慢性乙型肝炎感染患者血清CTGF表達(dá)及與肝纖維化、Th17/Treg平衡的關(guān)系

王 慧，許劍蘭，鄭成芳，陳靈芝

(海南西部中心醫(yī)院感染科，海南儋州 571700)

慢性乙型肝炎(CHB)是由于感染乙型肝炎病毒(HBV)并在患者體內(nèi)復(fù)制而引起機(jī)體自身免疫反應(yīng)，造成肝臟炎癥損傷的一種全球范圍內(nèi)的感染性疾病。CHB患者主要表現(xiàn)為腹脹、惡心、身體乏力、肝區(qū)疼痛、脾大等臨床癥狀[1]。HBV感染后患者病情可逐漸惡化形成肝硬化、肝衰竭、肝癌等嚴(yán)重肝臟疾病，損傷患者生命健康。據(jù)有關(guān)研究報道[2]，HBV侵入機(jī)體之后，在人體肝臟細(xì)胞內(nèi)自我復(fù)制，誘導(dǎo)機(jī)體免疫反應(yīng)，引起免疫細(xì)胞輔助性T淋巴細(xì)胞17(Th17)、調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Treg)、Th2、Th1等的共同作用，其中Th1、Th2共同調(diào)控肝臟免疫應(yīng)答，Th1/Th2水平失衡影響肝臟纖維化發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。Th17、Treg共同起源于T淋巴細(xì)胞，近幾年發(fā)現(xiàn)其也與肝臟炎癥反應(yīng)、肝臟纖維化進(jìn)程相關(guān)，Th17主要參與炎性反應(yīng)，Treg主要參與抗炎反應(yīng)，但其具體作用機(jī)制尚待研究[3]。還有研究表明結(jié)締組織生長因子(CTGF)具有分泌特性，其作為轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)的下游效應(yīng)介質(zhì)，能夠與TGF-β共同誘導(dǎo)腎間質(zhì)纖維化的形成[4]。但關(guān)于CTGF、Th17/Treg在CHB中的表達(dá)情況及與肝臟纖維化的的研究鮮有報道，因此本研究主要分析CTGF與肝纖維化、Th17/Treg平衡在CHB患者的表達(dá)情況及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究收集2016年6月至2018年6月在本院確診的CHB患者資料146例(研究組)為研究對象，其中男76例，女70例，年齡30～76歲，平均年齡(45.64±10.85)歲，根據(jù)慢性乙型肝炎防治指南[5]將肝纖維化程度將其分為S0期34例，S1期30例，S2期28例，S3期29例，S4期25例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合2010年中華人民共和國“慢性乙型肝炎防治指南”的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；(2)患者及家屬均知情且簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他病毒重疊感染或混合感染；(2)近1個月服用治療CHB的藥物者；(3)妊娠期、哺乳期婦女；(4)合并嚴(yán)重心肺功能障礙患者；(5)近期患有全身性炎癥疾病和自身免疫性疾病者；(6)近期有細(xì)菌、病毒等感染病。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)。另選取同期在本院體檢的健康者90例作為對照組，其中男48例，女42例，年齡32～75歲，平均年齡(45.05±11.35)歲，對照組所有研究對象均經(jīng)過血常規(guī)、生化分析、B超檢測等證明無肝臟疾病。2組研究對象性別、年齡等一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 儀器與試劑 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT，批號：20150619)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST，批號：20150822)、總膽紅素(TB，批號：20150625)試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司；CTGF、白細(xì)胞介素-17(IL-17)試劑盒購自美國ADL公司。全自動生化分析儀型號為7600，購自日立公司；酶標(biāo)儀型號為550，購自美國Bio-Rad公司；流式細(xì)胞儀型號為MoFloAstrios EQ，購自美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的采集與處理 清晨空腹采集本研究所有受試者靜脈血6 mL，分為兩份，一份于室溫下靜置20 min，以2 500 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min，吸取上層血清分裝于無菌管中，置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?；一份置于肝素鈉采血管中，用于Th17和Treg的檢測。

1.3.2 肝功能指標(biāo)的檢測 肝功能指標(biāo)ALT、AST、TB水平，均采用日立7600全自動生化分析儀測定，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.3.3 血清CTGF、IL-17水平的檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清CTGF、IL-17的水平，具體檢測步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行，酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測記錄波長450 nm時的A值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待檢樣品濃度。

1.3.4 Th17和Treg的檢測 取肝素鈉采血管中的血液，梯度離心提取外周單個核細(xì)胞(PBMC)。參照流式細(xì)胞儀操作說明對細(xì)胞進(jìn)行固定、染色、透化，分別對Th17、Treg 進(jìn)行胞內(nèi)染色，1h內(nèi)使用流式細(xì)胞儀檢測，計算Th17、Treg百分率及Th17/Treg比值。

2 結(jié) 果

2.1 兩組臨床資料比較 兩組研究對象性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；研究組ALT、AST、TB均顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.2 2組血清CTGF、IL-17水平及Th17、Treg百分率比較 與對照組相比，研究組CTGF、IL-17水平顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與對照組比較，研究組Treg百分率降低(P>0.05)，Th17百分率顯著升高(P<0.05)，Th17/Treg比值顯著升高(P<0.05)，見表2。

2.3 不同纖維化程度血清CTGF、IL-17水平及Th17、Treg百分率比較 隨著纖維化程度加深，血清CTGF、IL-17水平及Th17、Th17/Treg比值逐漸升高，Treg百分率逐漸降低，其中S1～4期血清CTGF、IL-17水平及Th17、Th17/Treg比值均顯著高于S0期(P<0.05)，Treg百分率均顯著低于S0期(P<0.05)，見表3。

表1 兩組臨床資料比較

表2 2組血清CTGF、IL-17水平及Th17、Treg百分率比較

表3 不同纖維化程度患者血清CTGF、IL-17水平比較

2.4 血清CTGF、Th17/Treg水平與IL-17、Th17、Treg相關(guān)性 Pearson相關(guān)性分析，CTGF與Th17/Treg、IL-17、Th17呈正相關(guān)(r=0.670、0.603、0.618，P<0.05)，與Treg呈負(fù)相關(guān)(r=-0.609，P<0.05)；Th17/Treg與IL-17、Th17呈正相關(guān)(r=0.703、0.645，P<0.05)，與Treg呈負(fù)相關(guān)(r=-0.683，P<0.05)；Treg與IL-17、Th17呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.598、-0.624，P<0.05)，Th17與IL-17呈正相關(guān)(r=0.651，P<0.05)。

2.5 ROC分析CTGF、Th17/Treg比例對CHB患者的診斷意義 ROC分析檢測CTGF、Th17/Treg表達(dá)水平對CHB的診斷價值，結(jié)果顯示CTGF靈敏度為68.9%、特異度為56.7%、截斷值為24.191 5 ng/mL、ROC曲線下的面積(AUC)為0.695；Th17/Treg靈敏度為77.8%、特異度為67.8%、截斷值為0.853 1，AUC面積為0.753。見圖1、表4。

注：A為CTGF對CHB的診斷價值；B為Th17/Treg表達(dá)水平對CHB的診斷價值

圖1 血清CTGF、Th17/Treg的ROC曲線圖

3 討 論

HBV在各國都有分布，其可通過血液、性接觸、醫(yī)源接觸等途徑傳播，其傳播途徑較為廣泛且疾病治愈困難。目前每年有大約100萬患者死于HBV感染，近年來隨著HBV感染人數(shù)的增多，對CHB的預(yù)防和治療成為全球性亟待解決的公共健康問題。CHB發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前研究者認(rèn)為其與免疫系統(tǒng)紊亂密切相關(guān)，CD4+細(xì)胞亞群Th1/Th2失衡被認(rèn)為是引起肝臟損傷的主要原因[6]。近年來隨著研究的深入，逐漸發(fā)現(xiàn)CD4+細(xì)胞亞群的Th17、Treg在CHB的免疫反應(yīng)中也發(fā)揮重要作用。孫強(qiáng)等[7]研究發(fā)現(xiàn)，CHB患者外周血Th17比例及IL-17顯著高于對照組，認(rèn)為Th17在CHB患者機(jī)體內(nèi)具有免疫激活作用。STOOP等[8]研究表明，Treg細(xì)胞在CHB患者外周血中的比例顯著低于對照組。CTGF是TGF-β的下游效應(yīng)介質(zhì)，主要由肝星狀細(xì)胞分泌，IL-17可以激活肝星狀細(xì)胞。故本研究檢測分析CHB患者中血清CTGF、Th17、Treg水平，以期為CHB的診治提供理論依據(jù)。

Th17細(xì)胞是在自身免疫性疾病的研究中發(fā)現(xiàn)的輔助性T細(xì)胞，具有較強(qiáng)的促炎作用，其主要生物學(xué)作用通過IL-17表達(dá)，其主要分泌IL-17，IL-6、IL-21等炎癥因子[9]。在HBV感染后，Th17細(xì)胞分泌IL-17作用于靶細(xì)胞，刺激炎癥介質(zhì)釋放，誘導(dǎo)機(jī)體炎癥反應(yīng)，損傷肝臟組織[10]。研究表明，Th17還可促進(jìn)IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等的表達(dá)，引起組織細(xì)胞的浸潤促進(jìn)炎癥的發(fā)生發(fā)展[11]。Treg細(xì)胞可向CD4+T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞等釋放TGF-β、IL-10等抗炎因子抑制自身免疫反應(yīng)，減弱炎癥反應(yīng)對組織的損傷[12]。近年來研究表明，在CHB患者中，Treg細(xì)胞明顯降低，其能夠抑制HBV特異性CD8+的增殖，預(yù)防過度免疫應(yīng)答引起的肝臟組織細(xì)胞損傷[13]。機(jī)體內(nèi)Th17誘導(dǎo)炎癥發(fā)生，Treg抑制炎癥反應(yīng)，二者共同維持機(jī)體的免疫狀態(tài)。Th17與Treg在正常機(jī)體狀態(tài)下處于相對平衡，TGF-β抑制效應(yīng)T細(xì)胞的活化、誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的增殖；在炎癥反應(yīng)中IL-6抑制Treg細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)Th17細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致Th17/Treg比值失衡，引起全身免疫應(yīng)答異常[14]。本研究結(jié)果顯示患者Th17細(xì)胞頻率顯著升高，Treg細(xì)胞頻率降低，Th17/Treg比值升高。ALT、AST、TB作為檢測肝臟功能重要的指標(biāo)，其水平顯著升高表明肝臟受到嚴(yán)重?fù)p傷，可能與病毒性肝炎引起的炎癥作用相關(guān)。研究表明，慢性肝炎患者IL-17水平與ALT呈正相關(guān)[15]。本研究中，ALT、AST、TB水平均顯著升高，表明其與CHB疾病發(fā)展相關(guān)。Pearson相關(guān)性分析顯示Th17/Treg與患者血清炎性因子IL-17呈顯著正相關(guān)，說明Th17、Treg可能與CHB的發(fā)生及發(fā)展過程相關(guān)。ROC曲線分析顯示Th17/Treg的AUC面積為0.753，截斷值為0.853 1，表明Th17/Treg比值大于0.853 1時有可能患有CHB，其表達(dá)水平可作為臨床早期診斷CHB的理論依據(jù)。

CTGF屬于CNN多肽家族，是TGF-β的下游效應(yīng)介質(zhì)，能夠誘導(dǎo)纖維母細(xì)胞基因的表達(dá)、誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖、分化[16]。肝臟纖維化是機(jī)體肝臟組織受到長期炎癥刺激產(chǎn)生的病理狀態(tài)[17]。機(jī)體正常狀態(tài)下，TGF-β表達(dá)量少，在肝臟纖維化過程中，其在纖維間隔、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞等表達(dá)升高，CTGF也表達(dá)升高，且隨纖維化程度升高表達(dá)增加，CTGF的高表達(dá)與肝臟纖維化程度密切相關(guān)[18]。ABOU-SHADY等[19]研究表明肝硬化組織標(biāo)本中CTGF mRNA表達(dá)升高，提示其與肝纖維化相關(guān)。研究表明IL-17可以激活肝星狀細(xì)胞，而CTGF主要來源于肝星狀細(xì)胞，在HBV感染的患者中Th17細(xì)胞分泌IL-17顯著升高，上調(diào)CTGF表達(dá)[20]。本研究結(jié)果顯示患者血清CTGF水平顯著升高，CTGF與IL-17、Th17呈顯著正相關(guān)，與Treg呈顯著負(fù)相關(guān)，CTGF與Th17/Treg比值呈顯著正相關(guān)，表明IL-17的增加促進(jìn)CTGF的分泌。CTGF與Th17/Treg平衡在CHB的發(fā)展過程中具有重要作用。ROC分析顯示CTGF的AUC面積為0.695，截斷值為24.191 5 ng/mL，表明CTGF可作為CHB臨床早期診斷指標(biāo)。

4 結(jié) 論

CHB患者血清CTGF隨肝纖維化程度加重而增加，CTGF與Th17/Treg呈顯著正相關(guān)，且二者均可作為CHB患者的早期臨床檢測指標(biāo)，但本研究由于樣本數(shù)量較少，未對遠(yuǎn)期療效進(jìn)行隨訪，存在不足之處，今后將重視擴(kuò)大樣本數(shù)量進(jìn)行深入研究。