蔬菜中五氯硝基苯和百菌清殘留測(cè)定的QuEChERS應(yīng)用與優(yōu)化

徐緯，劉天潔，黃琴

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院 環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550025； 2.四川省自貢市疾病預(yù)防與控制中心， 四川 自貢 643000)

蔬菜農(nóng)藥殘留會(huì)對(duì)人體健康造成嚴(yán)重影響[1]。五氯硝基苯和百菌清屬保護(hù)性殺菌劑，前者對(duì)蔬菜苗期病害防治效果較好，但其毒性危害、環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留等問題日益突出，已在多個(gè)國家被禁用或限制使用[2]；后者對(duì)多種作物真菌病害具有預(yù)防作用，黏著性較好、但殘效期長，對(duì)生態(tài)環(huán)境和食品安全具有潛在威脅[3]。我國對(duì)蔬菜中五氯硝基苯和百菌清殘留均規(guī)定了檢測(cè)方法和限量標(biāo)準(zhǔn)[4-5]，但其檢測(cè)方法的樣品前處理操作較為復(fù)雜。樣品前處理是影響檢測(cè)速度和準(zhǔn)確度的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，目前農(nóng)藥殘留檢測(cè)前處理技術(shù)主要有固相萃取、固相微萃取、分散固相萃取(QuEChERS)、凝膠凈化、超臨界液體萃取及分子印跡技術(shù)等[6-7]，其中QuEChERS是近年發(fā)展起來的一種快速樣品前處理技術(shù)，其回收率高、分析速度快、溶劑使用量少、操作簡便，現(xiàn)已逐步應(yīng)用于農(nóng)藥殘留檢測(cè)中[8-9]。本文在以前研究基礎(chǔ)上[10-16]，優(yōu)化建立了氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)測(cè)定蔬菜中五氯硝基苯和百菌清殘留量的QuEChERS 樣品前處理方法，其應(yīng)用將有利于降低環(huán)境污染、保障分析人員健康和促進(jìn)食品中農(nóng)藥殘留監(jiān)測(cè)水平提升?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

5957C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent公司)，DN-24W型氮?dú)獯蹈蓛x(上海比朗儀器制造有限公司)，AL204-1C型分析天平(Mettler Toledo公司)，XH-1型渦旋混勻器(江蘇康健醫(yī)療用品有限公司)，543OR型離心機(jī)(Eppendorf公司)，弗羅里矽固相萃取柱(Florisil-SPE柱，北京振翔科技有限公司)，QuEChERS柱(CNW公司)。五氯硝基苯標(biāo)準(zhǔn)品(99.0%，C16730000，Dr.Ehrenstorfer GmbH)，百菌清標(biāo)準(zhǔn)品(98.0%，C11510000，Dr.Ehrenstorfer GmbH)，正己烷、乙腈、丙酮 (色譜純)及其他試劑均為分析純?？瞻讟悠窞楝F(xiàn)行農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)DB-1毛細(xì)管柱氣相色譜電子捕獲檢測(cè)法[5]未檢出五氯硝基苯與百菌清殘留的蔬菜，檢測(cè)樣品為市場(chǎng)購買蔬菜。

1.2 方法

1.2.1儀器條件 色譜條件：DB-35 MS石英毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 μm×0.25 μm)，程序升溫(40 ℃保持1 min, 30 ℃/min升溫至130 ℃，5 ℃/min升溫至250 ℃保持5 min)，進(jìn)樣口溫度260 ℃，載氣為高純氦氣(純度>99.999%)，柱流速1.2 mL/min，不分流進(jìn)樣。質(zhì)譜條件：EI離子源溫度230 ℃，電子能量70 eV，傳輸線溫度280 ℃，溶劑延遲10 min，選擇離子掃描(SIM)，五氯硝基苯定量離子295、定性離子237和249，百菌清定量離子266、定性離子264和268。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取五氯硝基苯和百菌清標(biāo)準(zhǔn)品各0.001 g于10 mL容量瓶中，用正己烷溶解并定容，即得0.100 g/L五氯硝基苯和百菌清混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.3樣品的前處理方法 本研究前處理方法：樣品勻漿處理后精密稱取15 g，加入氯化鈉5 g和正己烷20 mL，渦旋混勻5 min，20～30 ℃超聲提取30 min，加入無水硫酸鈉8 g，充分振蕩，4 000 r/min離心5 min，取上清液10.0 mL經(jīng)QuEChERS柱凈化后，氮?dú)獯抵羶舾桑谜和槎ㄈ葜?.0 mL，1.0 uL進(jìn)樣測(cè)定。現(xiàn)行農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 761-2008前處理方法[5]：樣品勻漿處理后精密稱取25.0 g，加入乙腈50.0 mL，高速勻漿2 min后用濾紙過濾，收集濾液40～50 mL至裝有5～7 g氯化鈉的100 mL具塞量筒中，劇烈震蕩1 min，靜置30 min，吸取乙腈溶液10.0 mL于150 mL燒杯中，80 ℃水浴氮?dú)庵两?，加入正己?.0 mL，倒入預(yù)淋洗處理后的Florisil-SPE柱，用5 mL丙酮+正己烷(10+90)沖洗燒杯后淋洗Florisil-SPE柱，重復(fù)1次，收集洗脫液，于50 ℃水浴氮吹至<5 mL，用正己烷定容至5.0 mL，1.0 uL進(jìn)樣測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 QuEChERS條件優(yōu)化試驗(yàn)

2.1.1提取溶劑的選擇 取空白樣品，分別加入五氯硝基苯和百菌清各1、3、5 μg，按1.2.3前處理方法操作，并分別以乙腈和正己烷為提取溶劑，在1.2.1條件下測(cè)定，比較兩者的提取效率，結(jié)果顯示，正己烷的提取效率優(yōu)于乙腈。見圖1。

圖1 不同溶劑對(duì)回收率的影響Fig.1 Effect of different solvents on recovery rate

2.1.2超聲溫度對(duì)提取效率的影響 取空白樣品，加入五氯硝基苯和百菌清各3 μg，按1.2.3項(xiàng)下的前處理方法操作，并改變超聲溫度，在1.2.1條件下測(cè)定。結(jié)果顯示，五氯硝基苯和百菌清的提取效率在20～30 ℃時(shí)最高。見圖2。

圖2 超聲溫度對(duì)提取效率的影響Fig.2 Effect of ultrasound temperature on extraction efficiency

2.2 專屬性試驗(yàn)

取15 g空白樣品，加入50 μL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2.3項(xiàng)下的前處理方法操作，按照1.2.1條件采用全掃描模式測(cè)定，經(jīng)NIST譜庫檢索結(jié)果顯示，色譜峰1為五氯硝基苯、保留時(shí)間為14.128 min，色譜峰2為百菌清、保留時(shí)間為14.966 min，兩峰完全分離。見圖3。

注：1為五氯硝基苯，2為百菌清圖3 五氯硝基苯和百菌清總離子流色譜圖Fig.3 Total ion chromatography of pentachloronitrobenzene and chlorothalonil

2.3 線性關(guān)系試驗(yàn)

2.4 方法檢出限試驗(yàn)

取空白樣品，分別按1.2.3項(xiàng)下的前處理方法和NY/T 761-2008前處理方法操作，在1.2.1條件下連續(xù)測(cè)定11次，以3倍信噪比計(jì)算五氯硝基苯和百菌清的方法檢測(cè)限。結(jié)果表明，本文選用的前處理方法與NY/T 761-2008前處理方法的五氯硝基苯檢出限分別為0.006 7 μg/g和0.007 2 μg/g、百菌清檢出限分別為0.003 2 μg/g和0.004 1 μg/g，本文前處理方法相對(duì)于NY/T 761-2008前處理方法有較高的靈敏度。

2.5 回收率和精密度比對(duì)試驗(yàn)

取同批次蔬菜搗碎勻漿后，精密稱取48份樣品各15 g，均分為兩組，分別按1.2.3項(xiàng)下的前處理方法和NY/T 761-2008前處理方法處理樣品， 按照1.2.1條件進(jìn)行加標(biāo)回收率和精密度試驗(yàn)，結(jié)果顯示，本文采用的前處理方法獲得的五氯硝基苯和百菌清回收率分別為81.2%～84.1%和78.3%～79.0%，RSD分別為4.9%～6.4%和4.5%～5.4%，滿足《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)》要求[17]，相對(duì)于NY/T 761-2008前處理方法具有較好的準(zhǔn)確度和精密度。見表1。

2.6 樣品測(cè)定

分別取3個(gè)批次的蔬菜樣品，按1.2.3方法處理、并在1.2.1儀器條件下測(cè)定，五氯硝基苯和百菌清均未檢出，符合我國國家標(biāo)準(zhǔn)《GB2763 -2016食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定限量要求[4]。

表1 兩種前處理方法的回收率和精密度比較(n=6)Tab.1 The comparison of recovery and precision of two pretreatment methods

3 討論

蔬菜中色素較多，在農(nóng)藥殘留測(cè)定中將增加基質(zhì)干擾，使靈敏度降低，且對(duì)色譜柱污染較為嚴(yán)重，故在樣品前處理中有效去除色素較為關(guān)鍵。本文比較農(nóng)藥殘留檢測(cè)中常用的乙腈和正己烷兩種提取溶劑，因乙腈極性較大，并能與水互溶，導(dǎo)致提取液中水溶性色素等雜質(zhì)增加，故乙腈提取液相對(duì)于正己烷提取液顏色較深；另乙腈沸點(diǎn)高于正己烷，故其提取液濃縮時(shí)間較長，將增大目標(biāo)物損失的可能性。從圖1可以看出，正己烷對(duì)目標(biāo)物的提取率較高，并能有效分離去除水溶性雜質(zhì)，縮短樣品前處理時(shí)間。通過比較QuEChERS和Florisil-SPE兩種樣品凈化方式，QuEChERS凈化柱對(duì)目標(biāo)物吸附損失較小，且除雜效果較好，操作較簡便，溶劑用量較少，能有效提高檢測(cè)的靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度，故其在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中將更容易被推廣使用。樣品前處理過程中，超聲溫度對(duì)農(nóng)藥殘留測(cè)定結(jié)果影響較大，溫度過低則目標(biāo)物提取效率較低，溫度過高則目標(biāo)物揮發(fā)損失較大。圖2表明，五氯硝基苯和百菌清的超聲提取溫度在20～30 ℃時(shí)較為適宜。

由于近年來農(nóng)藥限制使用及其殘留量監(jiān)測(cè)力度加強(qiáng)，且采樣時(shí)期恰逢雨季，較難在市場(chǎng)上采集到五氯硝基苯和百菌清殘留的樣品，故樣品測(cè)定時(shí)均未檢出五氯硝基苯和百菌清，但從本文專屬性、檢出限、精密度、回收率等方法學(xué)試驗(yàn)和方法比對(duì)試驗(yàn)可以看出，本文方法同時(shí)測(cè)定蔬菜中五氯硝基苯和百菌清殘留具有較好的適用性和優(yōu)越性。本文在前研究基礎(chǔ)上，經(jīng)方法學(xué)試驗(yàn)和方法比對(duì)試驗(yàn)，優(yōu)化建立了GC-MS測(cè)定蔬菜中五氯硝基苯和百菌清殘留量的QuEChERS 樣品前處理新方法，該方法具有提取效率高、除雜效果好、操作簡便、溶劑使用量少等特點(diǎn)，縮短了樣品前處理時(shí)間，提高了蔬菜中五氯硝基苯和百菌清檢測(cè)的靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度，適用于蔬菜中五氯硝基苯和百菌清殘留量同時(shí)測(cè)定，能為其他農(nóng)藥殘留檢測(cè)提供方法參考，促進(jìn)食品農(nóng)藥殘留監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)提升，并對(duì)QuEChERS前處理方法推廣應(yīng)用具有積極作用。