促紅細胞生成素通過AMPK-KLF2信號通路調(diào)節(jié)腦缺血后血管新生的分子機制*

劉敏， 王英， 王敬東， 張鳳香， 李紅燕

(青島大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院 重癥醫(yī)學科， 山東 青島 266042)

促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)是一種糖蛋白激素，是哺乳動物調(diào)節(jié)紅細胞生成必不可少的體液性生長因子[1]。在臨床上，EPO多用于治療腎功能不全合并的貧血、惡性腫瘤伴發(fā)的貧血及風濕病貧血等[2-3]。有研究表明他汀類藥物能通過激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子KLF2的表達、增加NO的合成、并作用于血管內(nèi)皮細胞，從而促進血管新生[4-7]。血管新生是影響動脈粥樣硬化及多種缺氧、缺血性心血管疾病的病程發(fā)展和轉(zhuǎn)歸的重要因素[8]。Dorsomorphin (Compound C) 2HCl是一種有效的、可逆的、選擇性AMPK抑制劑。本研究旨在通過構(gòu)建大腦中動脈栓塞動物模型，給予Compound C干預，觀察動物新生血管數(shù)目及AMPK-KLF2信號通路mRNA和蛋白的表達情況，探究EPO通過AMPK-KLF2信號通路調(diào)節(jié)腦缺血后血管新生的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級24周雄性SD大鼠92只，體質(zhì)量250～280 g，由青島大學醫(yī)學院動物實驗中心提供(合同號2018-0216)。

1.2 動物分組與造模

1.2.1大腦中動脈栓塞(MCAo)模型的建立 參考畢方方等[8]方法進模：取250～280 g大鼠76只，4%水合氯醛麻醉固定，于頸正中縱切口，暴露右側(cè)頸內(nèi)動脈、頸總動脈和頸外動脈，準備兩個動脈夾、一個動脈夾夾住頸總動脈的向心端，一個動脈夾夾住頸內(nèi)動脈的遠心端；用線結(jié)扎頸外動脈遠心端，在頸外動脈的向心端的管壁上剪“V”形切口，通過自制4-0線栓經(jīng)過切口繞過頸動脈竇向頸內(nèi)動脈放置，結(jié)扎勁外動脈“V”切口下方；打開頸內(nèi)動脈動脈夾，再打開頸總動脈動脈夾。另16只大鼠(假手術(shù)組)只做手術(shù)、分離血管，但不夾閉或結(jié)扎任何血管、亦不放置線栓及不在外動脈上做切口。

1.2.2分組 24周清潔級雄性SD大鼠92只，16只大鼠用于假手術(shù)組，76只大鼠造模成功的64只，隨機均分成腦缺血組、Compound C組、EPO組及EPO+Compound C組，每組16只。腦缺血組大鼠造模后每天腹腔注射生理鹽水，Compound C組在大鼠造模24 h后每天腹腔注射Compound C溶液1 mL，EPO組在大鼠造模24 h后每天注射EPO 1 mL(4 000 UI/kg)。EPO+Compound C組大鼠造模24 h后每天注射 Compound C 和EPO溶液各1 mL，藥物總劑量同Compound C組和EPO組，均注射7 d;假手術(shù)組僅4%水合氯醛麻醉后固定，于頸正中縱切口，暴露右側(cè)頸內(nèi)動脈、頸總動脈和頸外動脈，不夾閉頸內(nèi)動脈和用線結(jié)扎頸外動脈遠心端及在頸外動脈的向心端的管壁上剪“V”形切口。

1.3 新生血管數(shù)目

顯微鏡下觀察，完成造模和干預7 d時取大鼠大腦缺血皮質(zhì)制片，鏡下觀察頂葉缺血周圍區(qū)新生血管并計數(shù)全部新生血管數(shù)目。

1.4 RT-PCR檢測

完成造模和藥物干預7 d時，取200 mg大鼠大腦缺血皮質(zhì)提取總RNA，將組織放入1.5 mL EP管中，加入1 mL Trizol剪碎組織，震蕩30 s，加0.2 mL氯仿，劇烈搖動30 s，室溫3 min；12 000 r/min，4 ℃離心，15 min；計算濃度與純度，-70 ℃保存。采用RT-PCR檢測Krueppel樣因子2(krueppel-like factor 2，KLF2)、內(nèi)皮一氧化氮合酶(eNOS)、血栓調(diào)節(jié)蛋白(thrombomodulin，TM)及血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)mRNA水平；PCR反應體系為10×擴增緩沖液(PCR Buffer×10 μL)、脫氧核苷三磷酸底物(dNTPmix×200 umol/L)、耐熱DNA聚合酶(Taq酶×2.5 μL)、寡聚核苷酸引物(Primer1×40 pmoL，Primer2×40 pmoL)、靶序列模板DNA(1 μg)。反應條件為95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 1 min(40個循環(huán))95 ℃ 30 s，61 ℃ 15 s。取PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果，以β-actin作為參照，計算KLF2、eNOS、TM及VEGFmRNA水平。

表1 引物的核苷酸序列Tab.1 Sequence of the primers

1.5 免疫印跡檢測腦缺血區(qū)域的AMPK及KLF2蛋白表達

取0.1 g腦大鼠大腦缺血皮質(zhì)，加500 μL蛋白裂解液，在冰浴下震蕩0.5 h，將液體移至1.5 mL離心管中，在4 ℃冷凍離心機中12 000 r/min離心20 min，取上清，利用BCA蛋白法對蛋白濃度進行測定。加入適量上樣緩沖液，100 ℃水浴加熱5 min，使蛋白變性，8 000 r/min離心5 min后上樣。通過SDS-PAGE凝膠電泳進行分析，上樣量為20～40 μL/孔，轉(zhuǎn)膜與雜交。

1.6 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 模型成功率評價

76只建模，造模失敗12只，1只不明原因死亡、5只未觀察到神經(jīng)功能缺損、1只死于麻醉過量、3只出現(xiàn)蛛網(wǎng)膜下腔出血、1只在觀察中死亡，(解剖可見左側(cè)腦組織嚴重腫脹)以Fabian的神經(jīng)功能5級標準評分法為標準(≥1分)，造模成功64只，模型成功率達到85.5%。造模成功大鼠手術(shù)后2 h左右清醒、精神萎靡、反應遲鈍、活動及進食減少甚至拒食；大鼠右前肢無力，不能抓桿且爬桿困難；大鼠行走時，身體向右側(cè)旋轉(zhuǎn)或偏斜，身體向右側(cè)旋轉(zhuǎn)或偏斜，甚至向右側(cè)跌倒不能行走，多數(shù)動物出現(xiàn)Homers征。65只大鼠隨機分為4組，棄掉1只。假手術(shù)組大鼠未出現(xiàn)明顯神經(jīng)功能缺損癥狀與體征，手術(shù)后動物進食及活動恢復較好。

2.2 顯微鏡下觀察新生血管數(shù)目

EPO組大腦皮質(zhì)新生血管數(shù)量較腦缺血組增多，差異有統(tǒng)計學意義(27.46±2.58 vs 16.21±1.22，P<0.05)， Compound C組和EPO+Compound C組大鼠大腦皮質(zhì)新生血管數(shù)目少于腦缺血組(12.15±1.27 vs 14.32±2.11，P<0.05)，EPO+Compound C組大鼠大腦皮質(zhì)新生血管數(shù)目多于Compound C組，少于腦缺血組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)， 鏡下新生血管形態(tài)見圖1。

注：A為假手術(shù)組，示正常腦組織形態(tài)；B為腦缺血損傷后出現(xiàn)新生血管，箭頭所指示新生血管處圖1 頂葉缺血周圍區(qū)新生血管形態(tài)Fig.1 Morphology of neovascularization around parietal lobe ischemia

2.3 KLF2、eNOS、TM及VEGF mRNA表達

RT-PCR實驗對各組大鼠大腦缺血皮質(zhì)KLF2、eNOS、TM和VEGF的mRNA的表達量進行測定發(fā)現(xiàn)， EPO組各mRNA的表達量較腦缺血組升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，Compound C組KLF2、eNOS、TM和VEGFmRNA的表達量低于腦缺血組(P<0.05)，EPO+Compound C組KLF2、eNOS、TM和VEGFmRNA的表達量高于Compound C組(P<0.05)，低于腦缺血組，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 mRNA表達量的測定結(jié)果(n=16)Tab.2 Detection results of mRNA expression levels

(1)與腦缺血組比較，P<0.05；(2)與Compound C組比較，P<0.05

2.4 AMPK及KLF2蛋白表達

通過檢測KLF2及AMPK蛋白表達水平發(fā)現(xiàn)，正常組與假手術(shù)組大鼠有少量AMPK及KLF2蛋白表達，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。Compound C組AMPK及KLF2蛋白表達水平低于腦缺血組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，EPO組AMPK蛋白的表達水平與腦缺血組比較有所增加，EPO+Compound C組AMPK及KLF2蛋白的表達水平高于Compound C組，低于腦缺血組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3、圖2。

表3 KLF2及AMPK蛋白的表達水平(n=16)Tab.3 Expression levels of KLF2 and AMPK protein

(1)與腦缺血組比較，P<0.05；(2)與Compound C組比較，P<0.05

圖2 大腦皮質(zhì)AMPK和KLF2蛋白 在不同組別的表達Fig.2 Expression levels of KLF2 and AMPK protein in different groups

3 討論

腦缺血后，血管新生是腦微循環(huán)修復重建的重要病理過程[9]，而神經(jīng)血管單元促成細胞分泌、釋放促血管新生因子，例如EPO、VEGF等，從而促進缺血區(qū)血管生成[10]。有研究指出，EPO的來源有血源性與腦源性兩種，是一種直接促血管新生物質(zhì)，可促進套式血管生長和芽生，促進VEGF的表達，，同時促進腦血管新生和骨髓造血[11]。另EPO為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)源性的細胞因子，可通過神經(jīng)元與膠質(zhì)細胞的旁分泌作用，作用至神經(jīng)元EPO-R，并發(fā)揮神經(jīng)保護、神經(jīng)營養(yǎng)及調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育的作用[12]。據(jù)報道，EPO可引起AMPK和eNOS的磷酸化作用[13]，在此過程中，同時促進了KLF2蛋白質(zhì)的表達水平[14]。復合物C或Ad-AMPK-DN抑制AMPK后限制了KLF2的表達上調(diào)，這是一種重組腺病毒，它編碼了AMPK的顯性負突變體[15-16]。本研究以Compound C為抑制劑成功建立了AMPK缺陷腦缺血大鼠模型。有研究表明，KLF2的敲除降低了eNOS和VEGF，并限制了紅細胞生成素的遷移和內(nèi)皮細胞集落形成新生血管的能力[17]。故AMPK通路中KLF2表達的上調(diào)在EPO誘導血管生成中起著至關重要的作用[18-19]。本研究表明，EPO治療+Compound C干預組各mRNA的表達量高于Compound C干預組，由此結(jié)果可以推測出，加入AMPK抑制劑后，KLF2的表達量下降，并且eNOS、TM、VEGF等mRNA的表達量均呈現(xiàn)下降的趨勢。據(jù)報道，EPO可以激活AMPK蛋白激酶，提高ECs分化，最終促進血管新生。另有研究者認為，EPO的血管生成效應是通過VEGF/KDR完成的[20,21]。相反，也有研究指出，由EPO控制的ECFCs的血管生成能力依賴于AKT而不是VEGF[22]。但在ECFCs中EPO的血管生成效應以及相關的分子機制，特別是轉(zhuǎn)錄水平的機制，仍然不清楚。而本實驗研究發(fā)現(xiàn)，EPO治療組新生血管數(shù)量較腦缺血組增多，EPO治療+Compound C干預組新生血管數(shù)目多于Compound C干預組。同時， AMPK及 KLF2蛋白表達量測定結(jié)果表明，EPO治療+Compound C干預組AMPK及 KLF2蛋白的表達量高于Compound C干預組，故推測EPO可通過促進AMPK及 KLF2蛋白的表達量，激活AMPK，上調(diào)KLF2的表達，促進內(nèi)皮一氧化氮合酶(eNOS)表達，進而增加NO產(chǎn)生，促使內(nèi)皮克隆形成細胞向內(nèi)皮細胞分化，進而提高血管新生。

綜上所述，EPO可通過上調(diào)KLF2、eNOS、TM、VEGFmRNA的表達量，促進AMPK蛋白的表達進而調(diào)節(jié)腦缺血后血管新生。