基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的食管鱗癌細(xì)胞代謝組學(xué)分析

崔艷艷，張彥婷，張璐玉，王文杰，馬珊珊，劉紅濤，楊大偉，關(guān)方霞

1)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 鄭州 450001 2)聊城市人民醫(yī)院中原生物醫(yī)學(xué)研究院 山東聊城 252002

食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)是我國(guó)乃至世界范圍內(nèi)較為常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其惡性程度高、易轉(zhuǎn)移、預(yù)后差[1]。由于ESCC早期無(wú)明顯癥狀，并且缺乏有效的早期診斷方法，很多臨床上確診的ESCC患者已到中晚期，只能采取以手術(shù)為主、放化療為輔的綜合治療，往往預(yù)后差、生存期短[2]，因此尋找早期診斷的特異標(biāo)志物及有效治療靶點(diǎn)是提高ESCC治療效果的主要途徑。代謝組學(xué)是以小分子代謝物為研究對(duì)象，對(duì)組織、細(xì)胞及體液中所有代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性和定量分析[3]。腫瘤的產(chǎn)生是環(huán)境因素與遺傳因素共同作用的結(jié)果，這些因素將導(dǎo)致與腫瘤相關(guān)的基因及蛋白質(zhì)表達(dá)異常，同時(shí)也體現(xiàn)在代謝物水平的改變[4]。通過(guò)代謝組學(xué)揭示腫瘤細(xì)胞中整體代謝物的改變，發(fā)現(xiàn)和篩選基于代謝物的特征性生物標(biāo)志物，將有助于揭示腫瘤發(fā)生發(fā)展的代謝機(jī)制，為早期診斷和發(fā)病機(jī)制的研究提供新的思路和理論依據(jù)[5]。隨著代謝組學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，大量腫瘤代謝標(biāo)志物[6]已被鑒定，如卵巢癌[7]、前列腺癌[8]、結(jié)直腸癌[9]等疾病，越來(lái)越多的標(biāo)志性差異代謝產(chǎn)物被用于輔助臨床診斷與治療。本研究利用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用技術(shù)對(duì)人ESCC細(xì)胞及正常食管上皮細(xì)胞的代謝差異進(jìn)行探究，應(yīng)用多變量統(tǒng)計(jì)分析對(duì)代謝產(chǎn)物進(jìn)行模式識(shí)別，篩選重要的差異代謝物，并結(jié)合代謝通路分析，揭示ESCC整體性代謝的改變。

1 材料與方法

1.1儀器、試劑及細(xì)胞①主要儀器和試劑：GC-MS儀7890-5975(美國(guó)安捷倫公司)；真空濃縮儀(德國(guó)Labconco公司)；甲氧基胺鹽酸鹽、吡啶、N-甲基-N-(三甲基硅基)三氟乙酰胺(MSTFA)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。②細(xì)胞株及培養(yǎng)基：人ESCC細(xì)胞株EC1、Eca109、TE1和正常食管上皮細(xì)胞Het-1A由鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；DMEM高糖培養(yǎng)基、標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清、PBS購(gòu)自以色列Biological Industries公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞在75 cm2的培養(yǎng)瓶中用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和雙抗的培養(yǎng)基于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下培養(yǎng)，每種細(xì)胞培養(yǎng)4瓶，1瓶進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，3瓶用于實(shí)驗(yàn)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到85%時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3細(xì)胞樣品制備棄細(xì)胞培養(yǎng)基，用PBS洗滌3次后將培養(yǎng)瓶放在冰上并加入4 mL體積分?jǐn)?shù)為80%的冷甲醇，-80 ℃放置20 min后，于冰上用細(xì)胞推刮器刮下細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到2 mL離心管中。4 ℃、14 000 r/min離心5 min，取上清置于新的15 mL離心管中，細(xì)胞沉淀中加入500 μL冷甲醇，渦旋振蕩1 min后繼續(xù)在4 ℃、14 000 r/min條件下離心5 min，取上清和之前的上清混合在一起，均分成3管，每個(gè)細(xì)胞系均分裝9個(gè)平行管，然后用真空離心儀離心濃縮。

1.4樣品衍生在每個(gè)樣品中加入50 μL 20 g/L的甲氧基胺鹽酸鹽溶液(溶解于吡啶)，40 ℃振蕩90 min。待其冷卻到室溫后，每個(gè)樣品中加入50 μL MSTFA，40 ℃反應(yīng)60 min。12 000 r/min離心10 min后，取上清液，轉(zhuǎn)移到含有襯管的自動(dòng)進(jìn)樣瓶中。

1.5GC-MS分析進(jìn)樣口溫度：280 ℃；柱始溫：70 ℃，保持3 min，再以5 ℃/min升溫至300 ℃，保持5 min；載氣：高純氦，流速為1.2 mL/min；進(jìn)樣方式：5∶1進(jìn)樣；進(jìn)樣體積：1 μL。

電子轟擊離子源：70 eV；傳輸線溫度：280 ℃；溶劑延遲：4.8 min；離子源溫度：230 ℃；四級(jí)桿溫度：150 ℃；掃描范圍：33～600 m/z。

1.6數(shù)據(jù)處理將GC-MS數(shù)據(jù)從Agilent MSD ChemStation導(dǎo)出為netCDF格式，采用自動(dòng)質(zhì)譜解卷積與識(shí)別系統(tǒng)(AMDIS)在批處理模式下對(duì)netCDF文件進(jìn)行去卷積處理，AMDIS去卷積設(shè)置為：分辨率中等、靈敏度低、形狀要求中等，元件寬度設(shè)為10。經(jīng)過(guò)AMDIS處理后得到兩種格式的數(shù)據(jù)：*.ELU和*.FLN。將*.ELU文件上傳到SpectConnect(www.spectconnect.mit.edu，可以校正保留時(shí)間漂移和選擇出現(xiàn)75%以上的代謝物)，然后得到相對(duì)量、保留時(shí)間、積分峰和基峰4個(gè)數(shù)據(jù)集，用于統(tǒng)計(jì)分析。*.FLN文件用于搜索NIST質(zhì)譜庫(kù)(包括NIST 08、Wiley、Replib和Fiehn數(shù)據(jù)庫(kù))，定性代謝物。多元統(tǒng)計(jì)分析和單變量統(tǒng)計(jì)分析所用軟件為加拿大阿爾伯特大學(xué)開(kāi)發(fā)的集質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理、多元統(tǒng)計(jì)分析和代謝途徑分析為一體的MetaboAnalyst。

2 結(jié)果

2.1代謝譜分析EC1、Eca109、TE1和Het-1A細(xì)胞經(jīng)過(guò)GC-MS聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)分析后，獲得典型的總離子流色譜圖，見(jiàn)圖1。共鑒定出103種化合物，包括各種氨基酸、糖類、脂類、類固醇類及尿素、磷酸等小分子代謝物。

A:Het-1A;B:EC1;C:Eca109;D:TE1

2.2主成分分析對(duì)4種細(xì)胞的代謝物進(jìn)行主成分分析，得分圖見(jiàn)圖2。主成分1解釋了總差異的36.8%，主成分2解釋了總差異的19.0%；4株細(xì)胞在主成分分析得分圖中得到了很好的區(qū)分。

圖2 4種細(xì)胞代謝輪廓的主成分分析得分圖

2.3差異代謝途徑的篩選數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)預(yù)處理后得到代謝途徑差異圖，見(jiàn)圖3，顏色越深說(shuō)明代謝差異性越顯著，圓圈越大說(shuō)明檢測(cè)到該代謝途徑的代謝產(chǎn)物越多。根據(jù)圖3共篩選出9條ESCC細(xì)胞與正常食管上皮細(xì)胞的差異代謝途徑，包括類固醇激素的生物合成，初級(jí)膽汁酸的生物合成，脂肪酸代謝，半乳糖代謝，賴氨酸降解，丙酮酸代謝，氨基?；?tRNA生物合成，半胱氨酸和蛋氨酸代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝。共涉及氨基酸代謝、能量代謝及糖代謝，其中氨基酸代謝途徑中檢測(cè)到的差異性代謝物最多。

圖3 ESCC細(xì)胞與Het-1A細(xì)胞差異代謝途徑分析

2.4差異代謝物的篩選及其變化趨勢(shì)分析ESCC細(xì)胞與Het-1A細(xì)胞的差異代謝物基本可以分為下面幾類：氨基酸類物質(zhì)，賴氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、谷氨酸、色氨酸、蛋氨酸、酪氨酸和纈氨酸等在ESCC細(xì)胞中上調(diào)；糖代謝物質(zhì)，塔格糖在ESCC細(xì)胞中上調(diào)，葡萄糖下調(diào)；脂類物質(zhì)，單棕櫚酸酯和膽固醇在ESCC細(xì)胞中上調(diào)。

3 討論

代謝組學(xué)通過(guò)考察生物體系受刺激或擾動(dòng)前后的代謝物譜及其動(dòng)態(tài)變化來(lái)研究生物體系的代謝網(wǎng)絡(luò)。與基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)相比，代謝組學(xué)更接近于表型，能更直接、更準(zhǔn)確地反映生物體的生理、病理狀態(tài)[10]。腫瘤細(xì)胞為滿足快速增殖的需求，必須改變細(xì)胞內(nèi)的代謝模式來(lái)產(chǎn)生大量的能量和物質(zhì)，因此腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中必然伴隨著代謝改變，在當(dāng)前腫瘤研究中，代謝組學(xué)的應(yīng)用發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用[11]。

本研究通過(guò)基于GC-MS的代謝組學(xué)分析了ESCC細(xì)胞與Het-1A細(xì)胞的代謝差異，結(jié)果表明差異代謝途徑主要涉及氨基酸代謝、糖代謝及能量代謝，其中賴氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、色氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、纈氨酸、塔格糖、單棕櫚酸酯及膽固醇等小分子代謝物在ESCC細(xì)胞中的含量均升高，葡萄糖含量減少。Wang等[12]同樣發(fā)現(xiàn)在食管癌組織中纈氨酸和蛋氨酸含量升高，葡萄糖含量降低。Yang等[13]也發(fā)現(xiàn)在食管癌組織中丙氨酸和谷氨酸含量升高。本研究中作者發(fā)現(xiàn)ESCC細(xì)胞中氨基酸含量明顯升高，這提示腫瘤細(xì)胞為實(shí)現(xiàn)快速增殖而攝取大量的氨基酸。而ESCC細(xì)胞中葡萄糖減少，說(shuō)明常伴有糖代謝紊亂，可能是由于Warburg效應(yīng)的存在，腫瘤細(xì)胞更多地消耗葡萄糖來(lái)維持自身的能量需求，是腫瘤細(xì)胞糖酵解增強(qiáng)的結(jié)果[14]。此外，ESCC細(xì)胞中膽固醇含量高于正常細(xì)胞，研究[15]表明，膽固醇代謝異常會(huì)引起各種疾病，其含量升高與某些惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，且高膽固醇是腫瘤治療的一個(gè)不良預(yù)后因素。

主成分分析得分圖可以反映組間離散程度，圖中每一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣本，可以較直觀地顯示不同組別之間的整體差異。該研究結(jié)果顯示，主成分1解釋了總差異的36.8%，主成分2解釋了總差異的19.0%。4株細(xì)胞在主成分分析得分圖中得到了很好的區(qū)分，說(shuō)明4株細(xì)胞在代謝上有明顯的差異。

總之，腫瘤的發(fā)生發(fā)展往往伴隨著代謝物的改變。本研究中所發(fā)現(xiàn)的這些差異代謝物為進(jìn)一步理解腫瘤的病理機(jī)制及篩選早期診斷標(biāo)志物提供了一定的理論依據(jù)。當(dāng)然，這些結(jié)果還需大量臨床樣本和進(jìn)一步的細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，還需結(jié)合患者血清、血漿、尿液或組織的代謝組學(xué)分析，以獲得更加完整全面的代謝物圖譜。