阿司匹林磷脂復(fù)合物脂微球的制備及評價(jià)*

賀智勇， 姜豐， 李婉蓉， 楊佳佳， 周雪， 吳林菁， 肖婷， 沈祥春， 陶玲

(貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴州省天然藥物資源高效利用工程中心， 貴州省高等學(xué)校天然藥物藥理與成藥性評價(jià)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州醫(yī)科大學(xué)貴陽市聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 天然藥物資源優(yōu)效利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550025)

近年來，血栓性疾病上升趨勢迅猛，嚴(yán)重威脅人類的生命健康，是當(dāng)代醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)之一。研究表明，血管內(nèi)皮損傷是形成血栓的主要原因[1]。阿司匹林(asprin，ASP)在臨床應(yīng)用已有上百年的歷史，30年來小劑量服用ASP廣泛用于抑制血小板凝集、可有效預(yù)防由血栓引發(fā)的心腦血管疾病[2]，并在抗腫瘤[3]、抑制動(dòng)脈粥樣硬化[4]、抑制心肌纖維化中有防治作用[5]，在抑制肺間質(zhì)纖維化[6]等方面也體現(xiàn)較好療效。但ASP對胃腸道具有顯著的刺激作用，甚至伴隨有胃出血的風(fēng)險(xiǎn)。脂微球(lipid microspheres，LM)是一種將藥物溶解或者分散在脂肪油中，以脂肪油為軟基質(zhì)并被磷脂膜包封的微粒分散體系[7-11]，具有靶向性、緩釋性等作用，特別是可以選擇性蓄積于血管內(nèi)皮損傷部位。 本研究前期成功制備了阿司匹林磷脂復(fù)合物(ASP-PC)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行阿司匹林磷脂復(fù)合物脂微球(ASP-PC-LM)的制備研究，以期為心腦血管疾病藥物提供更多的遞送系統(tǒng)參考。

1 儀器與材料

1.1 藥品與試劑

阿司匹林(阿拉丁試劑上海有限公司，批號D1316056，純度99%)，阿司匹林磷脂復(fù)合物(自制)，15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯(Killiphor HS 15徳國巴斯夫公司，批號0339458800)，注射用大豆磷脂(上海太偉藥業(yè)有限公司，磷脂酰膽堿含量≥90%，批號20140702)，辛癸酸甘油酯(MCT，上海佑創(chuàng)實(shí)業(yè)有限公司)，橄欖油(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號20131703)，油酸(國藥集團(tuán)工業(yè)股份有限公司，批號20131126)。

1.2 主要儀器

BT-9300H型激光粒度分布儀(丹東百特儀器有限公司)，80-2型低速離心機(jī)(上海手術(shù)器械廠)，PHD D-3L型高壓均質(zhì)機(jī)(美國PHD科技有限公司)，NANOJ H10型高速剪切乳化機(jī)(ATS工業(yè)系統(tǒng)有限公司)，電子天平(北京賽多利斯儀器有限公司)，1290型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)，Delsa Nano Zeta型電位及納米粒度分析儀(英國馬爾文公司)。

1.3 方法

1.3.1色譜條件 Ultimate?UHPLC AQ-C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)，流速0.5 mL/min，進(jìn)樣量0.5 μL，柱溫40 ℃，檢測波長276 nm和303 nm，流動(dòng)相為乙腈-冰醋酸-四氫呋喃-水(20∶5∶5∶70)。

1.3.2ASP和水楊酸(salicylic acid,SA)含量測定方法學(xué)的建立 SA對照品溶液的配制：精密稱取SA對照品15.1 mg，置于50 mL的容量瓶中，加入1%的冰醋酸甲醇溶解并定容，配制成濃度為302 mg/L的SA對照品儲備液。ASP對照溶液的配制：精密稱取ASP對照品15.1 mg，置于50 mL的容量瓶中，加入1%的冰醋酸甲醇溶解并定容，配制成濃度為302 mg/L的ASP對照儲備液。供試品溶液的配制：精密稱取按照最優(yōu)處方制備的ASP-PC-LM適量，置于10 mL的容量瓶，加1%冰醋酸甲醇稀釋并定容?？瞻讓φ杖芤旱呐渲疲壕芊Q取最優(yōu)處方量的空白輔料，置于10 mL的容量瓶，加1%冰醋酸甲醇稀釋并定容。

1.3.3方法學(xué)考察 (1)專屬性試驗(yàn)：精密吸取上述ASP對照品溶液，SA對照品溶液，空白溶液和供試品溶液各0.5 μL進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。(2)線性關(guān)系的考察：精密吸取ASP對照品溶液，配制成濃度分別為15.1、30.2、60.4、120.8、181.2、241.6 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3.1項(xiàng)下色譜條件測定；精密吸取SA對照品溶液，配制成濃度分別為15.1、30.2、60.4、120.8、181.2、241.6 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，同法操作。(3)精密度試驗(yàn)：分別精密吸取中濃度(120.8 mg/L )ASP標(biāo)準(zhǔn)溶液和中濃度(181.2. mg/L)SA標(biāo)準(zhǔn)溶液，連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積，計(jì)算RSD值。(4)重復(fù)性試驗(yàn)：精密吸取低(30.2 mg/L)、中(60.4 mg/L)、高(120.8 mg/L)濃度項(xiàng)下的ASP標(biāo)準(zhǔn)溶液以及低(30.2 mg/L)、中(60.4 mg/L)、高(120.8 mg/L)濃度項(xiàng)下的SA標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別連續(xù)測定3次，記錄峰面積，計(jì)算RSD值。(5)穩(wěn)定性試驗(yàn)：分別精密吸取中濃度(120.8 mg/L)ASP標(biāo)準(zhǔn)溶液和中濃度(121.2 mg/L)SA標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別于0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣測定其峰面積，計(jì)算日內(nèi)RSD值。(6)加樣回收率試驗(yàn)：在回收率試驗(yàn)中，按主藥含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)的80%、100%、120% 取ASP和SA對照品各3份，加入空白脂微球遞送系統(tǒng)，計(jì)算平均回收率和RSD值。

1.3.4包封率的測定 取5 mL的ASP-PC-LM至超濾管中，采用截留分子量為3 kDa的超濾膜，3 000 r/min離心15 min，收集濾液，直接進(jìn)樣分析，計(jì)算游離藥物含量，并計(jì)算包封率，公式如下。

×100%

1.3.5離心穩(wěn)定性測定 取最優(yōu)處方制備的3批ASP-PC-LM，置于15 mL的離心管中，3 000 r/min離心10 min，用微量移液器取試管底部澄清液體100 μL，置于25 mL量瓶，蒸餾水稀釋并定容，用紫外分光光度計(jì)在500 nm處測定吸光度值A(chǔ)，同法將未離心的乳劑定容離心后，在相同波長處測定吸光度值(A0)，計(jì)算離心穩(wěn)定常數(shù)(Ke)，計(jì)算公式如下為Ke=(A0-A)/A0×100%。

1.4 ASP-PC-LM的制備

取處方量的ASP-PC溶于一定體積的有機(jī)溶劑中，再將處方量的油相，磷脂，穩(wěn)定劑，預(yù)熱至于70℃。高速剪切分散至全部溶解，得油相；將親水性的表面活性劑分散于同溫度的高純水中，得水相；將水相緩慢加入到油相當(dāng)中，高速剪切機(jī)剪切一定時(shí)間后，再移至高壓均質(zhì)機(jī)中，均質(zhì)一定時(shí)間和次數(shù)，得ASP-PC-LM。

1.4.1處方篩選 (1)油相種類的考察：確定ASP-PC為138 mg(相當(dāng)于投藥量為ASP 30 mg)、0.3%的油酸、1.2%的大豆磷脂和2.0%的Kolliphor?HS 15，乳化溫度為70 ℃，乳化時(shí)間為5 min，高速剪切速度為10 000 r/min，均質(zhì)壓力為110 Ma，均質(zhì)次數(shù)為3次，以Ke和平均粒徑為評價(jià)指標(biāo)，固定兩種混合油相MCT ∶大豆油和MCT ∶橄欖油均為1 ∶1，分別稱取10%的兩種混合油相進(jìn)行制備考察。(2)油相用量的考察：參照(1)考察條件，以Ke和平均粒徑為評價(jià)指標(biāo)，考察MCT ∶橄欖油為1 ∶1的混合油相用量分別為10%，15%，20%和30%對于ASP-PC-LM制備的影響。(3)混合油相比例的考察：參照(2)考察條件，以Ke和平均粒徑為評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，考察油相中MCT和橄欖油的比例為1 ∶1和2 ∶1，3 ∶1和1 ∶2時(shí)對ASP-PC-LM制備的影響。(4)水相表面活性劑Kolliphor?HS 15用量的考察：參照(3)考察條件，以Ke和平均粒徑為評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，考察水相表面活性劑Kolliphor?HS 15用量為1.5%，2.0%，2.5%和3.0%對ASP-PC-LM制備的影響。(5)穩(wěn)定劑種類的考察：參照(4)考察條件，以Ke和平均粒徑為評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，考察穩(wěn)定劑種類為油酸、油酸鈉、膽固醇對ASP-PC-LM制備的影響[12]。

1.4.2工藝考察 (1)初乳剪切速度的考察：參照1.4.1處方最優(yōu)條件，以Ke和平均粒徑為評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，考察剪切速度為10 000 r/min、13 000 r/min、16 000 r/min、19 000 r/min對ASP-PC-LM制備的影響。(2)初乳剪切時(shí)間的考察：參照(1)考察條件，以Ke和平均粒徑為評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，考察初乳乳化時(shí)間分別為3 min、5 min、7 min和9 min對ASP-PC-LM制備的影響。(3)高壓均質(zhì)壓力的考察：參照(2)考察條件，以Ke和平均粒徑為評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，考察均質(zhì)壓力分別為70 MPa、90 MPa、110 MPa和120 MPa對ASP-PC-LM制備的影響。(4)高壓均質(zhì)次數(shù)的考察：參照(3)考察條件，以Ke和平均粒徑為評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，考察均質(zhì)次數(shù)分別為5次、7次和9次對ASP-PC-LM制備的影響。

1.4.3最佳處方工藝驗(yàn)證 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，得最佳處方工藝條件，即得ASP-PC-LM，同法制備3份，測定Ke和平均粒徑、包封率。

1.5 ASP-PC-LM的藥劑學(xué)性質(zhì)考察

1.5.1外觀形態(tài)觀察 取最優(yōu)處方制備的ASP-PC-LM，目測其外觀，顏色以及流動(dòng)性；然后用超純水稀釋分散均勻，滴至附有支持網(wǎng)膜的銅篩網(wǎng)上，用體積分?jǐn)?shù)為2%的磷鎢酸負(fù)染色，用濾紙吸走多余的液體，室溫下自然干燥后于透射電鏡下觀察，并拍照，觀察脂微球的物理形態(tài)。

1.5.2粒徑和Zeta電位 取最優(yōu)處方制備的ASP-PC-LM，純化水稀釋，25 ℃條件下，采用激光粒度分析儀及Zeta電位測定平均粒徑及其粒徑分布、Zeta電位。

1.5.3初步穩(wěn)定性考察 將最優(yōu)處方制備的ASP-PC-LM，置于室溫(25 ℃)和4 ℃下，分別于0、1、3和5 d后，取樣，觀察外觀，測定其粒徑和包封率，并比較其變化；并于48 h內(nèi)于-20 ℃和25 ℃條件下凍融循環(huán)3次，同法觀察。

2 結(jié)果

2.1 ASP-PC-LM含量測定

(1)專屬性試驗(yàn)：圖1顯示空白溶液在ASP和SA相應(yīng)出峰時(shí)間無吸收峰，對測定無干擾，ASP、SA與輔料峰分離度良好。(2)線性關(guān)系的考察：以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制ASP標(biāo)準(zhǔn)曲線得A=0.405 8c-1.368 0，r=0.999 8，表明ASP質(zhì)量濃度在15.1～241.6 mg/L范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系；同法操作，繪制SA標(biāo)準(zhǔn)曲線得A=1.412c-2.280 6，r=0.999 9，表明SA質(zhì)量濃度在15.1～241.6 mg/L范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。(3)精密度試驗(yàn)：計(jì)算得RSD分別為0.72%和0.82%，表明儀器精密度良好。(4)重復(fù)性試驗(yàn)：ASP標(biāo)準(zhǔn)溶液低，中，高濃度下的RSD值為0.54%，1.69%和1.55%，SA標(biāo)準(zhǔn)溶液RSD值分別為0.79%、0.66%及0.45%，表明該方法重復(fù)性良好，符合要求。(5)穩(wěn)定性試驗(yàn)：ASP和SA標(biāo)準(zhǔn)溶液RSD值為2.44%和0.92%，表明藥物溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。(6)加樣回收率試驗(yàn)：ASP平均回收率為99.60%(n=9)，RSD為0.90%，SA平均回收率為100.09%(n=9)，RSD為0.60%，表明該方法回收率符合要求。

圖1 對照品及樣品的HPLC色譜結(jié)果Fig.1 HPLC chromatogram of reference substance and sample

2.2 ASP-PC-LM的制備

2.2.1處方的考察 隨著油相用量的增加，粒徑和離心穩(wěn)定常數(shù)均呈先下降后上升的趨勢，當(dāng)橄欖油和MCT以1∶1混合作為油相，且油相用量為15%時(shí)，平均粒徑和離心穩(wěn)定常數(shù)最??；隨著乳化劑用量的增加，粒徑呈先下降后升高的趨勢，故選擇乳化劑用量較少的2.0%為最佳；采用油酸為穩(wěn)定劑時(shí)，粒徑最小。見表1。

2.2.2工藝考察 當(dāng)剪切速度為10 000 r/min；初乳剪切時(shí)間為5 min，均質(zhì)壓力為110 MPa時(shí)，粒徑和離心穩(wěn)定常數(shù)均較??；隨著高壓均質(zhì)次數(shù)的增加，粒徑有所增加但不明顯，考慮到儀器設(shè)備的損耗，選擇較小的均質(zhì)次數(shù)來得到最佳的均質(zhì)結(jié)果，因此選擇均質(zhì)次數(shù)為3次。見表2。

2.2.3最佳處方工藝驗(yàn)證 所得最佳處方工藝條件為ASP-PC為138 mg(投藥量相當(dāng)于ASP為30 mg)，油相為MCT∶橄欖油=1∶1，用量為15%，乳化劑為大豆磷脂1.2%，穩(wěn)定劑為油酸0.3%，預(yù)熱至70 ℃，得油相；Kolliphor?HS 15用量為2%，分散于同溫度的注射用水中，得水相；將水相緩慢加入到油相當(dāng)中，乳化時(shí)間為5 min，剪切速度為10 000 r/min，得初乳，再進(jìn)行高壓均質(zhì)，均質(zhì)壓力為110 MPa，均質(zhì)次數(shù)為3次，即得ASP-PC-LM。測定結(jié)果見表3。

表1 處方考察結(jié)果Tab.1 The investigation results of formulation

表2 工藝考察結(jié)果Tab.2 The investigation results of process

表3 最佳處方工藝考察結(jié)果Tab.3 The inspection results of optimum formulation process

2.3 ASP-PC-LM的藥劑學(xué)性質(zhì)考察

2.3.1外觀形態(tài)觀察 3批最優(yōu)處方制備的ASP-PC-LM，肉眼觀察外觀為乳白色，流動(dòng)性良好。透射電鏡觀察結(jié)果表明ASP-PC-LM乳滴性狀，呈球形或者類球形，分布均一。見圖2。

圖2 ASP-PC-LM透射電鏡圖(15 000×)Fig.2 Transmission electron microscopy of ASP-PC-LM

2.3.2粒徑和Zeta電位 ASP-PC-LM的平均粒徑為(180.2±12.8)nm，多分散系數(shù)為0.136±0.066，粒徑范圍較小，Zeta電位為(-41.23±1.53)mV，為熱力學(xué)穩(wěn)定體系。見圖3和4。

圖3 ASP-PC-LM累積粒徑分布Fig.3 The accumulative total about particle size distribution of ASP-PC-LM

圖4 ASP-PC-LM的Zeta電位Fig.4 Zeta potential of ASP-PC-LM

2.3.3初步穩(wěn)定性考察 ASP-PC-LM在48 h內(nèi)凍融循環(huán)(-20～25)℃ 3次，未出現(xiàn)分層現(xiàn)象；ASP-PC-LM在置于室溫(25 ℃)和4 ℃條件下，于0、1、3和5 d后觀察，其外觀均呈乳白色，未見分層，但室溫(25 ℃)條件下粒徑和包封率變化明顯，而在4 ℃條件下放置5 d后，粒徑和包封率變化均較小，說明ASP-PC-LM更適宜在此條件下短期儲存，但考慮其仍有粒徑增大和包封率下降的趨勢，因此后期考慮進(jìn)行冷凍干燥工藝的考察以期進(jìn)一步提高穩(wěn)定性。

3 討論

脂質(zhì)材料制備的納米遞送系統(tǒng)成為研究的熱點(diǎn)，但是對于水溶性強(qiáng)的藥物，具有載藥量和包封率低的缺點(diǎn)，前期研究表明，單獨(dú)的ASP不論在固體脂質(zhì)材料，還是液體脂質(zhì)材料中，載藥量和包封率都較差。本研究采用磷脂復(fù)合物能改善藥物油水分配系數(shù)的特點(diǎn)，在制備具有良好脂溶性的ASP-PC基礎(chǔ)上，進(jìn)行脂微球遞送系統(tǒng)研究，成功制備了ASP-PC-LM，為脂溶性差的藥物脂質(zhì)材料遞送系統(tǒng)研究提供了一定參考。

在進(jìn)行油相種類的考察時(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期對ASP-PC在大豆油、MCT和橄欖油3種油中的溶解度結(jié)果可知，ASP-PC在MCT中的溶解度相對較高，在橄欖油和大豆油當(dāng)中的溶解度相近。隨著 MCT 量的增加，乳劑的粒徑逐漸減小，可能由于MCT 的黏度較 LCT小，易分散。由于MCT大量攝入，進(jìn)入體內(nèi)透過血腦屏障會產(chǎn)生神經(jīng)衰弱的副作用，因此考慮將MCT和大豆油、橄欖油分別進(jìn)行配比考察，結(jié)果表明，MCT和橄欖油混合作為油相時(shí)，Ke和粒徑都優(yōu)于MCT和大豆油配比。在進(jìn)行油相用量考察時(shí)，用量為10%和15%粒徑和穩(wěn)定性差別不大，但油相用量增加可以增加載藥量和包封率，因此選擇油相用量為15%。脂微球常用的穩(wěn)定劑有油酸和油酸鈉。本研究中發(fā)現(xiàn)，加入穩(wěn)定劑油酸鈉，剪切分散后初乳粒徑較大，很快分層，可能由于油酸鈉水溶性太強(qiáng)，很難附著在油水界面膜上，故只選用油酸作為穩(wěn)定劑。高速剪切速度和時(shí)間均為影響粒徑和穩(wěn)定性的重要因素，本實(shí)驗(yàn)中，時(shí)間的影響更大，剪切過快或者剪切時(shí)間太長都不利于粒子的穩(wěn)定；另外，高速剪切制得的初乳球形均一性差，粒徑范圍較大。采用高壓勻質(zhì)法，利用空穴效應(yīng)、撞擊效應(yīng)、剪切效應(yīng)等可使初乳進(jìn)一步完成分散、乳化、均質(zhì)等工藝過程，使脂微球平均粒徑減小至200 nm左右，粒度分布范圍更小[13-15]。