臭氧水對土柱土壤生物化學性狀的影響

魏俊杰， 洪堅平

(山西農業(yè)大學， 山西 晉中 030801)

土壤中存在一部分不利于作物生長，使作物發(fā)病受害的微生物，人們將由這類土傳病原微生物引起的作物病害統(tǒng)稱為土傳病害[1]。由于土傳病害造成的作物減產達20%～30%，嚴重的地區(qū)達50%以上，甚至絕收[2]，故消除土傳病害并維持土壤健康可持續(xù)利用已成為農業(yè)發(fā)展亟待解決的難題之一。

目前，國內外采取消除土傳病蟲害的措施主要有高溫悶棚、培育抗病性強的作物品種、采用生物熏蒸技術和強氧化還原法等[3-5]，以上方法在治理土傳病害方面均已取得成效，但每種方法有其適用性但也有局限性。

臭氧是氧氣的同素異形體[6]，是一種強氧化劑，最早應用于倉儲害蟲的防治[7-8]，其具有高效的殺菌作用，且對微生物的殺菌作用也高效快速[9-11]。研究表明，臭氧可以迅速殺滅微生物，然后分解產生氧氣，既無毒無害又不產生任何污染與殘留，因此被視為理想的綠色強氧化劑[12]。

目前，國內外對臭氧水的研究愈發(fā)增多，且已開始將臭氧應用于農業(yè)生產中。已有研究表明，澆灌臭氧水對韭菜地下害蟲韭菜遲眼蕈蚊有顯著防治效果[13-16]。田苗等[17]指出，在室溫條件下，臭氧水濃度為0.43 mg/L時，可將植物中的大腸桿菌全部殺死。STRICKLAND等[18]用臭氧水處理水果沙拉后發(fā)現(xiàn)，產品保質期得到明顯延長，從而降低了損耗成本。WEI等[19]在對木瓜進行臭氧處理后，得到臭氧處理能明顯降低木瓜營養(yǎng)價值流失的結論。目前關于臭氧水對土壤影響的研究較少，吳啟佳等[20]發(fā)現(xiàn)臭氧水對土壤有機質、總氮和速效養(yǎng)分含量有著顯著的降低作用。荊世杰等[21]研究臭氧對溫室土壤0～15 cm土壤理化性質的影響中指出，臭氧水處理后的土壤有機質、銨態(tài)氮含量顯著下降。由于臭氧的強氧化性，其對土壤的主要成分理化性質的影響還鮮有報道[22]。為此，筆者等以臭氧水處理后的試驗柱土壤為研究對象，探究臭氧水處理土壤不同深度和不同時間的農田土壤微生物量以及養(yǎng)分含量的變化，以期為治理土傳病害提供科學依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 供試材料

供試臭氧水：室溫下，將臭氧氣體快速溶于蒸餾水中制取濃度為28 mg/L 的臭氧水，臭氧氣體由山西中通高技術科技有限責任公司利用OZU-AP-300型臭氧機組制取。

供試土壤：太谷農田土，取自山西農業(yè)大學資源環(huán)境學院試驗站(東經112.6°，北緯37.4°)，屬黃土狀石灰性褐土，質地為輕壤，新鮮土壤初始含水量為9%。

儀器：蒸汽滅菌器(上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司)，光照培養(yǎng)箱(杭州惠爾儀器股份有限公司)、水浴恒溫振蕩器：SHZ-88型、火焰光度計：FP6400A型、訂制土柱

1.2 試驗設計

在山西農業(yè)大學資源環(huán)境學院試驗的試驗地中，用自制土柱取樣器(圖1)取原狀土40 cm，然后立即密封底部及小孔。根據(jù)預試驗的簡易模擬，試驗所用濃度為28 mg/L的臭氧水300 mL能使半徑1.7 cm、高40 cm的的土柱飽和，因此在土柱中注入臭氧水2 L，在30 cm處達到均勻性飽和。以澆灌2 L蒸餾水的自制土柱為對照 ，土柱灌水后立即將土柱密封。

1.2.1 不同處理時間的土壤微生物量和養(yǎng)分含量考察 在微生物量的考察上，試驗設置6個處理，分別為臭氧水處理1 h、3 h、5 h、7 h、9 h和11 h；在養(yǎng)分含量的考察上設置4個處理，分別為臭氧水處理1 h、5 h、10 h和24 h，各處理3次重復，取平均值。在臭氧水處理后，按照試驗處理的時間，用消毒殺菌后的不銹鋼取土器從土柱深度10 cm、20 cm、30 cm處采集2 g土樣，然后將所采土樣混合并分為2份，

圖1 自制取樣土柱

1份微生物培養(yǎng)并測定土壤微生物量及滅火率，1份放入—4℃冰箱冷凍保存24 h后取出，風干測定含水量，然后過20目篩測定土壤速效磷、速效鉀，最后過100目篩測定土壤有機質。

1.2.2 不同深度土壤微生物量和養(yǎng)分含量考察 不同深度土壤共設3個處理，分別為10 cm、20 cm和30 cm，每個處理3次重復，取平均值。在臭氧水處理24 h后，用消毒殺菌后的不銹鋼取土器插入10 cm、20 cm、30 cm層土壤的對應小孔采集土樣，每層隨機采集5個樣品，將所采土樣分為2份，1份土樣進行微生物培養(yǎng)并測定土壤微生物量及滅火率，1份混合土樣放入—4℃冰箱冷凍保存24 h后取出，風干測定含水量，然后過20目篩測定土壤速效磷、速效鉀，最后過100目篩測定土壤有機質。

1.3 考察指標的測定

土壤微生物數(shù)量測定采用稀釋平板計數(shù)法對細菌、真菌、放線菌進行計數(shù)，以對照土樣菌落數(shù)為基數(shù)計算滅活率。土壤中硝態(tài)氮采用酚二磺酸比色法[23]，堿解氮采用堿解擴散法[23]，銨態(tài)氮采用KCl浸提，靛酚藍比色法[23-24]進行測定。土壤有機質采用重鉻酸鉀容量法—外加熱法進行測定，土壤速效磷采用0.5 mol/L NaHCO3浸提法提取，鉬銻抗比色法[23]進行測定，土壤速效鉀采用1 mol/L NH4OAC浸提法提取，火焰光度法[23]進行測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

應用Excel 軟件，計算各處理的平均值及標準偏差，并繪圖。通過Spss 軟件，運用LSD 法進行(P<0.05)多重比較顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 臭氧水處理不同時間對柱狀土壤微生物及養(yǎng)分含量的影響

2.1.1 土壤微生物量 從表1可知，臭氧水處理不同時間土柱中細菌、真菌和放線菌的菌落數(shù)變化及滅活率。

1) 細菌。臭氧水處理土壤后，土壤中細菌菌落數(shù)量顯著降低，臭氧水處理1 h的細菌滅活率最高，為93.28%，且在其余處理時間內,其滅活率均在80%以上，說明臭氧水在一定時間內能顯著減少土壤中的細菌數(shù)量。臭氧水處理后細菌菌落數(shù)量表現(xiàn)為先升高后下降再升高的趨勢，這可能與取樣時間長短以及不規(guī)范操作有關，導致細菌繁殖規(guī)律出現(xiàn)一定偏差。

表1臭氧水不同處理時間土柱土壤中的微生物菌落數(shù)及滅活率

Table 1 Colony count and inactivation ratio of microorganism in soil samples treated with ozone water under different treatment time

處理時間/hTreatment time菌落數(shù)/(105CFU/g) Colony count細菌真菌放線菌滅活率/% Inactivation ratio細菌真菌放線菌0(處理前)804±81 a184±28 a215±24 a000 154±16 e16±8 d44±10 d93.2891.3079.64376±25 d18±4 d55±15 c90.5590.2274.235157±49 b18±8 d 58±7 c80.4790.2273.207115±32 c28±12 c61±17 c85.7084.7871.62989±31 d 30±16 c80±10 b88.9383.7062.7411101±48 d42±21 b81±15 b87.4377.1762.37

注：表中同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

Note: Different lowercase letters in the same column indicate significance of difference atP<0.05 level. The same below.

2) 真菌。臭氧水處理土壤后，土壤中真菌菌落數(shù)量顯著降低，真菌的滅活率在臭氧水處理1 h時為91.30%,且在其余處理時間內維持在77%以上，說明臭氧水能顯著減少土壤中的真菌數(shù)。此外，真菌菌落數(shù)隨著時間的延長而緩慢增加，這是由于臭氧水半衰期較短，約為20 min，在其有效范圍內可能不能完全殺死真菌，臭氧水分解后，土壤中殘存的真菌進行繁殖，導致數(shù)目增多。

3) 放線菌。臭氧水處理土壤后，土壤中放線菌菌落數(shù)量顯著降低，放線菌的滅活率在臭氧水處理1 h時為79%,在其余處理時間維持在62%以上，說明臭氧水能顯著減少土壤中的放線菌數(shù)。放線菌的變化趨勢和真菌類似，其在臭氧水處理后1 h的滅活率達到最高，隨后逐漸降低，降低的原因可能是由于臭氧水分解后殘存的放線菌繼續(xù)繁殖。另外，放線菌滅活率遠低于細菌和真菌的殺菌效果，其原因可能是放線菌依靠孢子繁殖，孢子外有一層厚厚的孢子壁，能一定程度上抵擋臭氧水的強氧化，致使有相當一部分放線菌經臭氧水處理后存活。

2.1.2 土壤養(yǎng)分含量 從圖2可知，臭氧水處理不同時間土柱土壤中速效磷、速效鉀和有機質含量的變化。

1) 速效磷及速效鉀含量。臭氧水處理后1 h，速效磷含量上升幅度達9.4%，但與對照(蒸餾水)不顯著。此后，均呈下降趨勢，在1～5 h內速效磷含量顯著下降，此時含量低于初始值，5～10 h小幅回升，之后10～24 h內趨于平緩。整體而言，1～24 h 內速效磷含量與對照差異不顯著。1 h內速效鉀上升幅度約3.6%， 1～5 h內增加10.1%，與對照差異顯著，5～10 h內速效鉀含量下降約7.6%，但與對照差異不顯著，此后10～24 h內無變化，但與對照相比，有5.6%的提升。總而言之，臭氧水處理后的速效鉀含量均高于對照，但僅5 h時與對照差異顯著。

2) 有機質含量土壤有機質是土壤的重要組成部分，其含量是衡量土壤肥力的重要指標。經臭氧水處理的有機質含量與對照(蒸餾水)相比在1 h、5 h、10 h、24h顯著降低35.8%、41.6%、41.0%、42.8%。

圖2 臭氧不同處理時間土柱土壤的養(yǎng)分含量變化

2.2 臭氧水處理對不同深度土柱土壤微生物量及養(yǎng)分含量的影響

2.2.1 土壤微生物量 從表2可知，臭氧水處理24 h后不同深度土柱土壤細菌、真菌和放線菌的菌落數(shù)和滅活率。

1) 細菌菌落。臭氧水處理后，10 cm深度土壤的細菌菌落數(shù)量顯著下降，在20 cm及30 cm深度的細菌菌落數(shù)量下降不顯著。細菌在10 cm深度土壤的滅活率為33.27%，其后隨著深度的加深，滅活效果隨之降低，說明臭氧水對10 cm內的土壤滅活效果最好。

2) 真菌菌落。臭氧水處理后，10 cm深度土壤的真菌菌落數(shù)量顯著下降，在20 cm及30 cm深度真菌菌落數(shù)量下降不顯著。真菌在10 cm深度土壤滅活率為39.62%，其后隨著深度加深，滅活效果隨之降低，說明臭氧水對真菌的最佳施用范圍是深度10 cm內的土壤。

3) 放線菌菌落。臭氧水處理后，放線菌的菌落變化與細菌、真菌的菌落變化一致，在土深10 cm處滅活率最高，為28%。放線菌滅活率小于細菌、真菌，其原因可是放線菌依靠孢子繁殖，孢子外有一層厚厚的孢子壁，能一定程度上抵擋臭氧水的強氧化，致使有相當一部分放線菌經臭氧水處理后存活。

表2臭氧水處理前后不同深度土柱土壤中的微生物菌落數(shù)及滅活率

Table 2 Colony count and inactivation ratio of microorganism in soil samples with different soil depth before and after ozone water treatment

處理Treatment土層深度/cmSoil depth菌落數(shù)/(105CFU/g) Colony count細菌真菌放線菌平均滅活率/% Average inactivation ratio細菌真菌放線菌空白組CK102 026±206 a265±37 a430±46 a 201 586±158 c231±26 b319±55 b 302 037±228 b238±34 c338±26 d試驗組 Test group101 352±150 d160±25 d310±32 c33.2739.6227.91 201 421±89 c210±37 b270±29 e10.4010.0015.36 301 967±130 b225±40 c319±32 d3.435.465.62

2.2.2 土壤養(yǎng)分含量 從圖3可知臭氧水處理前后，不同深度土柱土壤中的養(yǎng)分含量變化。

1) 速效磷。臭氧水處理后速效磷含量降低，在土壤深度10 cm和20 cm的速效磷分別較對照降低39.1%和17.4%，在30 cm土層中，速效磷含量無變化，土壤深度20 cm和30 cm的速效磷含量與對照差異不顯著。10 cm土壤中速效磷含量降低幅度比20 cm高，是因為表層土壤中有機物質含量高，大量的有機陰離子使其在爭奪固相表面的專屬位點時占具優(yōu)勢，而臭氧水氧化有機質，使有機陰離子與磷酸根離子競爭專屬位點能力下降，導致土壤中吸附態(tài)磷含量增加，速效磷含量下降。

圖3 臭氧水處理前后不同深度土柱土壤的養(yǎng)分含量

2) 速效鉀。10 cm土層中，臭氧水處理使速效鉀含量顯著降低，降低55.9%， 20 cm土層速效鉀含量降低24.8%，與對照無顯著差異， 30 cm土層經臭氧水處理后，速效鉀含量無明顯變化。

3) 有機質。臭氧水處理后，不同深度土壤有機質含量均顯著降低，土層10 cm、20 cm和30 cm土層土壤的降幅分別為38.8%、43.9%和36.4%。

3 結論與討論

試驗表明，在臭氧水處理后1 h的細菌、真菌、放線菌滅活率分別為93.25%、91.38%和79.65%，并且在其余處理時間內3種菌種的滅活率均在62%以上。雖然臭氧水能顯著減少土壤中細菌、真菌、放線菌的數(shù)量，但是隨著臭氧水分解，土壤微生物數(shù)量隨著時間延長而緩慢增加。

臭氧水處理24 h后，細菌、真菌、放線菌的滅活率隨著土壤深度的增加而降低，在10 cm深度的土壤細菌、真菌、放線菌的滅活率分別為33.27%、39.62%和28%，但隨著表層土柱土樣深度的增加而細菌、真菌、放線菌的滅活率顯著降低。

臭氧水澆灌后與對照(蒸餾水)相比，隨時間變化，土壤中的速效鉀含量整體上升，臭氧水處理5 h的速效鉀含量達到最大，比初始增加10.1%，而有機質含量顯著降低，但速效磷無明顯變化。臭氧水處理24 h后，在10 cm土層中，有機質、速效磷和速效鉀含量明顯降低，分別較對照降低38.8%、39.1%和55.9%，在20 cm和30 cm土層中，速效磷和速效鉀含量降低不明顯，有機質含量變化顯著，分別較對照降低43.9%和36.4%。

臭氧水處理土壤后，土壤微生物的菌落數(shù)趨勢大致為先銳減后慢慢升高，而造成這一現(xiàn)象的原因可能與土壤水分下滲速率以及臭氧水半衰期有關。由于目前科學界尚未對臭氧水在土壤中的下滲進行研究，故參考水在土壤中的下滲情況，從有關土壤水分入滲的研究[25]可以得知，水的初始入滲量快，經過一定時間后到達穩(wěn)定入滲，此時入滲率較慢。得出以下推測：在澆灌臭氧水后，開始時，臭氧水以較快速度滲入表層土壤，但當達到穩(wěn)定入滲后，由于臭氧水的半衰期僅為20 min，而其尚未下滲到深層土壤便已分解，故對下層土壤微生物影響較弱。

對于土壤養(yǎng)分含量，臭氧水處理后，速效磷含量與對照差異不顯著的結果與荊世杰等提出的速效磷含量顯著降低的結論不相符[21]?？赡苁怯捎诖嗽囼灣粞跛疂舛绕?，不足以將土壤中有機質氧化徹底，從而增加土壤中有機陰離子與磷酸根離子的競爭，使其吸附固定。土壤中鉀主要以速效鉀、緩效鉀和相對無效性鉀形態(tài)存在，它們之間存在動態(tài)平衡[24]。速效鉀含量在經臭氧水處理后，24 h內的含量均高于對照，可能由于臭氧水直接將土壤中的緩效鉀轉化為速效鉀，而速效鉀含量隨著土層的加深逐漸減少，在30 cm土層的變化不顯著，由此可知，臭氧水入滲過程降低速效鉀含量，這一結論與吳啟佳等研究結果相似，可能的原因： 1) 由于臭氧水處理使土壤氧化徹底，土壤速效鉀溶于水向下遷移；2) 土壤有機質含量下降，降低有機質中微量元素對鉀的吸附、鰲合，使其淋洗損失。經臭氧水處理的有機質含量與空白相比在24 h顯著降低，土層10 cm、20 cm和30 cm土層土壤的降幅分別為38.8%、43.9%和36.4%，表明臭氧水處理能顯著降低土壤有機質，使其礦化度提升。試驗結果表明，臭氧水處理土壤后，其強氧化性能殺死土壤微生物，可能殺死土傳病害的來源，減少設施農業(yè)土傳病害的發(fā)生，而且還調整了土壤養(yǎng)分含量，使土壤逐漸恢復健康、養(yǎng)分比例趨向合理。