基于DNA模板點(diǎn)擊化學(xué)和催化發(fā)夾型DNA自組裝反應(yīng)的新型均相電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)miRNA-21

湯玉嬌 戴詩(shī)巖 周羽婷 程圭芳 何品剛 方禹之

摘?要?構(gòu)建了一種利用DNA模板點(diǎn)擊化學(xué)和催化發(fā)夾型DNA自組裝反應(yīng)（Catalyzed hairpin assembly，CHA）指示并放大信號(hào)，檢測(cè)miRNA-21的新型均相電化學(xué)生物傳感器。根據(jù)目標(biāo)物miRNA-2的序列設(shè)計(jì)了兩種發(fā)夾結(jié)構(gòu)的探針，分別修飾5-氨基-2，3-二氰基-1，4-萘醌（ADNQ）和3（2-呋喃）丙酸（FPA），利用目標(biāo)物miRNA-2引發(fā)的兩種探針間的催化發(fā)夾組裝使ADNQ和FPA的分子間距縮小，發(fā)生Diels-Alder反應(yīng)，在實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物循環(huán)信號(hào)放大的同時(shí)，破壞ADNQ的化學(xué)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)降低，據(jù)此檢測(cè)miRNA-21的濃度。采用循環(huán)伏安法（CV）、差分脈沖伏安法（DPV）和凝膠電泳等考察了此傳感器的分析性能。結(jié)果表明，在0.1～1.0×104 pmol/L濃度范圍內(nèi)，此傳感器響應(yīng)電流變化值與miRNA-21濃度的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，檢出限為0.037 pmol/L（S/N=3）。將此傳感器用于小鼠血清和全血裂解液樣品的檢測(cè)，結(jié)果表明， 本傳感器適用于miRNA-21的檢測(cè)。

關(guān)鍵詞?DNA模板點(diǎn)擊化學(xué); Diels-Alder反應(yīng); 催化發(fā)夾組裝; 電化學(xué)生物傳感器

1?引 言

miRNAs是一類長(zhǎng)度為19～25個(gè)核苷酸的非編碼RNA，在多種腫瘤中表達(dá)水平高于正常水平，可作為代表性的腫瘤生物標(biāo)記物，如miRNA-21在乳腺癌細(xì)胞和上皮卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著高于正常水平[1～3]。因此，建立快速有效的miRNA分析檢測(cè)方法對(duì)腫瘤的診斷和預(yù)后有重要意義。

目前，檢測(cè)miRNA的方法主要有Northern blotting法[4]、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法[5]、原位雜交法[6]和微陣列芯片法[7]等。這些方法各有自身的優(yōu)點(diǎn)，如實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)速度快、靈敏度高。然而，這些方法通常需要昂貴的試劑，對(duì)設(shè)備和操作人員要求較高[8]。相比之下，電化學(xué)生物傳感器成本低、靈敏度高、特異性好、操作簡(jiǎn)單、易于小型化，具有明顯的實(shí)際應(yīng)用優(yōu)勢(shì)[9，10]。

點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)是一類反應(yīng)條件溫和的反應(yīng)[11，12]，已被用于構(gòu)建傳感器[13～15]。5-氨基-2，3-二氰基-1，4-萘醌（ADNQ）具有良好的電化學(xué)活性，可與3（2-呋喃）丙酸（FPA）發(fā)生點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致其電化學(xué)活性降低。利用此特性，本研究構(gòu)建了一種基于DNA模板點(diǎn)擊化學(xué)和催化發(fā)夾型DNA自組裝反應(yīng)[16～18]的新型均相電化學(xué)DNA生物傳感器，用于miRNA-21的檢測(cè)，檢測(cè)原理如圖1所示。當(dāng)不存在目標(biāo)物miRNA-21時(shí)，Probe-ADNQ和Probe-FPA不發(fā)生相互作用，分別修飾在Probe 1和Probe 2上的ADNQ和FPC距離較遠(yuǎn)，不能發(fā)生點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，因此Probe-ADNQ能在工作電極上產(chǎn)生一個(gè)良好的ADNQ的DPV特征信號(hào)。當(dāng)存在miRNA-21時(shí)，miRNA-21通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)將Probe-ADNQ的發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開(kāi)，使Probe-ADNQ莖部的堿基序列暴露出來(lái)，然后通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)將Probe-FPA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)打開(kāi)，并將miRNA-21替換下來(lái)，使其進(jìn)入下一個(gè)催化循環(huán);在目標(biāo)物miRNA-21的作用下，Probe-ADNQ和Probe-FPA通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)形成DNA雙鏈，分別修飾在Probe 1和Probe 2上的ADNQ和FPC的距離被拉近，發(fā)生點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，ADNQ的分子結(jié)構(gòu)被破壞，其在工作電極上產(chǎn)生的ADNQ的DPV特征信號(hào)降低信號(hào)降低值與miRNA-21在一定濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。 基于此可實(shí)現(xiàn)miRNA-21的定量檢測(cè)。將本方法用于小鼠血液樣品中miRNA-21的檢測(cè)，結(jié)果表明， 本方法實(shí)用性良好。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?儀器與試劑

CHI660電化學(xué)工作站（上海辰華儀器有限公司）。石墨烯、5-氨基-2，3-二氰基-1，4-萘醌（ADNQ）、3（2-呋喃）丙酸（FPA）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl）、琥珀酸（SA）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。其它試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為超純水（電阻率>18 MΩ cm，由上海純浦實(shí)業(yè)有限公司超純水儀制備）。所用緩沖溶液為Tris-HCl緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl， 15 mmol/L KCl， 4 mmol/L MgCl2， pH=7.4）和Na2CO3-NaHCO3緩沖液（0.05 mol/L， pH=8.9）。寡聚核苷酸均由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，序列見(jiàn)表1。

2.2?實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1?Probe-ADNQ和Probe-FPA的合成?取0.28 g SA、1.36 g EDC·HCl、0.66 g NHS和10 mL DCM置于25 mL圓底燒瓶，室溫下攪拌反應(yīng)3 h，將DCM蒸干，用水洗滌產(chǎn)物，55℃烘干，得到N，N'-（丁二酰二氧基）二琥珀酰亞胺（DSS）固體。將18 nmol Probe1、4 mL Na2CO3-NaHCO3緩沖液（pH=8.9）、0.05 g DSS和4 mL二甲基亞砜（DMSO）在25 mL圓底燒瓶中混合，室溫下攪拌反應(yīng)4 h，用截留分子量為3000的超濾管超濾純化。在純化產(chǎn)物中加入4 mL Na2CO3-NaHCO3緩沖液（pH=8.9）、4 mL DMSO和0.06 g ADNQ，在25 mL圓底燒瓶中混合，室溫下攪拌反應(yīng)4 h。超濾純化，所得的Probe-ADNQ溶于PBS（pH=7.4）， 4℃保存。

取0.5 g FPA、 1.71 g EDC·HCl、 1.03 g NHS、 10 mL DCM和0.5 mL二異丙基乙胺，在25 mL圓底燒瓶中混合，室溫下攪拌反應(yīng)3 h，用水洗滌，有機(jī)相用無(wú)水Na2SO4干燥后，將DCM蒸干，保留固體。將18 nmol Probe 2、 0.155 g固體產(chǎn)物、4 mL DMSO和4 mL Na2CO3-NaHCO3緩沖液（pH=8.9）在25 mL圓底燒瓶中混合，室溫下攪拌反應(yīng)4 h，超濾純化，所得Probe-FPA溶于PBS（pH 7.4），4℃保存。

2.2.2?石墨烯納米金復(fù)合材料的合成?將1 mg石墨烯和0.1 g抗壞血酸充分分散到10 mL水中，加入2 mL 1%（w/w）氯金酸溶液，室溫下攪拌反應(yīng)8 h，離心，產(chǎn)物分散到1 mL水中。

2.3?電化學(xué)檢測(cè)

用0.05 μm氧化鋁粉拋光打磨玻碳電極（d=3 mm）， 用氮?dú)獯蹈?，在電極表面滴涂5 μL石墨烯納米金復(fù)合材料，50℃下烘干。

Probe-ADNQ和Probe-FPA溶液濃度均為2 μmol/L，與不同濃度的miRNA-21在Tris-HCl緩沖液（pH=7.4）中反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后取5 μL反應(yīng)液滴涂到石墨烯納米金修飾電極的表面，50℃下烘干，于PBS溶液（pH 7.4）中用差分脈沖伏安法（DPV）采集電化學(xué)信號(hào)。三電極體系：修飾玻碳電極為工作電極，Ag/AgCl電極和Pt絲電極為參比電極和對(duì)電極，掃描范圍為0.60～0.15 V，掃描速度為0.1 V/s。

3?結(jié)果與討論

3.1?傳感器的可行性實(shí)驗(yàn)

考察了利用點(diǎn)擊化學(xué)指示電化學(xué)傳感器信號(hào)的可行性。如圖2A所示，濃度較高時(shí)，ADNQ有很強(qiáng)電化學(xué)響應(yīng)， FPA沒(méi)有明顯的電化學(xué)信號(hào)，ADNQ和FPA在室溫下反應(yīng)1 h后， 電化學(xué)響應(yīng)明顯降低，說(shuō)明濃度較高時(shí)，ADNQ和FPA間發(fā)生點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)的機(jī)率大，ADNQ的化學(xué)結(jié)構(gòu)被破壞，失去電化學(xué)活性。如圖2B所示，濃度較低時(shí)，ADNQ有較強(qiáng)的電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)，F(xiàn)PA沒(méi)有明顯的響應(yīng)信號(hào)，低濃度的ADNQ和FPA在室溫下反應(yīng)1 h后，其電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)無(wú)明顯變化，說(shuō)明濃度較低時(shí)ADNQ和FPA間發(fā)生點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)的機(jī)率很低，ADNQ的化學(xué)結(jié)構(gòu)不易被破壞，電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)無(wú)明顯降低。上述結(jié)果表明，可利用ADNQ和FPA間的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)指示電化學(xué)傳感器的響應(yīng)信號(hào)。

考察了采用ADNQ和FPA修飾探針指示傳感器信號(hào)的可行性。如圖3所示，Probe-ADNQ有較強(qiáng)電化學(xué)信號(hào)（圖3曲線a），Probe-FPA無(wú)明顯電信號(hào)（圖3曲線b）。當(dāng)不存在目標(biāo)物miRNA-21時(shí)，Probe-ADNQ和Probe-FPA的反應(yīng)混合物有較強(qiáng)的電化學(xué)信號(hào)（圖3曲線c），說(shuō)明Probe-ADNQ和Probe-FPA間不能形成雙鏈，修飾在探針上的ADNQ和FPA距離遠(yuǎn)，不能發(fā)生點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)。當(dāng)存在目標(biāo)物miRNA-21時(shí)，Probe-ADNQ和Probe-FPA的反應(yīng)混合物電化學(xué)信號(hào)顯著下降（圖3曲線d）， 說(shuō)明Probe-ADNQ和Probe-FPA間形成雙鏈，修飾在探針上的ADNQ和FPA距離被拉近，發(fā)生點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)。上述結(jié)果表明，可通過(guò)目標(biāo)物miRNA引發(fā)Probe-ADNQ和Probe-FPA形成雙鏈，使修飾在探針上的ADNQ和FPA發(fā)生點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，指示電化學(xué)傳感器的響應(yīng)信號(hào)。

采用聚丙烯酰胺凝膠電泳方法考察目標(biāo)物是否能引發(fā)Probe 1 和Probe 2形成雙鏈。如圖4所示，不存在目標(biāo)物miRNA-21時(shí)，泳道e只有兩個(gè)條帶，且分別與泳道b和泳道c中Probe 1 和Probe 2的位置對(duì)應(yīng)，Probe 1與Probe 2未形成雙鏈;目標(biāo)物miRNA-21存在時(shí)，泳道d中出現(xiàn)了一個(gè)新的條帶，且分別與Probe 1和Probe 2對(duì)應(yīng)的兩個(gè)條帶明亮度變暗，表明Probe 1和Probe 2形成雙鏈。電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，目標(biāo)物miRNA-21可引發(fā)Probe 1和Probe 2形成雙鏈。

3.2?實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

探針濃度、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度對(duì)傳感器的檢測(cè)性能有重要影響。當(dāng)探針濃度過(guò)低時(shí)，miRNA-21引發(fā)Probe-ADNQ和Probe-FPA形成雙鏈的效率低，不利于檢測(cè)。如圖5A所示，隨著探針濃度增加，傳感器響應(yīng)電流ΔI增大，當(dāng)探針濃度為2.0 μmol/L時(shí)，傳感器ΔI趨于穩(wěn)定。因此，選擇最適探針濃度為2.0 μmol/L。如圖5B所示，隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，傳感器ΔI先增加，50 min后達(dá)到穩(wěn)定。選擇50 min為最佳反應(yīng)時(shí)間。反應(yīng)溫度過(guò)低時(shí)，反應(yīng)速率低;反應(yīng)溫度過(guò)高，不利于DNA鏈之間的雜交。如圖5C所示，隨著反應(yīng)溫度升高，傳感器ΔI先增加， 30℃時(shí)ΔI開(kāi)始下降。因此，選擇最佳反應(yīng)溫度為30℃。

3.3?傳感器的特異性

用本傳感器分別檢測(cè)0.1 nmol/L的miRNA-21、單堿基錯(cuò)配miRNA、三堿基錯(cuò)配miRNA、完全不互補(bǔ)miRNA的響應(yīng)信號(hào)。如圖6所示，單堿基錯(cuò)配miRNA、三堿基錯(cuò)配miRNA和完全不互補(bǔ)miRNA的檢測(cè)信號(hào)都很弱，分別為miRNA-21檢測(cè)信號(hào)的12.8%、 7.1%和6.9%，說(shuō)明傳感器具有良好的特異性。

3.4?傳感器的分析性能

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)不同濃度的miRNA-21進(jìn)行了檢測(cè)。以2.0 μmol/L Probe-ADNQ的信號(hào)為起始信號(hào)， 以2.0 μmol/L Probe-ADNQ、 2.0 μmol/L Probe-FPA和miRNA-21反應(yīng)后的信號(hào)作為結(jié)束信號(hào)，以起始信號(hào)與結(jié)束信號(hào)之差ΔI作為傳感器輸出信號(hào)。如圖7A所示，隨著miRNA-21濃度增加（0、 0.1、 1、 10、 100、 500、 1000、 5000和10000 pmol/L），傳感器DPV峰電流逐漸減小，說(shuō)明miRNA-21引發(fā)probe-ADNQ和Probe-FPA形成雙鏈的效率增加，分別標(biāo)記在探針上的ADNQ與FPA發(fā)生點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)的效率增加，ADNQ的化學(xué)結(jié)構(gòu)被破壞，其特征電信號(hào)下降。如圖7B所示，當(dāng)miRNA-21濃度在0.1～1.0×104 pmol/L范圍內(nèi)時(shí)，ΔI隨miRNA-21濃度對(duì)數(shù)值的增加而線性增大，其線性回歸方程ΔI（μA）=0.31+0.08lgCmiRNA-21 （pmol/L）， R2=0.9793，檢出限為0.037 pmol/L（S/N=3）。

3.5?實(shí)際小鼠血樣分析

采用傳感器對(duì)小鼠全血和血清樣品中的miRNA-21進(jìn)行了測(cè)定，考察傳感器的實(shí)用性， 小鼠全血和血清中未檢出miRNA-21，標(biāo)準(zhǔn)添加實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2和表3所示。結(jié)果表明，小鼠血清中的加標(biāo)回收率為92.0%～105.0%，RSD小于5.5%;全血裂解液中的加標(biāo)回收率為96.0%～104.0%，RSD小于7.0%，表明本傳感器實(shí)用性良好，可用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。

4?結(jié) 論

構(gòu)建了一種基于DNA模板點(diǎn)擊化學(xué)和催化發(fā)夾型DNA自組裝反應(yīng)的新型均相電化學(xué)生物傳感器，用于miRNA-21的檢測(cè)。傳感器不需要將探針固定在電極表面，制備簡(jiǎn)單快速;其與目標(biāo)物的識(shí)別與檢測(cè)發(fā)生在溶液中，位阻小，識(shí)別效率高;使用催化發(fā)夾組裝放大信號(hào)，不使用酶;此傳感器利用miRNA-21引發(fā)分別標(biāo)記在探針上的ADNQ和FPA間的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)指示傳感器信號(hào)，僅需5 μL反應(yīng)液即可獲得可觀的信號(hào)響應(yīng)。此傳感器操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、特異性好，具有良好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

References

1?Croce C M， Calin G A. Cell， 2005， 122（1）： 6-7

2?Farazi T A， Spitzer J I， Morozov P. J. Pathol.， ?2015， ?223（2）： 102-115

3?Gasparri M L， Besharat Z M， Besharat A R. Current Knowledge of miRNAs as Biomarkers in Breast Cancer，Recent Trends in Cancer Biology： ?Spotlight on Signaling Cascades and microRNAs， Springer， Cham.， ?2018： ??221-231

4?Koscianska E， Staregaroslan J， Sznajder L J. Bmc Mol. Biol.， ?2011， ?12（14）： 1-7

5?Radonic' A， Thulke S， Mackay I M. Biochem. Biophys. Res. Commun.， ?2004， ?313（4）： ?856-862

6?Muchtar E， Dispenzieri A， Kumar S K. Leukemia， ?2017， ?31（7）： ?1562-1569

7?Sui W， Shi Z， Xue W. Oncol. Rep.， ?2017， ?37（3）： ?1804-1814

8?Fu S W， Chen L， Man Y G. J.Cancer， ?2011， ?2（1）： ?116-122

9?Wang J. Biosens. Bioelectron.， ?2006， ?21（10）： ?1887-1892

10?Zhou M， Dong S. Acc. Chem. Res.， ?2011， ?44（11）： ?1232-1243

11?Hoyle C E， Bowman C N. Angew. Chem. Inter. Edit.， ?2010， ?49（9）： ?1540-1573

12?Wurz R P， Dellamaggiore K， Dou H. J. Med. Chem.， ?2017， ?61（2）： ?453-461

13?Qiu S， Gao S， Liu Q. Biosens. Bioelectron.， ?2011， ?26（11）： ?4326-4330

14?NIE Ji， LI Jian-Ping， DENG Huan， PAN Hong-Cheng. Chinese J. Anal. Chem.， ?2015， ?43（4）： 609-617

聶 驥， 李建平， 鄧 歡， 潘宏程. 分析化學(xué)， ?2015， ?43（4）： ?609-617

15?Ran Q， Peng R， Liang C. Talanta， ?2011， ?83（5）： 1381-1385

16?Yu J， Li B， Milligan J N. J. Am. Chem. Soc.， ?2013， ?135（20）： 7430-7433

17?YU Bei， CHEN Shi-Jian， XU Tian-Xiong， ZHAN Zhong-Xu， XU Heng-Yi. Journal of Instrumental Analysis， ?2018， ?37（12）： 1514-1520

俞 蓓， 陳時(shí)建， 徐天雄， 占忠旭， 許恒毅. 分析測(cè)試學(xué)報(bào)， ?2018， ?37（12）： ?1514-1520

18?Zhuang J， Lai W， Chen G. Chem. Commun.， ?2014， ?50（22）： ?2935-2938