自身抗體及生化指標(biāo)在原發(fā)性膽汁性肝硬化診斷中的應(yīng)用

張佳婕，蔡 強(qiáng)，鄧紅艷，李引鈺，薛富海，盛尚春△

(1.成都大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科，四川成都 610081；2.宜賓市第二人民醫(yī)院兒科，四川宜賓 644000)

原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)，又稱為原發(fā)性膽汁性膽管炎，是慢性自身免疫性肝臟疾病的一種，其病因不明，主要特點(diǎn)是肝內(nèi)膽管進(jìn)行性破壞，從而導(dǎo)致膽汁淤積，并可進(jìn)展為肝硬化或肝功能衰竭，甚至是肝細(xì)胞癌[1]。PBC一般可分為臨床前期、無癥狀期、癥狀期和失代償肝硬化期4個階段，該病可從無癥狀期遷延數(shù)年甚至數(shù)十年[2]。大約20%的PBC患者早期表現(xiàn)為疲勞和瘙癢[3]，由于該病早期癥狀與病毒性肝炎相似，且二者都可能出現(xiàn)血清生化指標(biāo)異常，故常容易漏診或誤診。目前，該病尚無理想的治療方法，疾病早期使用熊去氧膽酸(UDCA)可以改善血清生化指標(biāo)延緩病情[4]，但是約三分之一的患者對UDCA表現(xiàn)為不耐受，而在失代償期常規(guī)治療手段已無力，只有肝臟移植才能挽救患者生命[5]，所以對該病的診斷和治療越早越好。目前，已公認(rèn)PBC患者血清中常常出現(xiàn)抗線粒體抗體(AMA)，尤其以M2型抗體(AMA-M2)陽性為主要特征[5]。因此，檢測出PBC的特異性自身抗體和生化指標(biāo)的變化對診斷和進(jìn)一步治療有重要作用。本研究旨在探討自身抗體及生化指標(biāo)在PBC診斷中的價值，為臨床診斷提供實驗室依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 根據(jù)臨床診療結(jié)果及實驗室檢測指標(biāo)進(jìn)行回顧性分析，選取2017年1-12月成都大學(xué)附屬醫(yī)院住院治療的PBC患者41例作為PBC組，其中男6例(14.63%)，女35例(85.37%)，年齡38～88歲，平均(56.24±14.72)歲。另收集病毒性肝炎患者65例作為病毒性肝炎組，包括乙型肝炎35例，丙型肝炎18例，戊型肝炎6例，甲型肝炎6例，其中男29例(44.62%)，女36例(55.38%)，年齡26～88歲，平均(54.28±17.69)歲。同期在醫(yī)院體檢健康者50例作為健康對照組，其中男21例(42.00%)，女29例(58.00%)，年齡20～76歲，平均(50.92±16.02)歲。各組性別和年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 病例納入診斷標(biāo)準(zhǔn) PBC的臨床診斷：參照2009年美國肝病研究協(xié)會(AASLD)對PBC的診斷建議[6]。符合3個標(biāo)準(zhǔn)中的兩項則可診斷PBC:(1)反映膽汁淤積的生化指標(biāo)如堿性磷酸酶(ALP)升高；(2)患者血清AMA或AMA-M2陽性；(3)患者血清AMA及AMA-M2陰性，但肝穿刺病理符合PBC。慢性乙型肝炎的診斷符合2015年慢性乙型肝炎防治指南[7]；丙型肝炎的診斷符合2015年丙型肝炎防治指南[8]；戊型肝炎和甲型肝炎的診斷分別符合戊型病毒性肝炎診療規(guī)范[9]和甲型病毒性肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]。

1.3 儀器與試劑 OLYMPUS BX51熒光顯微鏡、EUROBlotMaster 44半自動免疫印跡儀、EUROLINEScan掃描儀、OLYMPUS AU5400全自動生化分析儀。間接免疫熒光法采用歐蒙(杭州)醫(yī)學(xué)實驗診斷有限公司生產(chǎn)的自身抗體譜IgG檢測試劑盒。免疫印跡法檢測試劑采用歐蒙(杭州)醫(yī)學(xué)實驗診斷有限公司生產(chǎn)的抗肝抗原譜抗體IgG試劑盒。生化指標(biāo)采用中生北控生物科技有限公司生產(chǎn)的相應(yīng)檢測試劑盒。

1.4 方法

1.4.1 樣本采集 符合上述標(biāo)準(zhǔn)的人群采用真空血清采血管按常規(guī)采血步驟采空腹血3 mL，1 h內(nèi)以3 000 r/min離心10 min，血清完全分離后檢測。

1.4.2 間接免疫熒光法 自身抗體譜IgG試劑生物載片上包被4種基質(zhì)抗原：Hep-2細(xì)胞(人)、猴肝、大鼠胃、大鼠腎，可檢測抗核抗體(ANA)、AMA、抗平滑肌抗體(ASMA)和抗肝腎微粒體抗體(LKM)。按照試劑盒說明書操作，每批次均設(shè)置試劑盒自帶的陰性對照和陽性對照，在熒光顯微鏡下觀察特異性綠色熒光，血清稀釋度≥1∶100判斷為陽性。

1.4.3 免疫印跡法 抗肝抗原譜抗體IgG試劑盒可檢測AMA-M2、2-酮酸脫氫酶復(fù)合體(M2-3E，又名BPO)、肝腎微粒體抗體(LKM-1)、抗可溶性肝抗原/肝胰抗原抗體(SLA/LP)、抗肝細(xì)胞溶質(zhì)抗原1型(LC-1)抗體。血清1∶100稀釋，用EUROBlotMaster 44半自動免疫印跡儀按照試劑盒說明書操作，每批次均設(shè)置陰性對照和陽性對照，實驗結(jié)果通過掃描儀掃描膜條，用EUROLINEScan軟件判斷陰陽性。

1.4.4 酶比色法 OLYMPUS AU5400全自動生化分析儀測定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、ALP、γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶(GGT)、總膽紅素(TBil)和膽汁酸(TBA)。所有實驗步驟均按照說明書嚴(yán)格操作。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。計數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，陽性率比較采用χ2檢驗；計量資料偏態(tài)分布，以[M(P25,P75)]表示，兩個獨(dú)立樣本的比較采用Mann-WhitneyU檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 熒光核型檢出率 PBC組ANA陽性率為97.50%，其中10例(24.39%)熒光強(qiáng)度為1∶100，23例(56.10%)熒光強(qiáng)度為1∶320，7例(17.07%)熒光強(qiáng)度為大于或等于1∶1 000。熒光核型以核顆粒型和胞漿顆粒型為主,檢出的核型分別為胞漿顆粒型56.10%(23/41)、核顆粒型21.95%(9/41)、著絲點(diǎn)型7.32%(3/41)、核膜型7.32%(3/41)和核點(diǎn)型4.88%(2/41)。見圖1。以上單一核型占75.61%(31/41)，混合核型占21.95%(9/41)，分別為核顆粒型與胞漿顆粒型混合(3/41)、核膜型與胞漿顆粒型混合(4/41)、核顆粒型與著絲點(diǎn)型混合(2/41)。病毒性肝炎組和健康對照組ANA為低滴度(1∶100)核顆粒型。PBC組ANA及AMA陽性率高于病毒性肝炎組和健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，病毒性肝炎組與健康對照組ANA與AMA比較，以及ASMA和LKM各組間兩兩比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組間接免疫熒光法檢測結(jié)果比較[n(%)]

2.2 相關(guān)自身抗體檢出率 PBC組AMA-M2、M2-3E檢出率分別與病毒性肝炎組、健康對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；病毒性肝炎組與健康對照組AMA-M2與M2-3E比較，以及LKM-1、SLA/LP、LC-1各組間兩兩比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。PBC組至少1種抗體為陽性的患者占92.68%(38/41)，1例患者表現(xiàn)為AMA-M2和SLA/LP同時陽性。見表2。

注：A核顆粒型；B核點(diǎn)型；C核膜型；D著絲點(diǎn)型；E胞漿顆粒型；F核顆粒+胞漿顆粒型；G核膜+胞漿顆粒型；H核顆粒+著絲點(diǎn)型

圖1 PBC患者ANA熒光核型

2.3 各組生化指標(biāo)檢測結(jié)果比較 PBC組GGT、ALP水平顯著高于病毒性肝炎組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；兩組間其余指標(biāo)ALT、AST、TBil、TBA水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。PBC組、病毒性肝炎組與健康對照組ALT、AST、GGT、ALP、TBil和TBA水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。PBC組中，AMA-M2陰性組和AMA-M2陽性組之間生化指標(biāo)比較，M2-3E陰性組和M2-3E陽性組之間生化指標(biāo)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表3 各組生化指標(biāo)檢測結(jié)果比較[M(P25,P75)]

續(xù)表3 各組生化指標(biāo)檢測結(jié)果比較[M(P25,P75)]

注：U1(P1)值為PBC組與病毒性肝炎組比較；U2(P2)值為PBC組與健康對照組比較；U3(P3)值為病毒性肝炎組與健康對照組比較

表4 PBC組中各亞組生化指標(biāo)比較[M(P25,P75)]

3 討 論

流行病學(xué)調(diào)查表明PBC主要發(fā)病的人群為中年女性，男女發(fā)病比例為1∶12[5]。PBC患者有兩類自身抗體，ANA類和AMA類，包括AMA-M2等亞型[11]。雖然ANA是非特異性自身抗體，但有些熒光核型可高頻率出現(xiàn)在某些疾病中，因此，ANA的檢測在許多自身免疫性疾病的診斷中起著重要的作用[12]。本研究中ANA陽性率為97.50%，陽性率高出報道28.3%[13]。有研究報道PBC中常見的ANA核型為著絲點(diǎn)型、核膜型和核點(diǎn)型，其中核膜型ANA是PBC的一個特異性血清學(xué)指標(biāo)，它的出現(xiàn)有助于PBC的診斷[14]。本研究中ANA核型依次是胞漿顆粒型、核顆粒型、著絲點(diǎn)型、核膜型和核點(diǎn)型，與上述報道不一致，與周曉冬等[4]的報道基本相符。本研究中單一核型與混合核型比為31∶9，與王晗等[15]報道的混合核型高于單一核型不符，混合型的出現(xiàn)可能與重疊綜合征有關(guān)。上述結(jié)果分析原因， 10名(24.39%)患者中查見1∶100低滴度熒光核型都是胞漿顆粒型和核顆粒型，可能與實驗本底偏高或者與人員判讀差異有關(guān)，導(dǎo)致熒光滴度偏高，出現(xiàn)ANA假陽性和熒光核型的差異，也可能與實驗方法、試劑、地域、人種差異及患者治療階段藥物的影響有關(guān)。此外，核膜型ANA靶抗原是gp210，核點(diǎn)型ANA靶抗原是sp100，并且二者主要出現(xiàn)在AMA陰性PBC患者體內(nèi)[11]，本研究間接免疫熒光法檢測AMA陽性率為73.17%，僅有26.83%患者AMA是陰性，故檢測到的核膜型和核點(diǎn)型ANA數(shù)量相對較少。此外，其他自身免疫性疾病患者、伴有腫瘤、內(nèi)分泌性疾病等其他基礎(chǔ)疾病患者甚至健康老年人體內(nèi)也可查見低滴度ANA，因此，高熒光強(qiáng)度ANA提示患者可能有自身免疫性疾病，可作為PBC的篩查指標(biāo)。

AMA可在多種自身免疫性疾病和感染性疾病中出現(xiàn)[16]，但其主要存在于PBC患者體內(nèi)。AMA有9個亞型，其中4個與PBC相關(guān)聯(lián)：AMA-M2，AMA-M4，AMA-M8和AMA-M9，其中95%的PBC患者中可發(fā)現(xiàn)AMA-M2[17]。AMA-M2是診斷PBC的標(biāo)志性抗體，甚至在缺乏臨床癥狀，無膽汁淤積，或者是ALP水平正常的情況下，也可檢出AMA-M2，因此，有學(xué)者提出將AMA-M2直接作為PBC的診斷標(biāo)準(zhǔn)[18]。BPO是由天然M2抗體的靶抗原丙酮酸脫氫酶復(fù)合體E2 亞基(PDC-E2)與酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體E2 亞基及丙酮酸脫氫酶復(fù)合體側(cè)鏈E2 亞基三者組成的融合蛋白[11]。研究報道AMA-M2和M2-3E陽性率分別為70.31%和81.25%[4]，本研究中二者陽性率比以上報道高，但M2-3E陽性率(85.37%)比AMA-M2陽性率(80.49%)高與文獻(xiàn)[4]報道結(jié)果相符。因此AMA-M2與M2-3E聯(lián)合檢測可提高PBC的陽性率，尤其是M2-3E單獨(dú)陽性患者要高度懷疑PBC，最好結(jié)合肝組織活檢有利于疾病診斷。若能采用同時包被有AMA-M2、M2-3E、gp210和sp100抗原的條帶進(jìn)行檢測，更能降低漏診率，提高檢測靈敏度和特異度。本研究中1例患者除了檢出AMA-M2、M2-3E，還檢出了SLA/LP抗體，SLA/LP是診斷AIH的特異性標(biāo)志物，說明該患者有重疊綜合征。

PBC主要病變是肝內(nèi)膽管的進(jìn)行性破壞從而導(dǎo)致膽汁淤積，因此，反映膽汁淤積的生化指標(biāo)會出現(xiàn)不同程度的升高。病毒性肝炎是由肝炎病毒引起的以肝臟炎癥和壞死為主的傳染病。本文中PBC組與病毒性肝炎組肝功指標(biāo)均出現(xiàn)不同程度的升高，說明二者都出現(xiàn)了肝細(xì)胞損害，但PBC組GGT及ALP顯著高于病毒性肝炎組，說明PBC患者肝內(nèi)膽管損害和膽汁淤積更加嚴(yán)重。有研究指出，血清ALP升高不僅是肝內(nèi)膽汁淤積的指標(biāo)，更可以反應(yīng)PBC的嚴(yán)重程度。也有研究指出ALP、TBil、TBA血清濃度與PBC的發(fā)展甚至惡化有顯著聯(lián)系[19-21]?？怪z點(diǎn)抗體陽性患者可能出現(xiàn)更高的ALP水平，更易發(fā)展為肝硬化、門脈高壓和肝衰竭[22]。有報道指出AMA陽性患者與AMA陰性患者在臨床表現(xiàn)、血清生化特征、組織病理特征、病程進(jìn)展或?qū)DCA治療的反應(yīng)無明顯區(qū)別，只是AMA陰性PBC患者的預(yù)后更差[17]。本研究比較了AMA-M2陰/陽性組和M2-3E陰/陽性組之間的生化指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)AMA-M2、M2-3E與肝功能損害無相關(guān)性，與其他研究報道結(jié)果相符[4]。

4 結(jié) 論

PBC患者可檢測出多種ANA熒光核型，AMA、AMA-M2、M2-3E等自身抗體在PBC患者中有較高檢出率，特別是AMA-M2與M2-3E聯(lián)合檢測可提高PBC陽性率，尤其是M2-3E單獨(dú)陽性患者要高度懷疑PBC。若上述任何一種抗體單獨(dú)出現(xiàn)并且生化肝功指標(biāo)升高，特別是ALP、GGT顯著升高，都提示可能是PBC早期。此外，要高度重視極少數(shù)預(yù)后更差的患者，其AMA-M2和/或M2-3E抗體陰性但肝功指標(biāo)異常升高，需要結(jié)合組織病理結(jié)果等進(jìn)一步檢查才能幫助臨床及早對PBC患者作出診斷和鑒別診斷，降低誤診和漏診，使患者得到合理及時的治療，改善預(yù)后。