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    重組抗VEGF人源化單克隆抗體F0001的臨床前主要藥效學(xué)研究

    2019-08-05 18:21:40王羅春瞿愛(ài)東樓麗廣
    上海醫(yī)藥 2019年13期
    關(guān)鍵詞:抑瘤率荷瘤皮下

    王羅春 瞿愛(ài)東 樓麗廣

    摘 要 目的:評(píng)估重組抗VEGF人源化單克隆抗體F0001的臨床前主要藥效學(xué)及與原研藥安維汀的生物類(lèi)似性。方法:從體外作用機(jī)制及活性、體內(nèi)抑瘤作用、及對(duì)荷瘤小鼠PK/PD等方面進(jìn)行研究。結(jié)果:F0001明顯抑制VEGF刺激的KDR磷酸化及下游因子ERK1/2磷酸化;抑制HUVEC細(xì)胞增殖,IC50為123 ng/ml。F0001 5 mg/kg顯著抑制人結(jié)腸癌Ls-174t、肺癌NCI-H460和惡性膠質(zhì)瘤U-87MG裸小鼠皮下移植瘤生長(zhǎng),抑瘤率分別為68%、68%和86%;與化療藥CPT-11合用對(duì)人結(jié)腸癌Ls-174t有抑瘤增效作用,抑瘤率提高到89%。F0001與安維汀體外作用機(jī)制及活性相當(dāng)、體內(nèi)抑瘤效果相當(dāng),二者在人結(jié)腸癌Ls-174t荷瘤小鼠體內(nèi)PK/PD參數(shù)相似。結(jié)論:F0001與原研藥安維汀在主要藥效學(xué)方面高度類(lèi)似。

    關(guān)鍵詞 重組抗VEGF人源化單克隆抗體 安維汀 抑瘤率

    中圖分類(lèi)號(hào):R965; R979.19 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):1006-1533(2019)13-0055-06

    Preclinical pharmacology of recombinant anti-VEGF humanized monoclonal antibody F0001*

    WANG Luochun1**, QU Aidong2***, LOU Liguang3****(1. Shanghai Fudan-Zhangjiang Bio-Pharmaceutical Co., Ltd., Shanghai 201210, China; 2. Shanghai Institute of Biological Products Co., Ltd., Shanghai 200051, China; 3. Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 201203, China)

    ABSTRACT Objective: To evaluate the preclinical pharmacology of recombinant anti-VEGF humanized monoclonal antibody F0001 and its biological similarity to the original drug Avastin. Methods: F0001 was evaluated for its mechanism of action, antitumor activity in vitro and in vivo, and PK/PD in tumor-bearing nude mice. Results: F0001 could significantly inhibit VEGF-stimulated KDR and downstream factor ERK1/2 phosphorylation, and VEGF-stimulated HUVEC proliferation with IC50 of 123 ng/ml. F0001 at 5 mg/kg could significantly inhibit the growth of human colon cancer Ls-174t, lung cancer NCI-H460 and malignant glioma U-87MG tumors subcutaneously transplanted into nude mice with the tumor inhibition rate of 68%, 68% and 86%, respectively. Combination of F0001 with chemotherapy drug CPT-11 produced synergistic antitumor effect in Ls-174 xenografts with the tumor growth inhibition of 89%. Conclusion: The mechanism and activity of F0001 in vitro and in vivo are similar to Avastin and their PK/PD parameters are similar in human colon cancer Ls-174t tumor-bearing mice. The main preclinical pharmacology of F0001 is very similar to that of original drug Avastin.

    KEy WORDS recombinant anti-VEGF humanized monoclonal antibody; Avastin; tumor inhibition rate

    安維汀(貝伐珠單抗注射液, Avastin)是美國(guó)基因技術(shù)公司和羅氏制藥公司開(kāi)發(fā)的一種抗人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的人源化單克隆抗體藥物,與化療藥合用,用于治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌、腦膠質(zhì)瘤、晚期子宮頸癌、鉑耐藥復(fù)發(fā)性卵巢癌、轉(zhuǎn)移性Her2陰性乳腺癌等[1-2];2010年2月也獲準(zhǔn)在我國(guó)上市,用于治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌及非小細(xì)胞肺癌[3]。因此,安維汀是一種廣譜性抗癌藥物,臨床價(jià)值巨大。但其價(jià)格高昂,極大地限制了在我國(guó)臨床使用的可及性。

    復(fù)旦張江公司研制的重組抗VEGF人源化單克隆抗體F0001是安維汀的生物類(lèi)似候選藥物。本研究從F0001的體外作用機(jī)制及活性、體內(nèi)對(duì)裸小鼠荷人結(jié)腸癌Ls-174t或肺癌NCI-H460或惡性膠質(zhì)瘤U-87MG的抑瘤活性、以及在荷瘤裸小鼠的體內(nèi)代謝動(dòng)力學(xué)(pharmacokinetics based on pharmacodynamic drug concentration,PK/PD)等方面[4-7],研究了F0001的臨床前主要藥效學(xué)作用及其與原研藥安維汀的生物類(lèi)似性,以便為本品臨床研究提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 供試藥物

    重組抗VEGF人源化單克隆抗體(簡(jiǎn)稱(chēng)F0001)注射液(上海復(fù)旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司研制,批號(hào)20140701);安維?。≧oche Pharma (Schweiz) Ltd.,批號(hào)H0125B03、 H0132B04,使用前將供試藥用培養(yǎng)液或含0.1% 牛血清白蛋白(BSA)的生理鹽水稀釋至適當(dāng)濃度,置2~8 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫?;鹽酸伊立替康(CPT-11)(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司,批號(hào)616130304,使用時(shí)用生理鹽水配制。

    1.2 試劑、儀器及細(xì)胞株

    胎牛血清(FBS)購(gòu)自Hyclone公司;培養(yǎng)基M199/RPMI 1640購(gòu)自Gibco BRL公司;VEGF165購(gòu)自R&D Systems公司;phospho-ERK1/2 antibody及ERK1/2 antibody購(gòu)自Cell Signaling Technology公司;b-tubulin antibody購(gòu)自Sigma公司;抗兔IgG二抗,抗小鼠IgG二抗購(gòu)自Calbiochem公司;PVDF膜及ECL檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Millipore公司;磺酰羅丹明B(SRB)購(gòu)自Sigma公司;Synergy H4多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自BioTek公司。

    人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株(HUVEC)(美國(guó)ATCC,用含20 mg/ml ECGS、20% FBS的M199培養(yǎng)2~6代進(jìn)行實(shí)驗(yàn));人結(jié)腸癌Ls-174t細(xì)胞株/肺癌NCI-H460細(xì)胞株/惡性膠質(zhì)瘤U-87MG細(xì)胞株均購(gòu)自美國(guó)ATCC,均用含有青霉素、鏈霉素、及10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)。

    1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    BALB/cA裸小鼠,雌性,6~7周,分別購(gòu)自上海靈暢生物科技有限公司,合格證號(hào)2013001801920、2013001804063;上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司,合格證號(hào)2007000572618、2007000571898、2007000-573259。

    1.4 試驗(yàn)方法

    1)對(duì)VEGF刺激的VEGFR2/KDR信號(hào)作用(Western blot法)[4,8] HUVEC接種于六孔板中,將不同濃度(0.001~10 mg/ml)F0001或安維汀與50 ng/ml VEGF預(yù)孵育30 min,再作用于HUVEC 5 min,然后收集細(xì)胞裂解。細(xì)胞裂解物在沸水浴中加熱變性。取上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳,而后用濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜,將膜置于一抗溶液中溫育,再用含TBS/T洗滌。將膜置于二抗溶液中室溫反應(yīng)1 h;同上洗膜三次后,用ECL試劑發(fā)色、顯影。

    2)對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖生長(zhǎng)的抑制作用(SRB法)[4,9] 接種一定數(shù)量對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HUVEC于96孔培養(yǎng)板,貼壁生長(zhǎng)24 h,將不同濃度(0.3~3 000 ng/ml)F0001或安維汀與40 ng/ml VEGF預(yù)孵育30 min,再作用于HUVEC。每濃度設(shè)復(fù)孔,同時(shí)設(shè)相應(yīng)濃度溶媒對(duì)照。然后將HUVEC于37 ℃、5% CO2條件培養(yǎng)72 h。SRB染色,加入CCK-8溶液,37 ℃放置4 h。用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值,應(yīng)用公式:抑制率 =(對(duì)照孔細(xì)胞OD值-給藥孔細(xì)胞OD值)/對(duì)照孔細(xì)胞OD值×100%,計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率及半數(shù)抑制濃度IC50。

    3)對(duì)裸小鼠皮下移植瘤的療效[4,7] 裸小鼠分別皮下接種人結(jié)腸癌Ls-174t細(xì)胞或人肺癌NCI-H460細(xì)胞或人惡性膠質(zhì)瘤U-87MG細(xì)胞,待腫瘤生長(zhǎng)至100~150 mm3后,將各類(lèi)荷瘤動(dòng)物分別隨機(jī)分組后給藥(D0),給藥劑量和給藥方案見(jiàn)表1。每周測(cè)瘤體大小2~3次,稱(chēng)鼠重,記錄數(shù)據(jù),計(jì)算腫瘤體積及抑瘤率。

    腫瘤體積(V)計(jì)算公式:V=1/2×a×b2,其中 a、b分別表示瘤長(zhǎng)、瘤寬;

    根據(jù)測(cè)量結(jié)果計(jì)算相對(duì)腫瘤體積(RTV),RTV=Vt/V0,其中V0為分籠給藥時(shí)(即D0)所測(cè)得的腫瘤體積,Vt為每次測(cè)量時(shí)的腫瘤體積。

    應(yīng)用公式T/C(%)=(T-T0)/(C-C0)×100%,計(jì)算抑瘤率;抑瘤率(%)=100%-T/C(%)。其中T、C為實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)給藥組、生理鹽水組的腫瘤體積;T0、C0為實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)給藥組、生理鹽水組的腫瘤體積。

    當(dāng)腫瘤出現(xiàn)消退時(shí),抑瘤率(%)=100%-(T- T0)/T0×100%。如果腫瘤比起始體積縮小,即T

    4)對(duì)裸小鼠的代謝動(dòng)力學(xué)[4,10] 裸小鼠皮下接種人結(jié)腸癌Ls-174t細(xì)胞,待腫瘤生長(zhǎng)至200~300 mm3后,將動(dòng)物隨機(jī)分組,分別單次靜脈注射F0001或安維汀1.5和5 mg/kg,給藥后5 min、4 h、24 h,48 h、72 h、96 h、168 h,各取4只小鼠,眼眶采集全血,凝血后離心采集血清;同時(shí)取腫瘤組織。血清、腫瘤組織于-80 ℃保存,最終檢測(cè)藥物濃度。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 對(duì)VEGF刺激的VEGFR2/KDR信號(hào)的抑制作用

    如圖1所示,VEGF顯著誘導(dǎo)高表達(dá)KDR的HUVEC細(xì)胞中的KDR磷酸化(左起,第2列);F0001在1 mg/mL能明顯抑制VEGF刺激的KDR磷酸化及下游因子ERK1/2磷酸化,其抑制活性與參比抗體安維汀相當(dāng)。

    注:左起第2列顯示,VEGF誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞的KDR信號(hào)通路磷酸化,即P-KDR條帶變深;以及其下游信號(hào)ERK1/2的磷酸化,即P- ERK1/2條帶變深。隨著F0001劑量的增加(左起第3~7列),由于其對(duì)VEGF的中和抑制作用,VEGF誘導(dǎo)的磷酸化效應(yīng)逐步減弱,即P-KDR、P- ERK1/2條帶逐步變淡,比較明顯的效應(yīng)劑量是從1 mg/ml起

    2.2 對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖生長(zhǎng)的抑制作用

    F0001可顯著抑制VEGF刺激的HUVEC細(xì)胞增殖,其IC50為123 ng/ml,與安維?。↖C50 = 122 ng/ml)相當(dāng)(圖2)。

    2.3 對(duì)裸小鼠皮下移植瘤的抑制作用

    F0001或安維汀對(duì)裸小鼠皮下移植瘤的抑瘤效果見(jiàn)表2。

    1) F0001 0.5/1.5/5 mg/kg可明顯抑制人結(jié)腸癌Ls- 174t裸小鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng),抑瘤率分別為40%、47%和68%;安維汀 1.5/5 mg/kg對(duì)Ls-174t的抑瘤率分別為46%和63%。荷瘤小鼠對(duì)兩藥物均能很好耐受,沒(méi)有體重下降等癥狀發(fā)生??傮w比較,二者對(duì)Ls-174t裸小鼠皮下移植瘤療效相當(dāng)。

    2) CPT-11 6 mg/kg對(duì)Ls-174t的抑瘤率為60%;F0001或安維汀與CPT-11合用,療效顯著增強(qiáng),抑瘤率分別從單藥的69%和68%提高到89%和89%。CPT-11單用使荷瘤小鼠體重下降,但與F0001或安維汀合用小鼠狀態(tài)有所改善,體重回升??傮w比較,無(wú)論是單用還是與CPT-11合用,F(xiàn)0001和安維汀對(duì)結(jié)腸癌Ls-174t的療效相當(dāng)。

    3) F0001 0.5/1.5/5 mg/kg可明顯抑制人肺癌NCI-H460裸小鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng),抑瘤率分別為53%、62%和68%;安維汀 1.5/5 mg/kg對(duì)NCI-H460的抑瘤率分別為57%和61%。荷瘤小鼠對(duì)兩藥物均能很好耐受,沒(méi)有體重下降等癥狀發(fā)生??傮w比較,二者對(duì)NCI-H460裸小鼠皮下移植瘤療效相當(dāng)。

    4) F0001 1.5/5 mg/kg可明顯抑制人惡性膠質(zhì)瘤U-87MG裸小鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng),抑瘤率分別為74%和86%;安維汀 1.5/5 mg/kg對(duì)U-87MG的抑瘤率分別為64%和83%。荷瘤小鼠對(duì)兩藥物均能很好耐受,沒(méi)有體重下降等癥狀發(fā)生??傮w比較,二者對(duì)U-87MG裸小鼠皮下移植瘤療效相當(dāng)。

    2.4 對(duì)裸小鼠的代謝動(dòng)力學(xué)

    人結(jié)腸癌Ls-174t荷瘤裸小鼠單次靜脈注射F0001或安維汀 1.5/5.0 mg/kg后,血清藥物峰濃度時(shí)間Tmax均相同;同等劑量下,血清藥物濃度C0值和血清藥物暴露水平AUC0-t都比較接近,提示F0001與安維汀在荷瘤鼠中的血清藥代過(guò)程相似。

    在腫瘤組織中,F(xiàn)0001或安維汀 5.0 mg/kg單次注射后的達(dá)峰時(shí)間Tmax、峰濃度Cmax、藥物暴露水平AUC0-t都比較一致??傮w結(jié)果提示,二者在荷瘤裸小鼠體內(nèi)的代謝動(dòng)力學(xué)(PK/PD)過(guò)程相似。

    3 討論

    早期我們從體外作用機(jī)制及活性、體內(nèi)對(duì)裸小鼠荷人結(jié)腸癌Ls-174t(包括單藥及與化療藥合用)、肺癌NCI-H460、惡性膠質(zhì)瘤U-87MG的抑瘤活性等方面研究了F0001的臨床前主要藥效學(xué),隨著我國(guó)《生物類(lèi)似藥研發(fā)與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則(試行)》的出臺(tái)[11],我們結(jié)合本品藥代動(dòng)力學(xué)(PK)試驗(yàn)(另行試驗(yàn)研究)補(bǔ)充進(jìn)行了本品在荷瘤裸小鼠的體內(nèi)代謝動(dòng)力學(xué)(PK/PD)的試驗(yàn)研究。

    試驗(yàn)中由于試劑、耗材、及96孔板細(xì)胞復(fù)孔的均一性等原因,部分單孔OD值數(shù)據(jù)出現(xiàn)反跳現(xiàn)象,但不影響F0001隨濃度增加對(duì)VEGF的抑制作用。后續(xù)本品生產(chǎn)中活性檢測(cè)的質(zhì)控將得到優(yōu)化。

    F0001與安維汀在荷人結(jié)腸癌Ls-174t裸小鼠中的血清藥代過(guò)程相似,高劑量(5.0 mg/kg)時(shí)二者在腫瘤組織中的暴露水平也一致。但是,在低劑量(1.5 mg/kg)時(shí)二者在腫瘤組織中的暴露水平有差異,AUC0-t分別為4.24和13.71 h·mg/ml,分析其原因主要是受試品在腫瘤組織中48 h后的濃度已均低于定量下限。

    總體而言,F(xiàn)0001與安維汀體外作用機(jī)制及活性相當(dāng)、體內(nèi)抑瘤效果相當(dāng),二者在人結(jié)腸癌Ls-174t荷瘤小鼠體內(nèi)PK/PD參數(shù)相似;F0001與原研藥安維汀在主要藥效學(xué)方面高度類(lèi)似。

    參考文獻(xiàn)

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