國標微生物法與試劑盒法檢測維生素膠囊葉酸含量的比對

陳敏兒，黃啟紅，熊 娟，伍玲燕，黃璇瑩，張云龍，周小游

(廣東省測試分析研究所，廣東 廣州 510000)

1 原理

葉酸 (Folic Acid)是人體必需的維生素之一，可以促進骨髓中幼細胞成熟,人體若缺乏葉酸可引起貧血、腸胃功能紊亂、智力下降等問題，補充過量又會干擾人體鋅代謝，增加下一代患自閉癥的風險等情況出現(xiàn)。因而對于維生素補充劑的葉酸含量的檢測監(jiān)測十分重要。國標法(GB 5009.211-2014)原理是利用鼠李糖乳桿菌Lactobacillusrhamnosus對葉酸的特異性,在一定控制條件下將菌液接種至含有試樣液的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)一段時間后測定吸光度根據(jù)葉酸含量與吸光度的標準曲線計算出樣品中葉酸的含量。試劑盒法是將試樣液和葉酸檢測培養(yǎng)基加入預包被有Lactobacillusrhamnosus的微孔中，Lactobacillusrhamnosus的生長狀況取決于葉酸的含量。添加葉酸作為標準或者作為樣品混合物，細菌會一直生長直至葉酸被消耗殆盡。

本文采用兩種方法對3種維生素膠囊中葉酸含量檢測,對比兩種方法的差異性。試驗方案及結果如下。

2 試劑、設備與方法

2.1 試劑

乙醇(廣州化學試劑廠)；氫氧化鈉(廣州化學試劑廠)；葉酸測定培養(yǎng)基(北京陸橋)；微生物法定量檢測葉酸試劑盒(VitaFast)；磷酸二氫鈉(廣州化學試劑廠)；抗壞血酸(廣州化學試劑廠)；葉酸標準品(中國食品藥品檢定研究院)；0.22 μm無菌過濾器(Sartorius Stedim)。

2.2 儀器和設備

KQ-800型超聲波清洗器(昆山超聲儀器)；1900培養(yǎng)箱(BioCELL)；WTS-2000紫外分光光度計(上海慧多)；HWS26型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒)；BSC-1000ⅡA2生物安全柜(蘇凈安泰)； 800TS酶標檢測儀(Biotek)；JJ200B電子天平(G&G)。

2.3 方法

2.3.1 國標法(GB 5009.211-2014)

2.3.1.1 樣品制備

準確稱取0.5 g維生素膠囊內(nèi)容物到100 mL錐形瓶中，加入80 mL氫氧化鈉乙醇溶液，具塞，超聲2～4 h至樣品完全溶解或分散，用水定容至刻度。根據(jù)樣品中葉酸含量對提取液進行適當稀釋。

2.3.1.2 標準品溶液制備

取試管依表1分別加入葉酸標準工作溶液(0.2 ng/mL)和無菌水，再加入5.0 mL葉酸測定用培養(yǎng)液，混勻。

表1 標準曲線溶液制備(國標法)

2.3.1.3 培養(yǎng)基制備

依照標準將葉酸測定培養(yǎng)基與葉酸標準工作液或樣品稀釋液混勻，加塞，高壓滅菌。

2.3.1.4 培養(yǎng)

待測定系列管冷卻至室溫后，在無菌操作條件下，用滅菌的移液管分別加20 μL接種液，混勻，加塞，在 37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)20～40 h，直至獲得最大混濁度。另準備一支S1管不接種作為0對照管。

2.3.1.5 測定

將培養(yǎng)后的測定系列管混勻，用1 cm厚度的比色杯，波長540 nm，以0對照管調(diào)節(jié)吸光度值為0，依次測定標準系列管和樣品系列管的吸光度值。若有以下情況時，說明存在污染，需重做試驗：

0對照管有明顯細菌增長，混濁；

與0對照管相比，標準0管吸光度值在0.1以上；

標準系列管吸光度值最大變化量<0.4。

2.3.1.6 結果計算

標準曲線：以標準系列管葉酸含量為橫坐標，每個標準點的吸光度值平均值為縱坐標，繪制標準曲線。

樣品結果計算：從標準曲線查得樣品系列管的葉酸對應含量，按公式計算結果(詳見標準)。

2.3.2 試劑盒法

2.3.2.1 樣品制備

稱取1 g維生素膠囊內(nèi)容物到500 mL離心管中，加入約400 mL磷酸鹽緩沖液(7.8 g磷酸二氫鈉和1 g抗壞血酸鈉溶解于1L蒸餾水中，校正pH值至7.2；每天新配緩沖液)，搖勻。95℃水浴提取30 min，其間振蕩至少5次，迅速冷卻到30℃以下。將提取溶液全部加入到1000 mL容量瓶中，用無菌水準確定容至刻度。取1 mL溶液至一個50 mL無菌試管中，加無菌水精確至40 mL。然后搖勻，無菌過濾，根據(jù)濃度范圍，確定是否在1.5 mL(或2.0 mL)無菌試管中進一步稀釋。

2.3.2.2 標準品溶液制備

打開試劑盒中的葉酸標準品瓶，添加X mL(X=詳見標準品瓶)無菌水(取自試劑盒)至標準品瓶中。蓋上標準品瓶蓋，搖勻稀釋=標準品濃縮液。取6個無菌管(1.5～2.0 mL)，并按照表2準備標準品溶液。

表2 標準曲線溶液制備(試劑盒法)

注：*樣品提取稀釋倍數(shù) 1∶40 已經(jīng)包含在標準曲線中。

2.3.2.3 培養(yǎng)基制備

取出試劑盒中的培養(yǎng)基，打開瓶蓋用鑷子取出干燥劑，加入10 mL無菌水(取自試劑盒)至葉酸培養(yǎng)基瓶中，加入1 mL葉酸緩沖液至培養(yǎng)基瓶。蓋好培養(yǎng)基瓶，搖勻。水浴加熱該瓶至95℃保持5 min，其間振蕩至少2次，并確保瓶子封閉。迅速冷卻至室溫。使用0.22 μm無菌濾膜過濾培養(yǎng)基至15 mL無菌離心管中。

2.3.2.4 培養(yǎng)

微孔板實驗中必須使用無菌水稀釋的無菌樣品，無菌水取自試劑盒。

移液器先移取培養(yǎng)基，之后標準品或稀釋的樣品，如下：

-移取150 μL葉酸培養(yǎng)基至微孔中。

-移取150 μL標準品或稀釋的樣品至指定的微孔中(用標準品或樣品溶液沖洗移液器尖)。

-用粘合箔蓋住板條或微孔，用手將粘合箔平壓，使其充分封閉微孔板條。

-在 37℃黑暗條件下孵育44～48 h。

2.3.2.5 測定

再次壓緊粘合箔，將微孔板翻置在桌面上，在桌面平面上振蕩，使微生物溶解在培養(yǎng)基中。

將微孔板翻回如前置于桌面上，從右上角開始以對角線方向180°角輕扯下粘合箔，與此同時務必用另一只手按住放置在桌面上的微孔板，以防止因粘合箔與微孔板粘合過緊而在撕扯時帶起微孔板。破壞微孔中液體表面的所有泡沫(可以用移液管尖或針狀物)。

用酶標儀610～630 nm(或540～550 nm)條件下讀取吸光度。

判定檢測結果有效：

-OD空白值

-OD標準5>0.6 OD。

2.3.2.6 計算結果

計算結果時使用拜發(fā)公司提供的配套的RIDA?SOFT Win軟件。

樣品稀釋倍數(shù)40已經(jīng)包括在標準曲線中。在下面的公式中，只需要考慮提取的進一步稀釋倍數(shù)及不同的樣品重量。

3 結果比對

3.1 標準曲線

兩個方法均是以葉酸含量為橫坐標，吸光度值平均值為縱坐標，繪制標準曲線。國標法(GB 5009.211-2014)試驗標準曲線采用EXCEL軟件繪制多項式曲線，曲線及方程如圖1，決定系數(shù)R2=0.998；試劑盒法試驗標準曲線采用RIDA?SOFT Win軟件生成，如圖2，相關系數(shù)=0.9995。

圖1 標準曲線(國標法)

圖2 標準曲線(試劑盒法)

3.2 結果重復性

選取3種已知葉酸含量范圍的維生素膠囊A、B、C，取膠囊內(nèi)容物依2.3.1.1和2.3.2.1分別平行制備6份樣品溶液，測定樣品溶液中葉酸的濃度，以所得的樣品中葉酸的濃度來計算RSD，RSD應≤4%。

所得結果如表3。

表3 兩種方法試驗結果重復性比對

3.3 加標回收率

取維生素膠囊A、B、C的內(nèi)容物各12份，每6份同一樣品為一組，分為Ⅰ、Ⅱ組。Ⅰ組按國標法測試，Ⅱ組按試劑盒法測試。

AⅠ組：6份樣品均同法處理，方法為：于樣品中加入161 μg葉酸標準品(配制濃度為1.009 mg/mL的葉酸標準品溶液，加入此溶液160 μL，即加入相當于161 μg葉酸對照品)，搖勻，依2.3.1.1處理，作為供試品溶液A。按2.3.1所述測試，計算回收率和RSD。

AⅡ組：6份樣品均同法處理，方法為：于樣品中加入283 μg葉酸標準品(配制濃度為1.009 mg/mL的葉酸標準品溶液，加入此溶液280 μL，即加入相當于283 μg葉酸對照品)，搖勻，依2.3.2.1處理，作為供試品溶液B。按2.3.2所述測定，計算回收率和RSD。

BⅠ組：6份樣品均同法處理，方法為：于樣品中加入151 μg葉酸標準品(配制濃度為1.009 mg/mL的葉酸標準品溶液，加入此溶液150 μL，即加入相當于151 μg葉酸對照品)，搖勻，依2.3.1.1處理，作為供試品溶液A。按2.3.1所述測試，計算回收率和RSD。

BⅡ組：6份樣品均同法處理，方法為：于樣品中加入212 μg葉酸標準品(配制濃度為1.009 mg/mL的葉酸標準品溶液，加入此溶液210 μL，即加入相當于212 μg葉酸對照品)，搖勻，依2.3.2.1處理，作為供試品溶液B。按2.3.2所述測定，計算回收率和RSD。

CⅠ組：6份樣品均同法處理，方法為：于樣品中加入60.5 μg葉酸標準品(配制濃度為1.009 mg/mL的葉酸標準品溶液，加入此溶液60 μL，即加入相當于60.5 μg葉酸對照品)，搖勻，依2.3.1.1處理，作為供試品溶液A。按2.3.1所述測試，計算回收率和RSD。

CⅡ組：6份樣品均同法處理，方法為：于樣品中加入111 μg葉酸標準品(配制濃度為1.009 mg/mL的葉酸標準品溶液，加入此溶液110 μL，即加入相當于111 μg葉酸對照品)，搖勻，依2.3.2.1處理，作為供試品溶液B。按2.3.2所述測定，計算回收率和RSD。

回收率應為85%～110%，RSD應≤4%。

備注：

樣品所含葉酸質(zhì)量=樣品依對應的測試方法測得的葉酸平均值(見表5)×取樣量(g)

測得加入葉酸質(zhì)量=測得總葉酸質(zhì)量-樣品所含葉酸質(zhì)量

回收率=測得加入葉酸的質(zhì)量÷加入葉酸的質(zhì)量×100%

所得結果如表4。

表4 兩種方法加標回收率測試結果

4 結論

在本次針對維生素膠囊葉酸含量的方法比對中，從測試結果可看出，國標法和試劑盒法的重復性均良好，相對標準偏差(RSD)均≤4%。在精密度上，國標法的回收率在100%～105%，RSD在2%～4%，符合要求(回收率85%～110%，RSD≤4%)；試劑盒法AⅡ、CⅡ組符合要求，BⅡ組回收率僅78.5%，RSD>4%，超出要求范圍；Ⅰ組(國標法)的回收率均高于Ⅱ組(試劑盒法)。結果顯示，國標法比試劑盒法更適合檢測維生素膠囊葉酸含量。

結合實驗過程的觀察(維生素膠囊B內(nèi)容物按試劑盒法制備的樣品液溶解情況較差)，推測可能是國標法的樣品制備方法相比試劑盒法的樣品制備方法更適合該膠囊。

此外，在實驗過程中，試劑盒法相比國標法，無需活化菌種，培養(yǎng)基用量少，步驟簡單，污染概率低，是比較方便快捷的微生物法；國標法從菌種活化到測吸光度值所需時間周期長，易受雜菌或雜質(zhì)影響?；蚩蓢L試將國標法的樣品制備法與試劑盒法結合測試。

本次比對國標法試驗中，采用帶蓋的一次性試管，發(fā)現(xiàn)比使用重復使用的玻璃試管測試結果更穩(wěn)定，污染概率大大降低。