秋水仙素對渥丹百合種子多倍體誘導(dǎo)的影響

王宇婷，張雅倩，楊青杰

(東北林業(yè)大學(xué) 園林學(xué)院， 黑龍江 哈爾濱 150040)

渥丹百合(LiliumconcolorSalisb.)屬百合科百合屬的多年生球根植物[1]，花呈直立、星狀開展，深紅色小型花朵、無斑點，是東北地區(qū)百合屬植物育種的優(yōu)良資源，因其具有觀賞價值高、適應(yīng)性強(qiáng)、耐寒等優(yōu)良特征，備受人們的青睞。渥丹百合同時還具有食用、藥用價值，亦可作香料。目前,未見渥丹百合在園林綠化及室內(nèi)裝飾方面的應(yīng)用研究報道，若經(jīng)過引種馴化和適當(dāng)篩選，其在園林應(yīng)用上將會是很好的材料，在未來培育適應(yīng)東北地區(qū)百合屬觀賞植物方面具有很大潛力。

多倍體育種具有多目標(biāo)性狀的綜合改良效果，對于新品種選育及育種工作的發(fā)展進(jìn)步具有重大意義[2]。有研究表明，經(jīng)秋水仙素誘變處理得到的百合植株大多數(shù)都屬于嵌合體，很容易恢復(fù)又突變?yōu)槎扼w植株[3]。因此，對于誘導(dǎo)獲得的變異植株必須要進(jìn)行多倍體鑒定，以確保其能夠具有穩(wěn)定的多倍性。李旦等[4]對野生紫斑百合的叢生芽進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)研究表明，用浸泡法對紫斑百合的叢生芽進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)時，以秋水仙素濃度為0.3%、浸泡處理12 h獲得的誘變效果最佳，并通過形態(tài)觀察、氣孔觀測和染色體壓片計數(shù)等方法鑒定了變異植株。目前，國內(nèi)有關(guān)于渥丹百合的研究僅限于居群的核型分析及Giemsa C-帶法的染色體分析[5-6]，其染色體誘導(dǎo)加倍方面的研究也僅有對誘導(dǎo)后植株個體的氣孔方面的描述[7]。為探究秋水仙素誘導(dǎo)渥丹百合加倍的最適條件，筆者等通過秋水仙堿誘導(dǎo)渥丹百合染色體加倍，并對誘變植株進(jìn)行鑒定，獲得染色體加倍的渥丹百合誘變個體和最佳誘導(dǎo)條件，旨在為渥丹百合的應(yīng)用及未來的育種研究奠定理論和實踐基礎(chǔ)，同時也可為北方地區(qū)的園林綠化提供新的素材。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為渥丹百合種子，購于吉林長春。試驗用試劑分別為秋水仙素、蒸餾水、堿性品紅、苯酚、70%酒精、冰醋酸、福爾馬林(38%甲醛溶液)、山梨醇、濃鹽酸和無水乙醇，均購于哈爾濱雨澤科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子處理 挑選飽滿成熟、胚呈棕黃色且完整的渥丹百合種子800粒，用濃度為2%的次氯酸鈉溶液漂洗15～20 min，再用清水漂洗15～20 min后備用。

1.2.2 秋水仙素誘導(dǎo) 于遮光條件下用電子天平秤取秋水仙素粉末放入燒杯，再用量筒量取蒸餾水加入燒杯，配制濃度為0(對照)、0.02%、0.05%、0.10%和0.15%的秋水仙素溶液各50 mL，分別移至5個燒瓶中，作好標(biāo)記，備用。將渥丹百合種子分成5組，每組160粒，分別浸泡在上述配置好溶液中。每個濃度梯度再分為4組，每組40粒，分別設(shè)置24 h、48 h、72 h、96 h浸泡處理時間。

1.2.3 處理種子培養(yǎng) 秋水仙素處理結(jié)束后將渥丹百合種子移至培養(yǎng)皿，放入模擬土壤環(huán)境的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～10 d，記錄種子發(fā)芽時間及數(shù)量，待種子長出強(qiáng)健粗壯的根毛后，移入花盆中進(jìn)一步培養(yǎng)。培養(yǎng)期間定期澆水，觀察試驗結(jié)果并拍照記錄種子生長狀況?；ㄅ柰僚渲疲簩⑷劳?、珍珠巖、蛭石以2∶1∶1的比例混合后滅菌處理，待混合土溫度降至20℃左右后置于花盆。

1.2.4 根尖壓片 待渥丹百合幼苗生長至葉片近完全展開后，取1～3 cm生長狀況良好的須根根尖，取樣時間為9:00、9:20、9:40、10:00。分別剪取根尖進(jìn)行預(yù)處理、固定、解離、漂洗、染色、制片。然后根據(jù)壓片情況，找出其在細(xì)胞中期附近的2個時間點，在此區(qū)間再設(shè)置4個時間梯度，重復(fù)上述過程，以明確最佳中期分裂取樣時間。預(yù)處理：將根尖清洗后置于4℃實驗室冰箱中低溫水浴保存24 h。固定：經(jīng)過預(yù)處理的根尖，用水洗凈后再用濾紙吸干表面水分。用卡諾固定液(無水乙醇∶冰醋酸為3∶1，現(xiàn)用現(xiàn)配)固定24 h后置于4℃實驗室專用冰箱中保存?zhèn)溆?。解離：取固定好的根尖置于小燒杯內(nèi)，加解離液(1 mol/L HCl溶液)后室溫處理6～8 min。漂洗：解離后用蒸餾水小心沖洗8～10 min。染色：將根尖放置于載玻片上，在根尖頂端部位截取2～3 mm的分生區(qū)，用濾紙吸干其表面的水分，然后滴加1滴卡寶品紅染液，分別染色10 min、15 min、20 min、25 min和30 min，根據(jù)觀察顯示的著色情況找出最適染色時間，染色后用45%的乙酸進(jìn)行分色1～2 min，再用濾紙吸去多余的染色液。壓片：用酒精燈外焰加熱1～2 s迅速移開[8]，如此反復(fù)4～5次后加蓋玻片。用帶有橡皮頭的鉛筆均勻用力壓片，直至材料呈霧狀后結(jié)束壓片。觀察：先在低倍鏡下(10×)找到渥丹百合分生區(qū)的細(xì)胞，然后換高倍鏡(40×)觀察。找出各處理組中明顯處于各分裂時期的細(xì)胞，并對染色體的形態(tài)進(jìn)行觀察，對細(xì)胞分裂中、后期的染色體進(jìn)行計數(shù)。若染色體形態(tài)清晰且處于分裂中、后期的細(xì)胞較多，則可將其制作成永久壓片標(biāo)本長期保存。

1.2.5 葉片的形態(tài)學(xué)鑒定 進(jìn)行染色體數(shù)目及形態(tài)鑒定后，確定所有的變異植株，繼續(xù)培養(yǎng)。同一試驗環(huán)境下相同生長階段，對標(biāo)記好的四倍體植株與二倍體植株的外部形態(tài)特征即葉片的長度、寬度、厚度等指標(biāo)進(jìn)行測定比較。

1.2.6 葉片的細(xì)胞學(xué)鑒定 待渥丹百合幼苗生長至一定階段，取相同生長狀態(tài)和相同數(shù)量的四倍體植株和二倍體植株葉片，取其中部進(jìn)行氣孔檢測。因為百合屬植物葉片中部的氣孔大小相對更為穩(wěn)定[9]，且該部位氣孔變化幅度不明顯。在顯微鏡物鏡為20×的視野下，隨機(jī)選擇20個視野的保衛(wèi)細(xì)胞，測量其長度、寬度并計算出平均值，統(tǒng)計氣孔密度。

1.3 測定項目

統(tǒng)計種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)(GI)、成活率、變異率及幼苗葉型指數(shù)。

發(fā)芽率=發(fā)芽種子數(shù)/種子總數(shù)×100%

發(fā)芽指數(shù)(GI)=∑(Gt/Dt)[10]

式中，Gt為在時間t天內(nèi)的發(fā)芽個數(shù)，Dt為t所代表的的天數(shù)。

成活率=可成長幼苗的種子數(shù)/種子總數(shù)×100%；

變異率=誘變?yōu)槎啾扼w的植物株數(shù)/處理的種子總數(shù)×100%。

葉型指數(shù)=葉片長度/葉片寬度。

2 結(jié)果與分析

2.1 秋水仙素對渥丹百合種子萌發(fā)的影響

在種子萌發(fā)的過程中，對照(無秋水仙素處理，清水浸泡)的種子最先出現(xiàn)萌發(fā)跡象，0.02%秋水仙素處理的次之，0.15%秋水仙素處理的萌發(fā)最慢。從表1看出，清水浸泡(對照)96 h的發(fā)芽率最高，為97.5%；0.15%秋水仙素處理48 h和96 h的發(fā)芽率最低，均低于50%?？傮w看，對照渥丹百合種子發(fā)芽率隨浸泡時間延長呈增高趨勢，秋水仙素處理的渥丹百合種子發(fā)芽率隨秋水仙素濃度升高，整體發(fā)芽水平逐漸降低。表明，秋水仙素對渥丹百合的種子的萌發(fā)有一定的抑制作用，且隨濃度增加，抑制作用越明顯。

表1 不同濃度秋水仙素處理渥丹百合種子的萌發(fā)情況

2.2 秋水仙素對渥丹百合胚根發(fā)育的影響

渥丹百合種子經(jīng)不同濃度的秋水仙素處理后，較對照處理(清水浸泡)其萌發(fā)出的胚根普遍明顯膨大(圖1)。經(jīng)秋水仙素處理的胚根大多呈淺綠色，而對照種子胚根大多呈乳白色。同時可觀察到，萌發(fā)后期秋水仙素處理的種子其根毛生長速度較對照緩慢。

注：A,B,C,D分別為浸泡24 h,48 h,72 h,96 h的處理組，橫向為種子生長時間，縱向為秋水仙素濃度。

Note: The seed-soaking hours of A, B, C and D treatments are 24 h, 48 h, 72 h and 96 h separately. The transverse direction is seed growth days. The longitudinal direction is colchicine concentration.

圖 1不同濃度秋水仙素處理渥丹百合種子的萌發(fā)過程

Fig.1 Germination process ofL.concolorseeds treated with different colchicine concentration

2.3 秋水仙素對渥丹百合幼苗成活率的影響

從表2看出，秋水仙素處理的渥丹百合幼苗的成活率普遍低于對照，表明，秋水仙素影響渥丹百合幼苗成活，且隨濃度增加影響越明顯。相同濃度秋水仙素處理條件下，不同處理時間之間成活率差異明顯，低濃度下隨處理時間延長成活率提高；而高濃度條件下，成活率隨處理時間延長而降低。

表2不同濃度秋水仙素處理渥丹百合幼苗的成活率

Table 2 Survival rates of seedlings germinated fromL.concolorseeds soaked in different colchicine concentration

秋水仙素/%ColchicineConcentration處理時間/hTreatment hours移栽數(shù)/個Number oftransplanted seedlings成活數(shù)/個Survival number成活率/%Survival rate0243636100.0048373594.59723838100.0096393897.440.0224352880.0048353085.7172343294.1296323093.750.0524342882.3548333090.9172312580.6596302480.000.1024262076.9248241875.0072231252.1796201155.000.1524241562.5048191368.4272261246.15 9619842.11

2.4 誘導(dǎo)處理后幼苗根尖倍性鑒定

普通渥丹百合為二倍體，其植株體細(xì)胞內(nèi)染色體數(shù)量為16～18條(圖2)，經(jīng)秋水仙素處理后成功誘導(dǎo)加倍，加倍后的幼苗根尖體細(xì)胞內(nèi)染色體數(shù)目增為原來的1倍左右，即獲得渥丹百合四倍體(圖3)。在不同濃度的秋水仙素誘導(dǎo)中，0.05%秋水仙素浸泡48 h處理的染色體加倍現(xiàn)象十分明顯。

圖2 清水浸泡48 h 處理組渥丹百合幼苗根尖染色體情況

Fig.2 Morphology of root tip chromosome ofL.concolorseeds soaked in water for 48 h

圖30.05% 秋水仙素浸泡48 h 處理渥丹百合幼苗根尖染色體情況

Fig.3 Morphology of root tip chromosome ofL.concolorseeds soaked in 0.05% colchicine solution for 48 h

2.5 秋水仙素對渥丹百合種子四倍體誘導(dǎo)效果

從表3看出，0.05%秋水仙素浸泡48 h處理的誘變效果最佳，其變異率為20%；其次是0.02%秋水仙素處理96 h，變異率為17.5%；0.05%秋水仙素處理72 h也可獲得相對較好的誘變效果。表明，適宜的秋水仙素濃度和處理時間是獲得大量渥丹百合四倍體的關(guān)鍵因素。

表3不同濃度秋水仙素處理渥丹百合的變異率

Table 3 Effect of different colchicine concentration on mutation rate ofL.concolorseedlings

秋水仙素/%ColchicineConcentration處理時間/hTreatment hours變異數(shù)/個Mutation number變異率/%Mutation rate02400 4800 7200 9600 0.022425 48410.072512.596717.50.0524512.548820.072615.096410.00.1024410.04825.07225.09600 0.152437.54825.07200 9612.5

2.6 渥丹百合二倍體與四倍體幼苗的形態(tài)學(xué)及細(xì)胞學(xué)差異

2.6.1 形態(tài)學(xué)差異 從表4看出，渥丹百合四倍體植株的葉片長度、寬度和厚度均明顯大于二倍體，分別為二倍體植株的109.65%、107.39%和163.16%。四倍體植株的葉型指數(shù)隨之變小，為二倍體的93.34%。整體上看，四倍體植株表現(xiàn)為葉片寬大、葉柄色澤更深、葉片顏色更濃綠、根系粗壯等特征，體現(xiàn)了多倍體植株的器官巨大性的特點。葉片厚度、長度以及葉形指數(shù)可作為初步鑒別四倍體植株與二倍體植株的重要指標(biāo)。

表4 渥丹百合四倍體與二倍體植株葉片形態(tài)差異

2.6.2 細(xì)胞學(xué)差異 植株葉片氣孔的變化是植物多倍化的一個重要細(xì)胞學(xué)鑒定指標(biāo)。從表5看出，渥丹百合四倍體植株葉片的保衛(wèi)細(xì)胞較二倍體明顯增大，其平均長度為二倍體植株的167.45%，平均寬度的為二倍體的158.74%；同時，四倍體植株的氣孔密度明顯下降，為二倍體的61.09%。

表5 渥丹百合四倍體與二倍體植株葉片的細(xì)胞學(xué)差異

3 結(jié)論與討論

研究結(jié)果表明，渥丹百合的種子發(fā)芽率隨秋水仙素濃度升高逐漸降低。通過秋水仙素處理渥丹百合種子可以有效誘導(dǎo)多倍體植株的形成，0.05%秋水仙素處理48 h為誘導(dǎo)渥丹百合染色體加倍較適宜的濃度與處理時間，誘變率達(dá)20.00%。秋水仙素在誘發(fā)種子染色體加倍時，會對細(xì)胞產(chǎn)生毒副作用，進(jìn)而影響其生長發(fā)育[11]。劉靜等[12]通過對蘭州百合進(jìn)行秋水仙素加倍處理發(fā)現(xiàn)，相同處理時間條件下，隨秋水仙素濃度增大，鱗莖數(shù)與小鱗莖產(chǎn)生率逐漸減少；秋水仙素濃度相同時，隨著處理時間延長，鱗莖數(shù)、小鱗莖產(chǎn)生率也逐漸減少。

對根尖進(jìn)行壓片處理時，最佳取材時間為9:30-9:35，這段時間內(nèi)渥丹百合根尖的有絲分裂最為旺盛，壓片效果最好。趙慶等[8]對萬壽菊根尖染色體觀測最優(yōu)方法進(jìn)行研究表明，有絲分裂前中期為最佳觀測階段，前中期時間點應(yīng)處于9:00左右。根尖壓片染色最適染色時長為20 min，并于染色結(jié)束后立即用45%的乙酸溶液進(jìn)行1.5 min的分色，觀察效果更佳。

通過對渥丹百合種子萌發(fā)情況的觀察分析發(fā)現(xiàn)，種子培養(yǎng)過程中保持水分和無污染，盡可能減少種子的霉菌感染，若出現(xiàn)霉菌感染可能是培養(yǎng)過程中的環(huán)境溫度或濕度并非最佳[13]。植物根尖染色體觀測受很多因素的影響，包括根尖培養(yǎng)方式、根尖成熟程度以及制片過程中各個階段的處理技術(shù)等[14]。在根尖染色制片過程中發(fā)現(xiàn)，有許多幼苗經(jīng)秋水仙素處理后成為了嵌合體。對于如何解決用秋水仙素誘導(dǎo)處理渥丹百合種子以獲得多倍體中易出現(xiàn)不穩(wěn)定嵌合體的問題，以及渥丹百合嵌合體的進(jìn)一步形態(tài)學(xué)細(xì)胞學(xué)研究，還需更深層次的研究探索。