基于固相萃取膜盤技術(shù)分離富集海水中軟骨藻酸

王九明 陳軍輝 何秀平 李曉彤 吳丹妮 鄭曉玲 王小如

摘?要?軟骨藻酸（Domoic acid， DA）是由海洋硅藻產(chǎn)生的一種可致人記憶缺失的親水性毒素，對(duì)海產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)以及人類健康造成嚴(yán)重威脅。本研究建立了一種高效富集海水中微量DA的新方法，結(jié)合高效液相色譜-紫外檢測(cè)/質(zhì)譜分析實(shí)現(xiàn)了養(yǎng)殖海水中DA的檢測(cè)。利用磺化苯乙烯-乙烯基苯共聚物材質(zhì)的固相萃取膜盤，對(duì)經(jīng)甲酸酸化處理的海水樣品中的DA進(jìn)行富集、凈化;采用反相C18色譜柱分離DA，以含2.0 mmol/L乙酸銨和0.1%（V/V）甲酸的90.0%（V/V）乙腈為流動(dòng)相，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為242 nm。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)海水中DA的富集倍數(shù)可達(dá)2000倍，平均回收率89.3%，具有良好的精密度（相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）≤4.0%）;海水中DA的檢出限（S/N=3）為2.5 ng/L， 使高效液相色譜-紫外檢測(cè)能滿足實(shí)際海水中DA測(cè)定的靈敏度要求。采用本方法對(duì)中國(guó)東海部分海域海水中的DA進(jìn)行了檢測(cè)，在兩個(gè)站位海水樣品中檢出DA，含量最高可達(dá)2.7 μg/L。本方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高，是近海養(yǎng)殖海水環(huán)境中DA測(cè)定的有效方法。

關(guān)鍵詞?軟骨藻酸; 盤式固相萃取; 海水; 高效液相色譜

1?引 言

當(dāng)前，海洋環(huán)境污染日趨嚴(yán)重，赤潮現(xiàn)象頻頻發(fā)生。由赤潮生物暴發(fā)所產(chǎn)生的大量生物毒素通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，進(jìn)而威脅人類健康[1]。軟骨藻酸（Domoic acid， DA）是一種具有神經(jīng)毒性的氨基酸類化合物，是記憶喪失性貝毒的主要成分，主要由海洋硅藻-擬菱形藻（Pseudo-nitzschia）產(chǎn)生[2]。DA能夠引起海洋哺乳動(dòng)物及人類中毒， 甚至死亡[3～8]。鑒于其對(duì)人類健康存在的潛在威脅，國(guó)際食品法典委員會(huì)（CAC）規(guī)定貝類中DA的安全限量為20.0 μg/g[9]，美國(guó)、加拿大、歐盟、日本和中國(guó)等國(guó)家相繼執(zhí)行此國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。

近年來(lái)，有害擬菱形藻及其產(chǎn)生的DA在全球海域的分布范圍逐漸擴(kuò)大[10，11]。本格拉上升流海域檢測(cè)到DA的最高濃度達(dá)180 ng/L[12]; 在法國(guó)北海海域近岸海水中DA濃度在102～263 ng/L之間[13]。2015年5～8月在美國(guó)北部西海岸暴發(fā)的一次大規(guī)模產(chǎn)毒擬菱形藻藻華事件， 造成大量海豚、海獅及海鳥死亡，在該海域螃蟹等海產(chǎn)品中檢出高濃度DA，已超出其安全限量范圍[14]; 2017年中國(guó)近海發(fā)現(xiàn)能夠產(chǎn)生DA的擬菱形藻[15]，南海海域多個(gè)批次海產(chǎn)品中也檢出DA，在扇貝中的累積量高達(dá)10.1 μg/g[16]。DA對(duì)海產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重威脅，因此需對(duì)DA進(jìn)行有效檢測(cè)與監(jiān)測(cè)。目前，DA的檢測(cè)方法主要有生物分析法[17]、高效液相色譜法[18]、熒光檢測(cè)法[19]、質(zhì)譜法[20]、酶聯(lián)免疫分析法[21]和毛細(xì)管電泳法[22]等。其中，高效液相色譜法及高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)具有準(zhǔn)確性高、穩(wěn)定性好的特點(diǎn)，是目前測(cè)定DA的最佳方法。海水是海洋養(yǎng)殖生物的棲息地，海水中毒素的濃度水平直接影響海產(chǎn)品的食用安全，而對(duì)海洋養(yǎng)殖環(huán)境水體中毒素的有效檢測(cè)是海產(chǎn)養(yǎng)殖安全管理的前提。由于海水中DA含量較低，且DA是一種極性較大的親水性物質(zhì)，對(duì)高鹽海水基質(zhì)中的DA直接進(jìn)行儀器檢測(cè)和快速富集比較困難。無(wú)定型TiO2[23]、分子印跡聚合物[2，5]、磁性材料[24]等常被用作吸附劑，對(duì)海水中的DA進(jìn)行分離富集，然而這些吸附材料還未實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，無(wú)法進(jìn)行廣泛推廣應(yīng)用。采用商品化C18固相萃取柱可實(shí)現(xiàn)海水中DA的富集，但富集倍數(shù)僅20倍[25]; 利用商品化的反相C18固相萃取膜盤對(duì)海水中的DA進(jìn)行富集時(shí)，富集倍數(shù)為20倍，回收率達(dá)90.0%以上，然而通過(guò)增加海水上樣量提高富集倍數(shù)時(shí)，方法的回收率明顯下降[26]，說(shuō)明該方法富集倍數(shù)和效率低，不適于海水中痕量DA的高效富集。因此，急需開(kāi)發(fā)對(duì)海水中痕量DA分離效果好、富集倍數(shù)高，并且能夠推廣應(yīng)用的新富集方法。

固相萃取膜盤技術(shù)由于具有盤片上吸附劑分布均勻、超低溶出及動(dòng)力學(xué)高效率（高流速不會(huì)影響回收率）的特點(diǎn)，在大體積水樣處理中具有傳統(tǒng)SPE小柱無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)，已成為環(huán)境水體微量污染物快速富集、凈化的高效方法[26，27]。本研究采用磺化苯乙烯-乙烯基苯（SDB-RPS）共聚物材質(zhì)且對(duì)極性化合物有高效吸附性的固相萃取膜盤，結(jié)合高效液相色譜-紫外檢測(cè)/質(zhì)譜分析法，建立了一種針對(duì)海水中痕量DA進(jìn)行高效富集測(cè)定的新方法，并將其應(yīng)用于東海海域海水樣品中DA的測(cè)定。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?儀器、試劑與藥品

1220型高效液相色譜儀、6320型電噴霧離子阱質(zhì)譜儀（美國(guó)Agilent公司）; FA1104 型電子天平（上海精天電子儀器廠）; Milli-Q超純水處理系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）; KQ-400KDE 型高功率數(shù)控超聲波儀（昆山市超聲儀器有限公司）; RE100-pro旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（北京大龍公司）; 磺化苯乙烯-乙烯基苯（SDB-RPS）固相萃取膜盤、C18固相萃取膜盤（47 mm，美國(guó)3M公司）; 5 TC-C18 （2） 色譜柱（150 mm×4.6 mm）、 Poroshell 120 色譜柱（100 mm× 3.0 mm）、ZORBAX 300 SB-C18色譜柱（150 mm×3.0 mm， 3.5 μm）均購(gòu)于美國(guó)Agilent公司; 0.22 μm 混合纖維膜（上海市新亞凈化器件廠）。

甲酸（色譜純）、乙酸銨（優(yōu)級(jí)純）（瑞士Fluka公司）; 甲醇、乙腈（色譜純，美國(guó)TEDIA公司）; 丙酮、異丙醇（色譜純，德國(guó)Merck公司）; DA 標(biāo)準(zhǔn)品（美國(guó)Sigma公司）; 實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水（18.2 ?MΩ cm）。

2.2?高效液相色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件： Agilent 5 TC-C18 （2） （150 mm×4.6 mm， 5.0 μm）色譜柱，90.0%（V/V）乙腈（含2.0 mmol/L 乙酸銨+0.1%甲酸）為流動(dòng)相，等度洗脫，柱溫35℃，流速1.2 mL/min，二極管陣列檢測(cè)器（DAD）檢測(cè)波長(zhǎng)242 nm，進(jìn)樣量20.0 μL。與質(zhì)譜聯(lián)用分析時(shí)，由HPLC流出進(jìn)行分流，使得進(jìn)入質(zhì)譜的流動(dòng)相流速為0.3 mL/min。

質(zhì)譜條件： 電噴霧正離子模式檢測(cè)，全掃描范圍為m/z 100～500，干燥氣溫度350℃，干燥氣流速10.0 L/min，噴霧氣壓力206.8 kPa。二級(jí)質(zhì)譜分析選擇DA的母離子為[M+H]+ （m/z 312.2），生成特征碎片離子m/z 266.2、294.2、248.2。

2.3?樣品前處理方法

取2.0 L海水樣品，經(jīng)孔徑為0.22 μm的濾膜過(guò)濾去除懸浮顆粒物，加入8.0 mL甲酸進(jìn)行酸化處理，然后進(jìn)行固相萃取膜盤富集。首先對(duì)SDB-RPS固相萃取膜盤進(jìn)行活化處理： 加入10.0 mL丙酮，使丙酮溶液通過(guò)膜片浸泡30 s，抽干; 加入10.0 mL異丙醇，使異丙醇溶液通過(guò)膜片浸泡30 s，抽干; 加入10.0 mL甲醇，待甲醇溶液只剩約1.0 mL時(shí)，加入10.0 mL水，待膜片上保留約1.0 mL水時(shí)，固相萃取膜盤完成活化。取酸化后的海水樣品，以6.0 mL/min的流速過(guò)固相萃取膜盤，加入20.0 mL水對(duì)膜盤進(jìn)行淋洗，抽干; 使用20.0 mL 80.0%（V/V）甲醇分2次對(duì)DA進(jìn)行洗脫，合并洗脫液，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在50℃下將洗脫液進(jìn)濃縮至干，用1.0 mL 乙腈-水（1∶19， V/V）復(fù)溶，轉(zhuǎn)移到進(jìn)樣小瓶中，待測(cè)。

3?結(jié)果與討論

3.1?色譜條件的優(yōu)化

由文獻(xiàn)[28，29]可知，DA有較強(qiáng)的紫外吸收，為了能獲得較高的靈敏度，在210～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。由DA的紫外吸收光譜圖（圖1A）可見(jiàn)， DA的最大吸收峰在242 nm處，因此選擇242 nm作為DA的最佳檢測(cè)波長(zhǎng)，這與文獻(xiàn)[21]結(jié)果一致。反相C18色譜柱常用于DA的HPLC分離分析[5，30]; 考慮到DA是一種極性較大的弱酸性化合物，在反相C18色譜柱上保留較弱，本研究以水-乙腈混合液為流動(dòng)相，對(duì)3根同一廠家不同碳載量的C18色譜柱（5TC-C18（2）、Poroshell 120、ZORBAX 300 SB-C18色譜柱）進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，Agilent 5 TC-C18（2） 色譜柱的分離效果最理想，分離度高， 并且峰形尖銳對(duì)稱，說(shuō)明不同的色譜柱對(duì)海水中的DA分離結(jié)果差異較大，選擇碳載量相對(duì)較低的C18柱尤為關(guān)鍵。在最佳色譜分離檢測(cè)條件下，對(duì)添加DA標(biāo)準(zhǔn)品的海水樣品進(jìn)行了分析，色譜圖如圖1B所示，DA色譜峰尖銳對(duì)稱，與海水中的干擾組分達(dá)到了良好分離，可以準(zhǔn)確積分其峰面積， 進(jìn)而對(duì)海水中DA進(jìn)行定量測(cè)定。

3.2?前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

3.2.1?固相萃取膜盤的比較優(yōu)化?C18固相萃取小柱和膜盤已成功用于水體中DA的有效富集[27，28]。鑒于DA是一種親水性較強(qiáng)的極性化合物，而SDB-RPS固相萃取膜盤對(duì)環(huán)境水體中強(qiáng)極性化合物有良好的富集效果，所以本研究采用空白海水添加DA標(biāo)準(zhǔn)品為陽(yáng)性樣品，對(duì)C18固相萃取膜盤和SDB-RPS固相萃取膜盤富集海水中DA的效率進(jìn)行了比較。結(jié)果表明， SDB-RPS固相萃取膜盤對(duì)海水中DA的富集效率是C18固相萃取膜盤的1.3倍。本研究選取SDB-RPS固相萃取膜盤用于海水中DA的富集。

3.2.2?海水酸化條件的優(yōu)化?DA是一種弱酸性物質(zhì)，在水溶液中易發(fā)生電離，不利于DA在固相萃取膜盤上富集。為提高固相萃取膜盤對(duì)海水中DA的富集效率，在海水樣品中加入適量酸，通過(guò)抑制其電離，可提高方法的富集效率。以不添加甲酸的加標(biāo)海水樣品為對(duì)照，對(duì)海水樣品添加甲酸的量進(jìn)行了優(yōu)化。如圖2所示，在對(duì)照海水樣品中未檢測(cè)到DA，說(shuō)明在海水樣品未經(jīng)酸化處理的條件下，固相萃取膜盤對(duì)海水中DA沒(méi)有明顯的吸附作用。在加入0.2%～0.5%甲酸酸化的加標(biāo)海水樣品中，均檢測(cè)到了DA，說(shuō)明固相萃取膜盤對(duì)酸化后的海水中DA有明顯的富集作用; 而加入0.4%甲酸酸化的海水樣品，固相萃取膜盤對(duì)其DA吸附效率最高。最終選擇加入0.4%甲酸對(duì)海水樣品進(jìn)行酸化處理。Wang等[31]也采用添加0.4%甲酸對(duì)海水樣品進(jìn)行酸化處理，以提高C18固相萃取小柱對(duì)海水中DA的富集效果。

3.2.3?洗脫劑優(yōu)化?在固相萃取前處理過(guò)程中，選擇合適的洗脫劑對(duì)于提高方法的回收率和重復(fù)性至關(guān)重要?？疾炝?0.0 mL 20.0%、50.0%、80.0%、90.0%、100.0%甲醇作為洗脫劑時(shí)，對(duì)SDB-RPS固相萃取膜盤上吸附的DA的洗脫效果。如圖3所示，采用80.0%甲醇作為洗脫劑時(shí)，洗脫效果最好。

3.2.4?海水去除懸浮顆粒物濾膜的優(yōu)化?海水在進(jìn)行固相萃取膜盤處理之前先經(jīng)過(guò)微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾，以除去海水中懸浮固體顆粒物，減小基質(zhì)對(duì)固相萃取膜盤的阻塞和對(duì)目標(biāo)化合物吸附效率的影響?？讖綖?.45和0.22 μm的濾膜常用于去除海水中的懸浮固體顆粒物，本實(shí)驗(yàn)對(duì)這兩種孔徑的濾膜進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，選用孔徑為0.22 μm的濾膜比孔徑為0.45 μm的濾膜具有更好的效果（1.2倍）。

3.3?方法學(xué)考察

本研究采用高效液相色譜-紫外檢測(cè)、外標(biāo)法對(duì)海水樣品中的DA進(jìn)行定量分析，以峰面積對(duì)目標(biāo)化合物的濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線。DA濃度在0.01～4.0 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2=0.9998。在空白海水中加入DA標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照2.3節(jié)方法進(jìn)行處理，以逐漸降低空白加標(biāo)海水中DA濃度的方法確定方法的檢出限。將信噪比（S/N）為3時(shí)所對(duì)應(yīng)DA在海水中的質(zhì)量濃度為檢出限（LOD），方法的LOD為2.5 ng/L。在文獻(xiàn)[18]中采用C18固相萃取膜盤結(jié)合高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定海水中DA的方法， 檢出限為20.0 ng/L，而本方法采用高效液相色譜紫外檢測(cè)具有更好的靈敏度，主要得益于SDB-RPS固相萃取膜盤能對(duì)大體積海水樣品中的DA進(jìn)行高效富集。

取同一濃度加標(biāo)海水樣品5份，采用本方法測(cè)定DA峰面積的RSD為5.4%，保留時(shí)間的RSD為0.02%，表明本方法重復(fù)性良好。采用2.0 L空白海水進(jìn)行DA標(biāo)準(zhǔn)添加實(shí)驗(yàn)，海水中分別添加20.0、80.0和160.0 ng/L的DA，采用本方法進(jìn)行測(cè)定，回收率分別為90.1%、86.3%和91.6%，RSD（n=3）分別為1.7%、4.0%和0.2%，說(shuō)明本方法可用于實(shí)際海水樣品中DA含量的測(cè)定。C18固相萃取膜盤法對(duì)海水中DA的富集倍數(shù)≈20時(shí)，回收率達(dá)到85.0%; 但是，通過(guò)進(jìn)一步增加海水上樣量而提高富集倍數(shù)時(shí)，回收率明顯下降。本研究發(fā)展的SDB-RPS固相萃取膜盤富集法，對(duì)海水中DA的富集倍數(shù)高達(dá)2000，較文獻(xiàn)[23]方法的富集倍數(shù)提升了100倍，回收率為86.3%～91.6%，表明本方法可用于海水中DA的高效富集。

3.4?實(shí)際海水樣品分析

海水中DA的定性鑒別過(guò)程如下： 首先對(duì)DA標(biāo)準(zhǔn)溶液和經(jīng)固相萃取膜盤處理的海水樣品進(jìn)行HPLC-DAD-MS檢測(cè)，通過(guò)比較DA標(biāo)準(zhǔn)溶液和海水樣品中目標(biāo)化合物的紫外檢測(cè)色譜圖（圖 4）可見(jiàn)，海水樣品檢出化合物保留時(shí)間與DA標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間一致，并且DAD全波段掃描獲得的紫外吸收光譜圖也一致，即初步說(shuō)明此化合物是DA。應(yīng)用本方法對(duì)從東海4個(gè)站位采集到的海水樣品進(jìn)行了檢測(cè)，其中的兩個(gè)站位的海水樣品中檢出DA。

DA的相對(duì)分子質(zhì)量為311.2，電噴霧一級(jí)質(zhì)譜分析可以產(chǎn)生特征離子為m/z 312.2，根據(jù)質(zhì)量數(shù)確定此離子為[M+H]+。以 m/z 312.2 [M+H]+為母離子，對(duì)DA標(biāo)準(zhǔn)品溶液和海水樣品進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，可見(jiàn)海水中目標(biāo)化合物（圖5B）與DA標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品的二級(jí)質(zhì)譜特征離子（圖5A）一致，3個(gè)豐度較高的碎片離子均為m/z 266.2 [M+H-HCOOH]+，m/z 248.2 [M+H-HCOOH-H2O]+ 和m/z 294.2 [M+H-H2O]+，進(jìn)一步確定海水中檢測(cè)到的化合物為DA。

HPLC-DAD對(duì)海水中DA測(cè)定結(jié)果表明，兩個(gè)站位海水樣品中DA的濃度分別為0.1和2.7 μg/L， 說(shuō)明我國(guó)東海部分海域的海洋生物面臨一定程度的DA污染威脅。這是首次從我國(guó)東海海水中檢測(cè)到溶解態(tài)DA。與威尼斯Lagoon湖及周邊海域環(huán)境水體中的DA含量（1.5～16.2 ng/L）[32]?對(duì)比可知，本方法測(cè)得的東海部分海域海水中DA濃度明顯偏高。海水中高濃度DA的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步證明該海域存在大量產(chǎn)DA毒素的浮游植物，這也增加了該海域海洋生物DA的污染風(fēng)險(xiǎn)。因此，加強(qiáng)對(duì)該海域DA含量的監(jiān)測(cè)，避免有毒有害藻華的爆發(fā)以及藻毒素中毒事件的發(fā)生，對(duì)于保護(hù)近海環(huán)境、海洋漁業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展、海產(chǎn)品安全具有重要意義。

4?結(jié) 論

建立了一種基于固相萃取膜盤富集的高效液相色譜-紫外檢測(cè)/質(zhì)譜測(cè)定海水中溶解態(tài)DA的新方法。與傳統(tǒng)的固相萃取小柱法相比，固相萃取膜盤法的海水樣品上樣速度快、富集倍數(shù)高、不易堵塞，適于在調(diào)查船對(duì)海水中微量DA的現(xiàn)場(chǎng)快速富集。利用SDB-RPS固相萃取膜盤對(duì)2.0 L海水中微量DA進(jìn)行快速富集，富集倍數(shù)高達(dá)2000倍，方法回收率和重復(fù)性良好，使常規(guī)高效液相色譜-紫外檢測(cè)法達(dá)到了測(cè)定實(shí)際海洋環(huán)境水體中DA的靈敏度要求。本研究也為大體積遠(yuǎn)洋環(huán)境水體或極地海水中痕量有機(jī)物現(xiàn)場(chǎng)快速富集方法的建立提供了新思路，為解決海水樣品體積大、不易在調(diào)查船上長(zhǎng)期冷凍保存和運(yùn)輸?shù)碾y題提供了新方法。

References

1?SHEN Hui-Hui， CHEN Jun-Hui， XU Xiu-Li， PAN Lei， HE Xiu-Ping， WANG Xiao-Ru. Chinese J. Anal. Chem.， 2018， 46（6）： 985-992

申慧慧， 陳軍輝， 徐秀麗， 潘 蕾， 何秀平， 王小如. 分析化學(xué)， 2018， 46（6）： 985-992

2?He X P， Chen J L， Wang J T， Tan L J. J. Chromatogr. A， 2017， 1500： 61-68

3?Kathi A L， Alicia H， Barbie H， Padraig D， Sara S， Nina I， David J M， Frances M D G. Harmful Algae， 2018， 79： 53-57

4?Cook P F， Reichmuth C， Rouse A A， Libby L A， Dennison S E， Carmichael O T， Kruse-Elliott K T， Bloom J， Singh B， Fravel V A， Barbosa L， Stuppino J J， Van Bonn W G， Gulland F M D， Ranganath C. Science， 2015， 350（6267）： 1545-1547

5?AoJ J， Gu J P， Yuan T， Li D， Ma Y N， Shen Z M. Chemosphere， 2018， 199： 98-106

6?Saima A F， Awan S A， Ling S M， Wang R Z， Wang S H. Algal Res.， 2017， 24： 97-110

7?CHU Ying-Qian， XIE Ying， CHEN Xi， CUI Han， ZHANG Xiao-Lin， HUANG Da-Liang. Phys. Test Chem. Anal. Part B， 2015， 51（10）： 1396-1399

褚瑩倩， 謝 瀛， 陳 溪，崔 晗， 張曉林， 黃大亮. ?理化檢驗(yàn)-化學(xué)分冊(cè)， ?2015， 51（10）： 1396-1399

8?Zhang W M， Lin M X， Tong P， Lu Q M， Zhang L. J. Chromatogr. A， 2016， 1443： 54-61

9?CODEX STAN 292-2008， Standard for Live and Raw Bivalve Molluscs （2015 revised version）， Codex Alimentarius Commission （CAC）

10?Bates S S， Hubbard K A， Lundholm N， Montresor M， Leaw C P. Harmful Algae， 2018， 79： 3-43

11?Sminth J， Connell P， Evans R H， Gellene A G， Howard M D A， Jones B H， Kaveggia S， Palmer L， Schnetzer A， Seegers B N， Seubert E L， Tatters A O， Caron D A. Harmful Algae， 2018， 79： 87-104

12?Louw D C， Doucette G J， Lundholm N. Harmful Algae， 2018， 75： 118-128

13?Delegrange A， Lefebvre A， Gohin F， Courcot L， Vincent D. Estuar. Coast. Shelf Sci.， 2018， 214： 194-206

14?Mccabe R M， Hickey B M， Kudela R M， Lefebvre K A， Adams N G， Bill B D， Gulland F M D， Thomson R E， Cochlan W P， Trainer V L. Geophys. Res. Lett.， 2016， 43： 10366-10376

15?Li Y， Huang C X， Xu G S， Lundholm N， Teng S T， Wu H Y， Tan Z J. Harmful Algae， 2017， 67： 119-130

16?JI Wei， ZHENG Jie-Ying， ZENG Xue-Ping， LAN Yu-Xue， LIU Ya， JI Hong-Wu. Mod. Food Sci. Technol.， 2011， 27（1）： 120-122

吉 薇， 鄭潔瑩， 曾雪萍， 藍(lán)玉雪， 劉亞， 吉宏武. ?現(xiàn)代食品科技， ?2011， 27（1）： 120-122

17?WANG Qian， CHENG Jin-Ping， GAO Li-Li， DONG Yu， WANG Wen-Hua. J. Anhui Agric. Sci.， 2011， 39（26）： 16070-16073

王 茜， 程金平， 高利利， 董 宇， 王文華. ?安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， ?2011， 39（26）： 16070-16073

18?Lin Z， Wang D， Peng A， Huang Z. Int. J. Polym. Anal. Charact.， 2017， 22（3）： 202-209

19?Chen Q， Deng L， Chi J， Liu M， Lin X， Xie Z. RSC Adv.， 2017， 7（85）： 53778-53784

20?Gagez A L， Bonnet A， Pineau P， Graber M. Int. J. Environ. Anal. Chem.， 2017， 97（12）： 1-14

21?LIU Ren-Yan， XU Dao-Yan， DONG Yu-Hua， LIANG Yu-Bo. J. Hyg. Res.， 2009， 38（5）： 622-624

劉仁沿， 許道艷， 董玉華， 梁玉波. ?衛(wèi)生研究， ?2009， 38（5）： 622-624

22?Dursun F， nlü S， Yurdun T B. Bull. Environ. Contam. Toxicol.， 2018， 100（3）： 457-462

23?Chan I O， Tsang V W， Chu K K， Leung S K， Lam M H， Lau T C. Anal. Chim. Acta， 2007， 583（1）： 111-117

24?Zhang W M， Lin M X， Tong P， Lu Q M， Zhang L. J. Chromatogr. A， 2016， 1443： 54-61

25?Wang Z， Maucher-Fuquay J， Fire S E， Mikulski C M， Haynes B， Doucette G J. Anal. Chim. Acta， 2012， 715： 71-79

26?Iglesia P D L， Giménez G， Diogène J. J. Chromatogr. A， 2008， 1215（1）： 116-124

27?LI Xiao-Ya， ZHANG Yong-Tao， GUI Jian-Ye， ZHANG Chen-Ling， ZHANG Jing， ZHANG Li. Chinese J. Anal. Chem.， 2017， 45（9）： 1375-1380

李曉亞， 張永濤， 桂建業(yè)， 張辰凌， 張 晶， 張 莉. ?分析化學(xué)， ?2017， 45（9）： 1375-1380

28?ZHOU Xiu-Jin， ZHOU Xiang-Yang， ZHENG Bin， SHAO Hong-Hong， WANG Shu-Na. J. Zhejiang Ocean Univ.， 2012， 31（3）： 211-214

周秀錦， 周向陽(yáng)， 鄭 斌， 邵宏宏， 王淑娜. ?浙江海洋學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， ?2012， 31（3）： 211-214

29?WANG Chan， ZHAO Yong-Tuo， PENG Xin-Ting， SUN Xing-Quan， LIU Hui-Ying， ZHANG Yu. J. Food Quality， 2015， （1）： 72-77

王 嬋， 趙永拓， 彭心婷， 孫興權(quán)， 劉慧穎， 張 彧. ?食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)， ?2015， （1）： 72-77

30?HONG Zhuan， ZHANG Yi-Ping， CHEN Wei-Zhu， GAO Ya-Hui. J. Anal. Sci.， 2014， 30（3）： 319-322

洪 專， 張怡評(píng)， 陳偉珠， 高亞輝. ?分析科學(xué)學(xué)報(bào)， ?2014， 30（3）： 319-322

31?Wang Z， King K L， Ramsdell J S， Doucette G J. J. Chromatogr. A， 2007， 1163： 169-176

32?Barbaro E， Zangrando R， Rossi S， Cairns W R， Piazza R， Corami F. Anal. Bioanal. Chem.， 2013， 405（28）： 9113-9123