超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定牛肉中的阿托品

林奕云，楊 熙，林 晨，張志軍，張 飛

(中國(guó)廣州分析測(cè)試中心 廣東省分析測(cè)試技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510070)

阿托品是一種M膽堿受體阻斷藥，具有解除平滑肌的痙攣、抑制腺體分泌、解除迷走神經(jīng)對(duì)心臟的抑制、興奮呼吸中樞等藥理活性，在獸醫(yī)臨床上主要作為解毒藥，緩解有機(jī)磷中毒的癥狀[1]。我國(guó)農(nóng)業(yè)部第235號(hào)公告規(guī)定，在動(dòng)物源食品中不得檢出阿托品。但有一些部分商家在牛飼養(yǎng)過程中擅自使用阿托品注射藥物，利用其抑制腺體分泌的作用，使牛因口渴而大量飲水，從而增加體重,以謀取更多的經(jīng)濟(jì)利益。

目前阿托品的檢測(cè)方法有：氣相色譜法[2]、液相色譜法[3-5]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[6-9]等。由于獸藥殘留的含量較低，液相色譜法靈敏度無法滿足其檢測(cè)要求。質(zhì)譜法具有靈敏度高、專屬性強(qiáng)的特點(diǎn)，為有效監(jiān)控牛肉中阿托品的殘留量，本文優(yōu)化了提前條件、液相色譜和質(zhì)譜條件，建立了超高效液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法測(cè)定牛肉中阿托品殘留量的分析方法。該方法靈敏度高、回收率和重現(xiàn)性良好、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可以檢測(cè)牛肉中阿托品殘留量，為注水牛肉的監(jiān)管提供技術(shù)手段支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器設(shè)備與試劑

Agilent 1290/6460A超高效液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國(guó)安捷倫科技公司；XW-80A型微型旋渦混合儀，上海滬西分析儀器有限公司；KQ-2200型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；Sartorius BSA224S 電子天平，德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；Milli-Q超純水儀，美國(guó)Millipore公司。

阿托品(Atropine，CAS：51-55-8，純度：99.6%)購自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈，色譜純，美國(guó)Honeywell公司；甲酸，色譜純，美國(guó)Tedia公司；甲醇，廣州化學(xué)試劑廠；磷酸二氫鉀，廣州化學(xué)試劑廠；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取10.0 mg阿托品標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成1000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4 ℃冰箱中避光保存。

1.3 樣品前處理

樣品均質(zhì)處理后，稱取5.0 g于50 mL帶蓋離心管中，加入20 mL 0.1 mol/L磷酸二氫鉀緩沖溶液：乙腈(4∶1)溶液，加蓋，渦旋2 min，超聲提取15 min，3500 r/min離心5 min，上清液倒入另一干凈離心管中。殘?jiān)偌尤?0 mL 0.1 mol/L磷酸二氫鉀緩沖溶液：乙腈(4∶1)溶液，重復(fù)提取一次，合并兩次上清液。用0.1 mol/L磷酸二氫鉀緩沖溶液：乙腈(4∶1)溶液4 mL洗滌濾紙，將上清液用濾紙過濾，收集全部濾液于50 mL容量瓶中，定容至50 mL，過0.22 μm濾膜上機(jī)測(cè)定。

1.4 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

稱取5份空白試樣，分別加入適量標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3進(jìn)行處理，制成濃度為0.10、0.50、1.00、2.00、5.00 ng/mL的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.5 色譜/質(zhì)譜測(cè)定條件

1.5.1 液相色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18柱(4.6 mm×50 mm，2.7 μm)；流動(dòng)相A為乙腈，B為0.1%甲酸水溶液；柱溫35 ℃；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量5.0 μL；梯度洗脫程序如下：0～1 min，20%A，1～3 min，20%～30%A，3～3.5 min，30%～90%A，3.5～4 min，90%～20%A，4～5 min，20%A。

1.5.2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源(ESI)，正離子電離模式，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)。鞘流氣溫度350℃，鞘流氣流量11 mL/min，干燥氣溫度為300℃，干燥氣流量5 mL/min，霧化器壓力40 psi，毛細(xì)管電壓3500 V。阿托品的MRM參數(shù)列于表1，安捷倫MassHunter軟件用于定性和定量分析。

表1 阿托品的MRM參數(shù)

注：*表示定量離子對(duì)。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取條件的選擇

基于阿托品是堿性物質(zhì)，具有易溶于水的性質(zhì)，本試驗(yàn)比較了0.1%甲酸水溶液和0.1 mol/L磷酸二氫鉀緩沖溶液對(duì)阿托品提取回收率的影響，結(jié)果表明，用0.1 mol/L磷酸二氫鉀緩沖溶液提取，阿托品的回收率較高。由于乙腈對(duì)蛋白質(zhì)具有一定的沉淀作用，本試驗(yàn)比較了0.1 mol/L磷酸二氫鉀緩沖溶液和乙腈的不同比例對(duì)阿托品提取效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著乙腈的比例增加，阿托品的回收率降低，當(dāng)0.1 mol/L磷酸二氫鉀緩沖溶液-乙腈溶液為4∶1時(shí)，阿托品的提取回收率最高，沉淀蛋白等雜質(zhì)的效果好，共萃物較少。因此，選用0.1 mol/L磷酸二氫鉀緩沖溶液-乙腈溶液(4∶1)作為提取溶劑。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

分別以乙腈-水、甲醇-水作為流動(dòng)相，考察對(duì)目標(biāo)化合物離子化程度的影響。結(jié)果表明，以乙腈-水作為流動(dòng)相時(shí)，阿托品的響應(yīng)值明顯高于流動(dòng)相為甲醇-水時(shí)的響應(yīng)值。因此，選用乙腈-水作為流動(dòng)相。

目標(biāo)化合物的離子化效率還會(huì)受到流動(dòng)相中加入的添加劑影響[10]。比較在水相中分別加入0.1%甲酸、5 mmol/L乙酸銨對(duì)目標(biāo)化合物離子化效率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在流動(dòng)相中加入少量甲酸有利于目標(biāo)化合物的離子化，能促進(jìn)生成[M+H]+離子，提高了阿托品的響應(yīng)值和檢測(cè)靈敏度。因此，試驗(yàn)采用乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相，梯度洗脫。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

使用1.0 μg/mL阿托品標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，分別在ESI+、ESI-的模式下進(jìn)行全掃描，掃描發(fā)現(xiàn)在正離子模式下，阿托品的靈敏度更高，因此，選擇擇正離子模式，m/z 290.1作為阿托品測(cè)定的母離子。采用SIM掃描方式，優(yōu)化出最佳碎裂電壓，100 V條件下，阿托品母離子的響應(yīng)最高。再采用Product Ion掃描方式，阿托品經(jīng)碰撞后產(chǎn)生的碎片離子有m/z 93.0 和m/z 124.0，其中m/z 124.0相對(duì)豐度最高，作為定量離子，m/z 93.0作為定性離子。最后，優(yōu)化出子離子的最佳碰撞能量，得到表1所示的質(zhì)譜參數(shù)。最終優(yōu)化了質(zhì)譜條件，得到如圖1所示的阿托品標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖，如圖2所示的陽性樣品和陰性樣品的總離子流TIC圖。

圖1 阿托品的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)色譜圖

Fig.1 MRM Chromatograms of Atropine

圖2 樣品的總離子流(TIC)色譜圖

2.4 線性范圍

本文采用基質(zhì)匹配外標(biāo)法定量，以消除基質(zhì)干擾，提高定量準(zhǔn)確性。按照1.4配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線，以阿托品的質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，色譜峰面積(y)為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線。結(jié)果表明，阿托品在0.10～5.0 ng/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性回歸方程為Y=78036X-2015.2，相關(guān)系數(shù)r≥0.999，具有良好的線性關(guān)系，表明該方法適用于牛肉中阿托品的定量分析。

2.5 檢出限和定量限

阿托品的檢出限為0.5 μg/kg(信噪比S/N=3)，定量限為1.5 μg/kg(信噪比S/N=10)。

2.6 回收率和精密度

準(zhǔn)確稱取3份空白樣品，每份5.0 g，加入阿托品標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加量為1.0、5.0、10 μg/kg，按照1.3方法進(jìn)行樣品處理。每個(gè)添加水平測(cè)定6次，考察方法的精密度。從表2可以看出，在1.0、5.0和10 μg/kg這3種加標(biāo)水平下目標(biāo)化合物的平均回收率為89.5%～95.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD6)為2.07%～5.03%，表明方法的準(zhǔn)確度和重復(fù)性較好，可滿足日常分析要求。

表2 阿托品的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

3 結(jié)論

本文建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定牛肉中阿托品殘留量的分析方法，樣品用0.1 mol/L磷酸二氫鉀緩沖溶液-乙腈(4∶1)溶液提取，基質(zhì)匹配外標(biāo)法定量，降低了基質(zhì)干擾，提高了分析靈敏度。該方法樣品前處理操作簡(jiǎn)單，靈敏度高、回收率和重現(xiàn)性良好、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于檢測(cè)牛肉中阿托品的殘留量，為注水牛肉的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)提供技術(shù)手段支持。