miR-31在COPD患者外周血中的表達(dá)及其臨床意義

陳錦暖，吳 雷，葉樹培，陳美華

(東莞市第三人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣東東莞 523326)

世界衛(wèi)生組織(WHO)報(bào)道顯示2015年全球就有300萬(wàn)人死于慢性阻塞性肺疾病(COPD)。COPD臨床表現(xiàn)為肺功能失常和氣道的重建，吸煙、環(huán)境的污染是COPD的主要危險(xiǎn)因素，這些因素通過(guò)改變氣道的功能及免疫失調(diào)導(dǎo)致炎癥進(jìn)展，從而利于感染的發(fā)生[1-2]。micoRNA在COPD中已有部分研究，并且其在COPD的進(jìn)展及臨床表現(xiàn)中具有重要的作用[3]，近期報(bào)道顯示微小RNA-31(miR-31)在肺纖維化中起到負(fù)調(diào)控的作用[4]，對(duì)氣道慢性病毒性感染有促進(jìn)作用，抑制T細(xì)胞的抗病毒功能，有利于病毒的感染入侵[5]。而T細(xì)胞在COPD患者中表現(xiàn)為功能減弱，如T細(xì)胞的趨化因子、功能因子等表達(dá)不足[5]，而在COPD患者中miR-31的表達(dá)是否異常，是否與T細(xì)胞的功能減弱相關(guān)，目前尚未有報(bào)道。研究者通過(guò)檢測(cè)COPD患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中的miR-31表達(dá)量，探討miR-31與COPD的發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。通過(guò)檢測(cè)COPD患者血漿中Th1和Th2類細(xì)胞因子水平，并進(jìn)行相關(guān)性分析，探討miR-31在COPD中的可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 所有研究對(duì)象均來(lái)自于東莞市第三人民醫(yī)院，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，并取得研究對(duì)象的知情同意。所有對(duì)象均按照中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)慢性阻塞性肺疾病學(xué)組的《慢性阻塞性肺疾病診治指南》為診斷標(biāo)準(zhǔn)納入，共檢測(cè)了38例COPD患者(COPD組)和15例急性支氣管炎(AB)患者(AB組)，所有患者無(wú)自身免疫性疾病，入院取樣前無(wú)使用免疫調(diào)節(jié)劑。均采用第三代頭孢類藥物治療大于1周者為跟蹤治療組15例，另取40例體檢健康者作為對(duì)照組。

1.2 儀器與試劑 主要檢測(cè)儀器為實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI Q6 Flex)；人白細(xì)胞介素4(IL-4)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)檢測(cè)試劑盒(達(dá)科為)；人γ-干擾素(IFN-γ) ELISA檢測(cè)試劑盒(達(dá)科為)。主要試劑為Trziol(Thermo)、 TransScript miRNA First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(Transgen Biotech)、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(TakaRa)、TransStart Tip Green qPCR Super Mix(Transgen Biotech)；miR-31 引物(上海生工合成)；人IL-4 ELISA檢測(cè)試劑盒和FIN-γ ELISA檢測(cè)試劑盒(賽默飛世爾科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集 標(biāo)本均由本科室醫(yī)生或護(hù)士協(xié)助收集，用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管每個(gè)樣本取5 mL全血，用淋巴細(xì)胞分離液分離得到PBMC，Trziol裂解液處理，于-80 ℃保存。血漿分管保存于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 miR-31表達(dá)量檢測(cè) 取出凍存標(biāo)本，常溫下解凍，Trziol法提取總RNA，于核酸蛋白檢測(cè)儀中定量RNA，試劑盒ransScript miRNA First-Strand cDNA Synthesis SuperMix反轉(zhuǎn)錄成后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)，計(jì)算miR-31的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3 ELISA檢測(cè)血漿IL-4和IFN-γ水平 取出COPD患者血漿標(biāo)本，常溫解凍，按照ELISA試劑盒推薦的方法與條件進(jìn)行操作，終止顯色后在多功能酶標(biāo)儀中讀取樣品孔中的吸光度值(A值)，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成樣品濃度。

1.3.4 患者實(shí)驗(yàn)室相關(guān)數(shù)據(jù)的檢測(cè) 標(biāo)本在抽取時(shí)同時(shí)送檢驗(yàn)科做血常規(guī)及生化檢測(cè)。同時(shí)臨床測(cè)定COPD患者的肺功能：一秒呼氣容積(FEV1)。

2 結(jié) 果

2.1 各組一般情況比較 COPD組共38例，Ⅰ期患者12例，Ⅱ期患者14例，Ⅲ期患者12例。COPD組患者平均年齡為(72.84±9.61)歲；AB組患者15例，平均年齡為(68.8±5.67)歲；對(duì)照組40例，平均年齡為(69.15±6.73)歲，各組年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。COPD組男女性別比為19/19、AB組男女性別比為8/7、對(duì)照組男女性別比為19/21，各組男女性別比相互比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 各組PBMC的miR-31的表達(dá)量比較 COPD組PBMC中miR-31的表達(dá)[(2.92±1.16)]明顯高于對(duì)照組[(1.10±0.48)]和AB組[(1.72±0.67)]，AB組明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中15例COPD患者在抗菌藥物治療好轉(zhuǎn)跟蹤檢測(cè)，其PBMC中miR-31的表達(dá)治療后得到下降(P<0.05)，見圖1。

注：A為3組PBMC中miR-31的表達(dá)量比較；B為COPD患者治療前后miR-31的表達(dá)量比較

圖1 PBMC的miR-31的表達(dá)差異

2.3 COPD患者miR-31的表達(dá)量與患者疾病嚴(yán)重程度相關(guān)性分析 將COPD患者按照臨床分型分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期。其中Ⅱ期[(3.04±0.95)]、Ⅲ期患者[(3.6±0.87)]PBMC中miR-31的表達(dá)量明顯高于Ⅰ期患者[(2.12±1.22)]。見圖2。

圖2 miR-31在各臨床分類COPD患者中的表達(dá)量差異

2.4 COPD患者PBMC中miR-31的表達(dá)量與各炎癥細(xì)胞間的相關(guān)性分析 COPD患者PBMC中miR-31的表達(dá)量與外周血CRP水平呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=-0.663 8,P<0.05)；與外周血白細(xì)胞總數(shù)呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=-0.472 6,P=0.005 5)；與外周血中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的比例無(wú)相關(guān)關(guān)系，見圖3。

注：A為miR-31的表達(dá)量與外周血CRP水平的相關(guān)性分析；B為miR-31的表達(dá)量與外周血白細(xì)胞數(shù)的相關(guān)性分析；C為miR-31的表達(dá)量與外周血中性粒細(xì)胞比例的相關(guān)性分析；D為miR-31的表達(dá)量與PBMC比例的相關(guān)性分析；E為miR-31的表達(dá)量與外周血淋巴細(xì)胞比例的相關(guān)性分析

圖3 COPD患者PBMC中miR-31的表達(dá)量與各炎癥細(xì)胞的相關(guān)性分析

注：A為miR-31的表達(dá)量與外周血CRP水平相關(guān)性分析；B為miR-31的表達(dá)量與外周血白細(xì)胞數(shù)的相關(guān)性分析；C為miR-31的表達(dá)量與外周血中性粒細(xì)胞比例的相關(guān)性分析；D為miR-31的表達(dá)量與PBMC比例的相關(guān)性分析；E為miR-31的表達(dá)量與外周血淋巴細(xì)胞比例的相關(guān)性分析

圖4 AB患者PBMC中miR-31的表達(dá)量與各炎癥細(xì)胞的相關(guān)性分析

2.5 AB患者PBMC中miR-31的表達(dá)量與各種炎癥細(xì)胞間的相關(guān)性分析 AB患者PBMC中miR-31的表達(dá)量與外周血CRP水平呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=0.681 5,P=0.014 7)；與外周血白細(xì)胞總數(shù)呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=0.587 3,P=0.021 3)；與外周血中性粒細(xì)胞的比例呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=0.662 5,P=0.007 1)；與PBMC比例無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與外周淋巴細(xì)胞比例呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=-0.630 3,P=0.011 8)，見圖4。

2.6 COPD患者PBMC中miR-31的表達(dá)量與血漿中IL-4及IFN-γ水平相關(guān)性分析 已有報(bào)道顯示COPD患者血漿IL-4及FIN-γ水平與健康人水平比較具有明顯差異，因此通過(guò)檢測(cè)COPD患者血漿中IL-4及IFN-γ水平，分析miR-31的表達(dá)與分別主要來(lái)自于Th1類細(xì)胞的IFN-γ和Th2類細(xì)胞的IL-4的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)miR-31的表達(dá)與IL-4水平呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=-0.476 4,P=0.002 5)；與IFN-γ水平無(wú)相關(guān)關(guān)系，見圖5。

注：A為miR-31的表達(dá)量與血漿IL-4水平的相關(guān)性分析；B為miR-31的表達(dá)量與血漿IFN-γ水平的相關(guān)性分析

圖5 miR-31的表達(dá)量與血漿中IL-4及IFN-γ水平相關(guān)性分析

3 討 論

COPD病情的發(fā)展與多種因素相關(guān)，比如吸煙導(dǎo)致的缺氧[6]、病毒感染[7]、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活化及內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞的凋亡[7-8]；另外基因的易感性及性別在COPD患者中的T細(xì)胞表型具有明顯差異[9]。因此肺部的微環(huán)境對(duì)COPD的病理變化起到重要作用。一些miRNA近來(lái)被證實(shí)在COPD患者中表達(dá)增高[10]。WANG等[11]在COPD患者血漿中證實(shí)了miR-145-5p、miR-636、miR-338-3p、miR-4485、miR-1229-3p、miR-4707-3p、和miR-3620-3p 表達(dá)增高。另外在外周血及患者痰液中也檢測(cè)到miRNA-145和miRNA-338的表達(dá)增高[12]。miR-31已在腫瘤中被證實(shí)具明顯的抑制腫瘤生長(zhǎng)的功能[13-15]，特別是乳腺癌[16-17]。另外在感染性疾病中miR-31的表達(dá)也是異常，如結(jié)核病[18-19]、慢性病毒性感染中對(duì)CD8+T細(xì)胞的耗竭起到重要的作用[5,20]，另外在尋常型牛皮鮮中其表達(dá)也是異常[21]。檢測(cè)結(jié)果顯示COPD患者PBMC中miR-31表達(dá)增加，治療后得到下調(diào)。外周血中miR-31的表達(dá)量檢測(cè)已有報(bào)道，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者[22]、肺癌患者的外周血[23]、小兒結(jié)核病外周血miR-31表達(dá)異常可能作為診斷的標(biāo)志物[19]。因此miR-31參與了眾多疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，但在COPD患者中的作用機(jī)制目前尚未明確。另外嚴(yán)重的COPD患者其表達(dá)量更高，提示其表達(dá)與疾病的嚴(yán)重程度具有密切關(guān)系。進(jìn)一步分析miR-31的表達(dá)與外周血炎癥細(xì)胞的相關(guān)性，以推測(cè)其可能的調(diào)節(jié)機(jī)制，發(fā)現(xiàn)其在COPD中與CRP和白細(xì)胞總數(shù)呈負(fù)相關(guān)，而在AB患者中，與外周血中性粒細(xì)胞呈正相關(guān)(r=0.662 5，P=0.007 1)。因此在COPD和AB患者中其可能與炎癥的負(fù)反饋調(diào)節(jié)相關(guān)。進(jìn)一步檢測(cè)的血漿中IL-4及IFN-γ水平，結(jié)果顯示COPD患者PBMC中miR-31的表達(dá)與IL-4水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.476 4,P<0.05)，其可能對(duì)Th2類T細(xì)胞具有調(diào)節(jié)作用。已有報(bào)道顯示miR-31在膿毒血癥中通過(guò)調(diào)節(jié)Th2細(xì)胞發(fā)揮作用[24]，因此在COPD中miR-31可能抑制Th2細(xì)胞，間接促進(jìn)炎癥性細(xì)胞的功能，有利于疾病的發(fā)展。但是該miRNA其功能靶點(diǎn)可能是多樣的，在各個(gè)疾病中的靶點(diǎn)不同，如在慢性病毒感染中其可增強(qiáng)T細(xì)胞對(duì)Ⅰ型干擾素的敏感性，從而干擾效應(yīng)T細(xì)胞的功能，增強(qiáng)T細(xì)胞失能相關(guān)蛋白的表達(dá)[5]，也可以通過(guò)靶向結(jié)合基因STK40和LATS2調(diào)節(jié)角化細(xì)胞的生長(zhǎng)和毛發(fā)的分化[25]，在肺癌中miRNA-31可通過(guò)抑制BAP1促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[14]，而在乳頭狀甲狀腺癌中其可通過(guò)RNA結(jié)合蛋白減弱腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[26]，在肺纖維化中其可通過(guò)靶向結(jié)合整聯(lián)蛋白α減弱纖維化的發(fā)生[4]。

COPD患者中miR-31的增高，與疾病的發(fā)生發(fā)展具有密切關(guān)系，可能作為診斷或治療該疾病的靶點(diǎn)。同時(shí)結(jié)果顯示miR-31與Th2細(xì)胞因子IL-4具有相關(guān)性，提示miR-31可能對(duì)Th2類細(xì)胞起主要調(diào)節(jié)作用，該結(jié)果為進(jìn)一步對(duì)其機(jī)制的探討提供了臨床實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

4 結(jié) 論

本文發(fā)現(xiàn)COPD患者外周血高表達(dá)miR-31，其表達(dá)與疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)；miR-31的表達(dá)量與外周血中CRP和炎癥細(xì)胞水平具有相關(guān)性，提示其參與了COPD炎性反應(yīng)過(guò)程，研究結(jié)果顯示COPD血漿中的IL-4水平與miR-31的表達(dá)量具有相關(guān)性，提示了miR-31可能對(duì)Th2類細(xì)胞具有調(diào)節(jié)作用。