用。

1.2細胞培養(yǎng)Eca109細胞用含體積分數(shù)10%FBS的DMEM/高糖培養(yǎng)基于體積分數(shù)5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d傳代一次。取對數(shù)生長期的細胞用于后續(xù)實驗。

1.3CCK-8法檢測細胞增殖按每孔4 000個細胞將Eca109細胞接種到96孔板，貼壁12 h后實驗組分別加入0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 μmol/L的NMS-873，以加DMSO為陰性對照，以不加細胞的完全培養(yǎng)基為空白對照，每組設3個平行孔。作用24、48、72 h后每孔加入10 μL CCK-8試劑，細胞培養(yǎng)箱孵育2 h，讀取450 nm波長處的吸光度(A)，計算細胞存活率。存活率=[(A實驗孔-A空白孔)/(A陰性對照孔-A空白孔)]×100%。根據(jù)結果篩選1、2、3 μmol/L的NMS-873用于后續(xù)實驗。

1.4Transwell小室法檢測細胞的遷移能力Eca109細胞經1、2、3 μmol/L NMS-873處理48 h后，消化離心，收集細胞，調整細胞密度為1×106個/mL，接種于裝有Transwell小室的24孔板，以DMSO處理細胞為陰性對照，每組設3個平行孔;Transwell下室中加入600 μL含體積分數(shù)5%FBS的培養(yǎng)基；置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h;棄去小室中剩余培養(yǎng)基，甲醇室溫固定30 min, PBS清洗小室中殘留的甲醇溶液，加入10 g/L結晶紫染液室溫染色10 min，PBS 清洗3遍，將多余的染料洗掉，用脫脂棉球輕輕擦拭小室上層未遷移的細胞，倒置顯微鏡下選取5個視野觀察并拍照分析，計數(shù)穿膜細胞。

1.5AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡Eca109細胞經1、2、3 μmol/L NMS-873處理48 h后，吸棄培養(yǎng)液，加入不含EDTA的胰蛋白酶消化、離心，用PBS清洗2遍，按細胞凋亡檢測試劑盒說明加入試劑，進行AnnexinV-FITC/PI染色，1 h內上流式細胞儀檢測。以加DMSO的細胞為陰性對照，實驗重復3次。

1.6EdU法檢測細胞增殖Eca109消化離心后按每孔2×104個細胞接種于24孔板，每組設3個平行孔，以加DMSO的細胞為陰性對照，分別用1、2、3 μmol/L NMS-873處理48 h后，吸棄培養(yǎng)基，按照EdU細胞增殖檢測試劑盒說明書加入EdU試劑，培養(yǎng)箱避光孵育2 h，含40 g/L多聚甲醛的PBS室溫孵育30 min，2 g/L甘氨酸搖床孵育5 min,每孔加入100 μL的1×Apollo染色反應液,室溫、避光、脫色，搖床孵育30 min；加入100 μL 1×Hoechst 33342反應液，避光、室溫、搖床孵育30 min；棄去培養(yǎng)液，加入PBS，室溫搖床清洗3次；于倒置熒光顯微鏡下選取5個視野拍照觀察，并用Image J軟件進行分析。

1.7統(tǒng)計學處理應用SPSS 21.0處理數(shù)據(jù)。應用3×5析因設計的方差分析分析不同濃度NMS-873作用不同時間對Eca109細胞存活率的影響，應用單因素方差分析比較各組細胞凋亡率、增殖率和穿膜細胞數(shù)的差異，兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1不同濃度NMS-873作用不同時間對Eca109細胞存活率的影響結果見表1。由表1可知，隨著NMS-873濃度和作用時間的增加，Eca109細胞存活率逐漸降低；作用時間為48 h時，IC50為2.32 μmol/L，因此選擇1、2、3 μmol/L NMS-873作用48 h為后續(xù)實驗的條件。

表1 NMS-873對Eca109細胞存活率的影響(n=3) %

F時間=73.999,F濃度=458.166,F交互=5.915,P均<0.001

2.2NMS-873對Eca109細胞凋亡、增殖及遷移能力的影響結果見表2。由表2可知，隨著NMS-873濃度的增加，Eca109細胞的凋亡率增加，增殖率降低，穿膜細胞數(shù)減少。

表2 NMS-873對Eca109細胞凋亡、增殖及遷移能力的影響

兩兩比較，P均<0.05

3 討論

UPS作為胞內最重要的蛋白質降解系統(tǒng)，是調節(jié)蛋白質穩(wěn)態(tài)的重要途徑[10]。在腫瘤細胞中，UPS常常處于過度活躍的狀態(tài)，以滿足癌細胞對錯誤折疊蛋白的降解需求，從而緩解胞內蛋白質毒性壓力。一旦UPS途徑受阻，就會引起錯誤折疊蛋白在胞內的大量積累，進而導致癌細胞死亡[2]。因此，使用藥物靶向阻斷UPS中的關鍵組分，打破癌細胞內蛋白質穩(wěn)態(tài)平衡，已成為腫瘤治療的新方向[2]。

p97是ATP超家族中的一員，主要由N端、C端和兩個保守的ATP結構域組成[11-13]。當細胞內錯誤折疊的蛋白質在內質網內堆積時，p97參與的UPS能夠通過輔助降解胞內大量錯誤折疊蛋白，參與胞內蛋白質質量控制，保證細胞在蛋白質毒性壓力下的存活[4,14]。目前已有研究[9,15]表明，p97蛋白在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起到了不可或缺的作用，抑制p97蛋白的活性，可以打破內質網內蛋白質穩(wěn)態(tài)平衡，從而促進腫瘤細胞的凋亡。

NMS-873是目前為止最有效的特異性p97變構抑制劑[9]。NMS-873通過破壞p97蛋白ATP結構域的穩(wěn)定性，靶向抑制p97蛋白的活性，從而影響內質網內錯誤折疊蛋白的降解，產生細胞內蛋白質毒性壓力，促進細胞死亡[7,9]。本實驗結果表明NMS-873作用于Eca109細胞后，能明顯抑制細胞增殖，且具有時間和劑量依賴性。此外，隨著作用濃度的增加，Eca109細胞凋亡率升高， 而細胞遷移能力受抑。

綜上所述，NMS-873能有效抑制Eca109細胞增殖，促進細胞凋亡，并降低細胞遷移能力；p97有望成為食管鱗癌治療的有效靶點。