仙鶴草中鞣質(zhì)類成分的提取分離鑒定實驗

孟凡恒，李佳佳，董興童，李書凝

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；3.山東中醫(yī)藥大學(xué) 理工學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355)

仙鶴草是薔薇科、龍芽草屬多年生草本植物。其性味苦，澀，平；歸心、肝經(jīng)；具有收斂止血，截瘧，止痢，解毒，補(bǔ)虛的功效[1]?，F(xiàn)代研究證明鞣質(zhì)類成分是仙鶴草的主要有效成分之一[2]，本實驗擬采用溶劑提取法中的乙醇減壓回流提取法獲得仙鶴草的乙醇提取物，再綜合運用層析法對目標(biāo)化合物進(jìn)行富集、分離，應(yīng)用化學(xué)方法和高效液相法進(jìn)行鑒定。

1 實驗儀器與試劑

DFY-500型 500 g 搖擺式高速中藥粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)，BS 214D 型1/1 萬分析電子天平(北京 Sartorius公司)，BT 25S 型1/10 萬分析電子天平(北京Sartorius公司)，SZCL-2-5000 mL型磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)，層析柱(30×500 mm)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)，高效液相色譜儀(品牌：島津；型號：LC-10ATVP)。

仙鶴草(北京同仁堂亳州飲片有限責(zé)任公司，產(chǎn)品批號：701002013)經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院李慧芬副教授鑒定該飲片為薔薇科植物龍芽草屬仙鶴草Agrimonia pilosa Ledeb.的全草，沒食子酸對照品(上海源葉生物科技有限公司，產(chǎn)品批號：YN1105MA14)，丹寧酸對照品(上海源葉生物科技有限公司，產(chǎn)品批號：20180529)，NKA-9型大孔樹脂(上海源葉生物科技有限公司)，硅膠(青島海洋化工有限公司)，CMC-Na(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，乙醇，苯，乙酸乙酯，甲酸，甲醇(色譜純，其余均為分析純)。

2 實驗步驟

2.1 仙鶴草有效成分鞣質(zhì)的提取

2.1.1 仙鶴草乙醇提取物的制備

將原飲片仙鶴草用中藥粉碎機(jī)粉碎，得到粒徑大小為2～4 mm的藥品顆粒，使其與乙醇試劑充分接觸反應(yīng)，取粉碎后的藥品200 g，置5000 mL圓底燒瓶中，加入90%乙醇1000 mL浸泡3 d，溫度控制在45～50℃條件下減壓回流提取2 h[3]，抽濾分離藥渣和提取液，棄去藥渣。將提取液倒入圓底燒瓶，在48℃條件下減壓回收乙醇，回收至提取液剩余約80 mL，抽濾去除難溶于水的雜質(zhì)，濾液自然冷卻后加蒸餾水稀釋至300 mL密封保存?zhèn)溆?，得仙鶴草的乙醇提取物，記為試劑A。

2.1.2 仙鶴草乙醇提取物的定性分析

分別取試劑A1mL于兩個試管中，記為試管m、n，試管m中滴加4%明膠水溶液，出現(xiàn)沉淀，證明濾液中含有鞣質(zhì)；試管n滴加2～3滴3%三氯化鐵溶液，溶液變?yōu)樯钏{(lán)色，證明溶液中含有鄰三酚羥基化合物，存在水解鞣質(zhì)和沒食子兒茶酸縮合鞣質(zhì)[3]。

2.2 仙鶴草乙醇提取物成分的分離

取200 mL試劑A，分別用1000 mL60%乙醇溶液、1000 mL70%乙醇溶液、1000 mL80%乙醇溶液在NK-9型大孔樹脂中進(jìn)行梯度洗脫，分別得到樣品1、樣品2、樣品3，用3%三氯化鐵溶液進(jìn)行成分鑒別反應(yīng)，樣品1顯陽性，樣品2和樣品3顯陰性。

采用濕法裝柱，濕法上樣，用硅膠色譜柱對樣品1內(nèi)的成分進(jìn)行進(jìn)一步分離提取，用5倍樣品體積60%乙醇溶液進(jìn)行洗脫，得到樣品4、樣品5、樣品6、樣品7，即為供試溶液。

2.3 仙鶴草乙醇提取物的色譜檢識

2.3.1 薄層層析法檢測鞣質(zhì)類成分

2.3.1.1供試品與對照品的制備

供試品：取試劑A1mL于試管中，記為P。

對照品：精密量取對照品沒食子酸0.00700 g，置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得各自的對照品溶液，記為Q，沒食子酸對照品：0.700 mg/mL。

2.3.1.2薄層層析方法

展開板硅膠G加 0.6% CMC-Na，手工制板，晾干，105℃活化 1 h。點樣：P、Q。展開劑∶V(苯)∶V(乙酸乙酯)∶V(甲酸)=80∶50∶8。展開方式為臥式上行[4]。

2.3.1.3薄層層析結(jié)果

經(jīng)薄層展開后，置254 nm紫外燈下檢視 ,沒食子酸斑點顯藍(lán)紫色熒光。噴醋酸-亞硝酸鈉-氫氧化鈉顯色劑 ,沒食子酸斑點顯亮黃綠色。說明供試品中含有可水解鞣質(zhì)。

2.3.2 高效液相法檢測仙鶴草乙醇提取物

2.3.2.1對照品溶液的制備

精密量取對照品沒食子酸0.00350 g，丹寧酸0.00391 g，分別置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得各自的對照品溶液，沒食子酸對照品：0.350 mg/mL，丹寧酸對照品：0.391 mg/mL。

2.3.2.2色譜條件

流動相：60%甲醇，流速：1.0 mL/min，進(jìn)樣量：40 μL，柱溫：30℃，檢測波長：210 nm。得到波譜數(shù)據(jù)見圖1～5以及表1～4。

圖1 沒食子酸對照品的高效液相色譜圖

圖2 丹寧酸對照品的高效液相色譜圖

峰號試劑保留時間/min峰高峰面積含量/%0000沒食子酸對照品4.107688218.125144005181000001丹寧酸對照品3.573144980.0781662021.75100

表2 樣品4的HPLC分析結(jié)果

圖3 樣品4高效液相色譜圖

圖4 樣品5高效液相色譜圖

圖5 樣品6高效液相色譜圖

2.4 最低檢出限的測定

配制系列不同濃度的丹寧酸對照品溶液，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，信噪比S/N約為3時，檢出限為30 μg/mL。

2.5 精密度實驗

取同一份丹寧酸與沒食子酸混合對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定每次對照品溶液的峰面積，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)為1.86%、1.44%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性實驗

取6份樣品4分別進(jìn)樣分析，結(jié)果顯示峰1，2，3峰面積RSD(n=6)分別為1.33%、1.90%、1.45%，表明儀器的重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性實驗

取樣品4每隔4 h進(jìn)樣分析，結(jié)果顯示峰1，2，3峰面積RSD(n=6)分別為1.97%、1.49%、1.77%，表明儀器的穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率實驗

精密稱取仙鶴草粉末10 g，如上述步驟進(jìn)行提取，向提取液中加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)品，測得加樣回收率為95.69%，RSD值為1.72%。

3 小結(jié)

仙鶴草單方或復(fù)方對治療內(nèi)外婦兒科等疾病都有著較好的療效,值得臨床推廣。然而，目前對仙鶴草的作用機(jī)制尚不清楚，研究分析不夠深入，在應(yīng)用方面局限于皮革食品和某些金屬工業(yè)領(lǐng)域[5]，且仙鶴草臨床研究的病例也太少，多為經(jīng)驗方，缺乏嚴(yán)格系統(tǒng)得臨床觀察和統(tǒng)一的診療標(biāo)準(zhǔn)[6]。本文所述實驗研究采用乙醇減壓回流提取法獲得仙鶴草的乙醇提取物，再運用大孔樹脂與硅膠層析法對鞣質(zhì)進(jìn)行富集、分離，通過薄層色譜與鑒別反應(yīng)追蹤目標(biāo)化合物，再利用高效液相進(jìn)行進(jìn)一步分析鑒定，根據(jù)結(jié)果分析，用乙醇提取出鞣質(zhì)，15倍量的60%乙醇可以洗脫出鞣質(zhì)，樣品6的峰5為鞣質(zhì)，重復(fù)性精密性較好，且方法簡便，容易操作，為仙鶴草乙醇提取物中鞣質(zhì)的研究提供了一定的借鑒意義。

4 討論

鞣質(zhì)，又稱丹寧，是存在于植物體內(nèi)的一類結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的多元酚類化合物，為黃色或棕黃色無定形松散粉末，在空氣中被氧化顏色逐漸變深，有強(qiáng)吸濕性，因此實驗過程中應(yīng)盡量控制提取物與空氣的接觸時間，為避免提取時糊底，粒徑控制在2～4 mm；鞣質(zhì)溫度過高不穩(wěn)定，故溫度控制在50℃以下，樣品7濃度低于檢出限，未檢出波譜數(shù)據(jù)；但檢出的鞣質(zhì)含量較小，50%乙醇洗脫可能得到更高濃度的鞣質(zhì)；本實驗研究仙鶴草全草中鞣質(zhì)的含量，可以進(jìn)行不同部位的含量研究，從而確定有效部位。