早發(fā)型重度子癇前期患者血清2-ME水平和胎盤COMT表達(dá)及其意義

黃麗瓊，鄭 波△，張?jiān)?/p>

(1.咸寧市中心醫(yī)院湖北科技學(xué)院附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北咸寧 437000； 2.武漢大學(xué)中南醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北武漢 430071)

子癇前期(子癇前期)是妊娠期特有的多器官多系統(tǒng)疾病，母兒并發(fā)癥多，病死率高，其發(fā)病機(jī)制至今仍未明確，目前采用的治療方式仍然是終止妊娠。2-甲氧雌二醇(2-ME)是17β雌二醇經(jīng)細(xì)胞色素P450(CYP450)羥基化然后由COMT甲基化生成的代謝產(chǎn)物。2008年KANASAKI等[1]首次發(fā)現(xiàn)子癇前期患者體內(nèi)2-ME水平降低，敲除COMT基因的小鼠可出現(xiàn)子癇前期癥狀，并能通過補(bǔ)充2-ME得以改善。雖然此后，不斷有學(xué)者進(jìn)行2-ME/COMT與子癇前期關(guān)系的研究[2-4],但有關(guān)早發(fā)型子癇前期的研究罕見，而且COMT與子癇前期關(guān)系結(jié)論也不一致[5-6]。本課題組在前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)晚發(fā)型子癇前期患者血清2-ME水平升高，胎盤COMT蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化[7]。這一結(jié)論在早發(fā)型子癇前期患者中是否一致？為此設(shè)計(jì)此項(xiàng)研究來(lái)探討2-M/COMT與早發(fā)型重度子癇前期的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 子癇前期的劃分標(biāo)準(zhǔn)按照中華醫(yī)學(xué)會(huì)頒發(fā)的《妊娠期高血壓疾病診治指南(2012版)》執(zhí)行，收集25例2014年3月至2017年3月期間咸寧市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科收治的早發(fā)型重度子癇前期病例(孕周為28～34周，EOSPE組)，隨機(jī)選取同期健康對(duì)照組(NP組)25例，標(biāo)準(zhǔn)為孕周小于34周早產(chǎn)的單胎健康孕婦。收集包括孕婦年齡、孕產(chǎn)次、分娩孕周、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、期待治療時(shí)間、收縮壓和舒張壓的臨床基本資料。研究已得到入組的健康孕婦與子癇患者的同意并簽署知情同意書，且課題研究通過咸寧市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 血清2-ME水平檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血清2-ME水平。乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管采集兩組患者外周肘靜脈血10 mL，室溫直立靜置半小時(shí)后，以1 000 r/min離心15 min吸取上層血清樣本，-80 ℃超低溫保存待用。根據(jù)2-ME ELISA試劑盒(潤(rùn)裕生物，上海)說(shuō)明書同批次檢測(cè)血清2-ME水平，保證批差異小于5%。

1.3 胎盤COMT表達(dá) 分娩后10 min內(nèi)，無(wú)菌狀態(tài)下以無(wú)菌剪刀剪取2塊約1 cm×1 cm×1 cm大小的胎盤絨毛膜組織，取材時(shí)注意避開胎盤中央母體面的出血、壞死或鈣化的區(qū)域。并立即用PBS磷酸緩沖液(PH 7.2)漂洗組織標(biāo)本2次。其中一塊組織樣本以石蠟包埋處理，以用于后期免疫組化(IHC)檢測(cè)COMT表達(dá)；另一塊直接液氮冷凍保存，用于提取mRNA與蛋白樣本。注意給標(biāo)本進(jìn)行編號(hào)區(qū)分。

1.3.1 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)胎盤中COMT mRNA 按Trizol說(shuō)明書提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI7300型),引物見表1，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用2-△△Ct法對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。以3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參。

1.3.2 胎盤COMT蛋白檢測(cè)方法

1.3.2.1 免疫組化檢測(cè) 胎盤組織塊脫蠟后，滴加1%雙氧水(H2O2)5%牛血清白蛋白封閉液，室溫10 min。抗原修復(fù)后封閉30 min，加一抗4 ℃過夜，加二抗孵育30 min，DAB染色液顯色蘇木精復(fù)染，蒸餾水沖洗切片后，按病理標(biāo)本處理標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行乙醇梯度脫水后，以二甲苯透明切片，并用中性樹脂進(jìn)行永久封片后，置于光學(xué)顯微鏡下觀察胎盤組織COMT蛋白免疫染色，定義將細(xì)胞質(zhì)與/或細(xì)胞核染成棕黃色顆粒物為陽(yáng)性染色。

1.3.2.2 采用蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)法 取適量的胎盤組織塊，蛋白提取液，待組織充分裂解后，采用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。每泳道上樣50 μg，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白電泳后以PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜45～60 min，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后5%脫脂奶粉封閉膜1 h，將相應(yīng)COMT一抗按1∶1 000稀釋后，4 ℃孵育PVDF膜過夜，PBS緩沖液沖洗膜后，帶辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(稀釋1∶2 000)孵育1～2 h，PBS緩沖液沖洗膜后，在膜上滴加幾滴ECL化學(xué)發(fā)光底物，放入凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光顯影，采用相應(yīng)內(nèi)參灰度值作為對(duì)照，對(duì)蛋白條帶進(jìn)行相對(duì)定量分析。

表1 RT-PCR引物及序列

2 結(jié) 果

2.1 研究對(duì)象的臨床資料 兩組患者年齡、孕產(chǎn)次、孕周、孕前BMI比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示研究背景一致性；采血日BMI、收縮壓、舒張壓兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。分娩孕周、期待治療時(shí)間在EOSPE組和NP組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

2.2 兩組血清2-ME水平比較 EOSPE組孕婦血清2-ME水平為(525.3±172.6)pg/mL，NP組孕婦血清2-ME水平為(705.9±157.4)pg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2，提示早發(fā)型重度子癇前期孕婦血清中2-ME水平比健康孕婦降低。

表2 兩組孕婦臨床資料比較

注：與NP組比較，*P<0.05

2.3 兩組胎盤COMT的表達(dá)比較

2.3.1 RT-PCR法檢測(cè)胎盤COMT mRNA的表達(dá)水平 EOSPE組孕婦胎盤組織中COMT mRNA相對(duì)表達(dá)量為(0.447±0.152)，NP組孕婦胎盤組織中COMT mRNA相對(duì)表達(dá)量為(0.467±0.151)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.678)。

2.3.2 免疫組化檢測(cè)胎盤COMT蛋白表達(dá) 兩組孕婦胎盤組織中均有COMT表達(dá)，COMT表達(dá)定位在合體滋養(yǎng)細(xì)胞，見圖1箭頭所指，表達(dá)結(jié)果均為陽(yáng)性。

注：A為NP組，B為EOSPE組

圖1 免疫組化檢測(cè)兩組胎盤COMT的表達(dá)情況(×200)

2.3.3 Western Blot檢測(cè)胎盤COMT的表達(dá) COMT有兩種蛋白亞型，根據(jù)蛋白定位分為胞漿型(S-COMT)和膜結(jié)合型(MB-COMT)，胎盤COMT活性以S-COMT為主。EOSPE組孕婦胎盤組織中COMT蛋白相對(duì)表達(dá)量(0.891 6±0.102 0)，NP組孕婦胎盤組織中COMT蛋白相對(duì)表達(dá)量(0.924 0±0.158 7)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.422)，見圖2。

圖2 兩組孕婦胎盤組織中COMT蛋白相對(duì)表達(dá)量

2.4 EOSPE組血清2-ME與臨床資料的相關(guān)性分析 EOSPE組血清2-ME與臨床指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析并做出散點(diǎn)圖，其中EOSPE組2-ME水平與收縮壓是呈負(fù)相關(guān)(r=-0.648，P<0.05)；與期待治療時(shí)間呈正相關(guān)(r=0.694，P<0.05)。見表3、圖3、4。

圖3 血清2-ME與收縮壓相關(guān)性散點(diǎn)圖

圖4 血清2-ME與期待治療時(shí)間相關(guān)性散點(diǎn)圖

3 討 論

子癇前期是嚴(yán)重危害母嬰健康的妊娠期并發(fā)癥。世界衛(wèi)生組織(WHO)年報(bào)顯示，全世界每年大約有1 500萬(wàn)例早產(chǎn)兒，其中約有20%與子癇前期有關(guān)[8-9]。在經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)國(guó)家，子癇前期發(fā)病率和因子癇前期導(dǎo)致的孕婦病死率和新生兒早產(chǎn)率是經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)國(guó)家的20倍以上[10]。早發(fā)型子癇前期的發(fā)病早，母體病情發(fā)展迅速，疾病的進(jìn)展期也不容易預(yù)判，且并發(fā)癥重，目前臨床的最佳治療方法就是適時(shí)終止妊娠。因此能夠預(yù)測(cè)病情發(fā)展，恰當(dāng)?shù)难娱L(zhǎng)孕周，選擇最佳的終止妊娠時(shí)機(jī)，對(duì)改善孕婦和胎兒的不良結(jié)局有著關(guān)鍵作用。

2-ME是17β雌二醇在體內(nèi)經(jīng)COMT甲基化的生物活性代謝產(chǎn)物。曾有國(guó)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，重度子癇前期孕婦血清2-ME水平(982 pg/mL，3 nmol/L)，與輕度子癇前期(1 813 pg/mL，6 nmol/L)和正常足月孕婦(2 186 pg/mL，7 nmol/L)比較明顯降低，這與本研究結(jié)論基本一致[11]。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)：在孕11～14周，血清2-ME水平低的孕婦(1.9×2 pg/mL，0.006 nmol/L)比健康孕婦(61.7×27 pg/mL，0.204 nmol/L)更容易發(fā)展為子癇前期[5]。上述數(shù)據(jù)表明，妊娠早期血清2-ME水平低可能與妊娠后期發(fā)展為子癇前期有關(guān)。LEE等研究者[12]發(fā)現(xiàn)在2.5%的低氧環(huán)境下，2-ME能誘導(dǎo)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞分化成侵襲表型，從而更有效地促使細(xì)胞浸潤(rùn)生長(zhǎng)。滋養(yǎng)層細(xì)胞成功入侵，其中低氧環(huán)境是重要因素之一，但并非是唯一的因素。2-ME可以通過保護(hù)母體血管功能、誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲表型分化、維持胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞正常浸潤(rùn)生長(zhǎng)，從而達(dá)到預(yù)防子癇前期發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，EOSPE組患者血清2-ME水平和收縮壓呈負(fù)相關(guān)(r=-0.648，P<0.05)，但NP組中血清2-ME水平和收縮壓未發(fā)現(xiàn)具有相關(guān)性。雖然EOSPE組患者血清2-ME水平低，與病情程度具有一定的相關(guān)性，而且有證據(jù)證明2-ME可以抑制心血管平滑肌收縮、生長(zhǎng)，防止血管動(dòng)脈粥樣硬化并維持心血管功能有相當(dāng)大的作用[13]，還有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)2-ME能防止鼠大動(dòng)脈平滑肌收縮[14]。以上證據(jù)均顯示2-ME通過對(duì)心血管平滑肌抑制、對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能影響，幫助孕婦維持心血管功能和血壓穩(wěn)定。

在保證子癇前期孕婦和圍產(chǎn)兒安全的前提下，對(duì)無(wú)嚴(yán)重并發(fā)癥的早發(fā)型重度子癇前期緩和采取保守治療(又稱期待療法)，可適當(dāng)延長(zhǎng)孕周，減少因胎兒不成熟而致圍產(chǎn)兒死亡，降低患者嚴(yán)重并發(fā)癥發(fā)生概率。保守治療需要對(duì)患者和胎兒的嚴(yán)密監(jiān)護(hù)，雖然延長(zhǎng)了孕周，但由于此類病情發(fā)展迅猛，嚴(yán)重的并發(fā)癥不但會(huì)導(dǎo)致孕產(chǎn)婦器官功能損害，反而增加了圍產(chǎn)兒患病率、病死率。本課題組研究孕婦血清2-ME水平與保守治療(期待療法)時(shí)間呈正相關(guān)(r=0.694，P<0.05)，提示低2-ME水平的早發(fā)型子癇前期患者延長(zhǎng)孕周時(shí)間有限，需根據(jù)病情變化，適時(shí)終止妊娠。

COMT是雌二醇、兒茶酚胺降解的關(guān)鍵酶，廣泛存在于人體各個(gè)器官，在孕婦胎盤、肝臟、腦組織中含量高。COMT根據(jù)蛋白定位分為胞漿型(S-COMT)和膜結(jié)合型(MB-COMT)兩種蛋白亞型，孕婦胎盤COMT以胞漿型為主。2008年KANASAKI 等[1]通過實(shí)驗(yàn)敲除小鼠COMT基因，成功制造子癇前期小鼠模型。這些COMT基因敲除小鼠給予2-ME灌胃，子癇前期癥狀得到較大改善。LEE等[12]發(fā)現(xiàn)在3例重度子癇前期患者胎盤中發(fā)現(xiàn)COMT表達(dá)降低，與KANASAKI[1]結(jié)論一致。2017年的一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)COMT缺乏可誘發(fā)高血壓，機(jī)制可能與其促進(jìn)機(jī)體對(duì)血管緊張素Ⅱ敏感性有關(guān)；而2-ME可通過彌補(bǔ)COMT缺乏來(lái)改善血壓紊亂[15]。這些研究結(jié)果似乎證明了胎盤中COMT的活性與子癇前期發(fā)病關(guān)系密切，但這些研究從統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上來(lái)說(shuō)，病例數(shù)非常有限。本實(shí)驗(yàn)中亦未發(fā)現(xiàn)COMT在2組孕婦體內(nèi)存在差異。因此提示2-ME在子癇前期孕婦體內(nèi)水平降低原因可能不一定是COMT酶水平降低和/或活性減少；亦有可能其他代謝途徑的異常導(dǎo)致，比如S-腺苷蛋氨酸的生物利用度降低或17β-雌二醇生物利用度下降等[16]。由以推測(cè)相對(duì)于COMT，2-ME可能對(duì)促進(jìn)母體妊娠期胎盤正常發(fā)育及保護(hù)血管內(nèi)皮功能有更積極的作用。

4 結(jié) 論

血清2-ME水平降低可能會(huì)導(dǎo)致子癇前期發(fā)生，通過檢測(cè)子癇前期患者血清2-ME水平與健康孕婦血清2-ME水平，及時(shí)掌握病情嚴(yán)重程度，可能對(duì)指導(dǎo)延長(zhǎng)孕周，適時(shí)終止妊娠，達(dá)到降低子癇前期母兒相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生率、改善孕婦和胎兒的不良結(jié)局有一定作用。