貴陽地區(qū)5 486例孕婦G6PD缺乏癥基因突變篩查*

李頔， 卓召振， 王怡萌， 熊永紅， 胡莉, 楊國珍， 黃盛文,***

(1．貴州醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州省人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科， 貴州 貴陽 550002)

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)缺乏癥是一種常見的遺傳性酶缺陷疾病， 患者通常在感染或外源性氧化誘導(dǎo)物的作用下發(fā)生紅細(xì)胞破裂，從而出現(xiàn)急性溶血性貧血、黃疸、血紅蛋白尿、 乏力等癥狀，嚴(yán)重者可有胸悶、呼吸困難、休克和腎功能衰竭，威脅患者生命。G6PD缺乏癥是新生兒黃疸的主要危險(xiǎn)因素之一，患兒可發(fā)展為核黃疸，如治療不及時(shí)可導(dǎo)致終生智力低下。因此，對(duì)孕婦進(jìn)行G6PD缺陷癥產(chǎn)前篩查，重點(diǎn)關(guān)注篩查陽性的孕婦，對(duì)可能患有G6PD缺乏癥的患兒采取預(yù)防措施，防止核黃疸的發(fā)生。全球約有4億人為G6PD缺陷癥患者或攜帶者，主要分布在非洲、亞洲的熱帶區(qū)域，尤其以地中海沿岸和中東地區(qū)為主。 G6PD缺陷癥我國主要分布在長江以南的區(qū)域，呈現(xiàn)“南高北低”的分布特點(diǎn)，以海南、廣東、廣西、云南、貴州、四川等省為高發(fā)[1]。為了解貴陽地區(qū)孕婦人群的G6PD缺乏癥發(fā)生率及基因突變類型，本研究對(duì)就診于貴州省人民醫(yī)院的5 486例孕婦進(jìn)行G6PD基因檢測(cè)，結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象與材料

1.1.1研究對(duì)象 2017年6月～2018年6月在產(chǎn)科門診進(jìn)行孕期保健的的孕婦5 486例，21～45歲、平均(29.5±4.8)歲。孕婦填寫產(chǎn)前篩查知情同意書。

1.1.2主要儀器與試劑 Lab-aid 820磁珠法全血DNA提取系統(tǒng)(廈門致善生物科技股份有限公司)，NDLite微量分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific)，SLAN96實(shí)時(shí)熒光PCR儀(上海宏石)，全血DNA快速提取試劑盒和G6PD基因突變檢測(cè)試劑盒購自廈門致善生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1基因組DNA提取 用EDTA-Na2抗凝管采集孕婦外周靜脈血2 mL，用Lab-aid 820磁珠法全血DNA提取系統(tǒng)提取基因組DNA，微量分光光度計(jì)測(cè)定提取的DNA樣本的濃度和純度。

1.2.2PCR擴(kuò)增及熔解曲線分析 每份樣本分兩管進(jìn)行檢測(cè)，分別為G6PD PCR混合液A和G6PD PCR混合液B。PCR擴(kuò)增采用25 μL的反應(yīng)體系，向每只PCR薄壁反應(yīng)管中加入DNA樣本5 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?0 ℃ 2 min→95 ℃ 10 min→[95 ℃ 15 s→65 ℃～56 ℃(每個(gè)循環(huán)下降1 ℃)15 s→76 ℃ 20 s]×10個(gè)循環(huán)→(95 ℃ 15 s→55 ℃ 15 s→76 ℃ 20 s)×50個(gè)循環(huán)，在55 ℃退火階段采集FAM、HEX、ROX和Cy5通道熒光信號(hào)。在實(shí)時(shí)熒光PCR儀上進(jìn)行熔解曲線分析，程序設(shè)置如下：95 ℃ 1 min→35 ℃ 3 min→40 ℃～85 ℃，以0.4 ℃/5 s的升溫速率進(jìn)行熔解曲線分析，在此階段采集FAM、HEX、ROX和Cy5通道熒光信號(hào)。

1.2.3結(jié)果判讀 按照試劑盒說明書，分別對(duì)A管和B管不同通道的熔解曲線進(jìn)行分析，根據(jù)野生型對(duì)照樣本和每個(gè)待測(cè)樣本熔解峰的Tm值差值(ΔTm)判斷樣本是否有G6PD基因突變。A管和B管共檢測(cè)12種突變類型，A管檢測(cè)出c.1360C>T、c.1376G>T，c.1388G>T、c.871G>A、c.1004C>A和c.1024C>T，B管檢測(cè)出c.95A>G、c.383T>C、c.392G>T、c.487G>A、c.592C>T和c.517T>C。

2 結(jié)果

2.1 G6PD基因突變篩查

對(duì)5 486例孕婦的12種G6PD基因突變類型進(jìn)行檢測(cè)，通過熔解曲線分析，每例均獲得明確的G6PD基因型，共有184例檢出攜帶有G6PD基因突變，篩查陽性率為3.35%。

2.2 G6PD基因突變類型

在184例 G6PD基因突變陽性孕婦中，共有15種基因型(表1)，其中雜合突變型10種、復(fù)合突變型4種、純合突變型1種，分別為173例(94.02%)、10例(5.43%)和1例(0.54%)。在12種突變類型種共檢出11種類型，按所占比例排列前5種突變類型依次是c.1388G>A(25.13%)、c.519C>T(21.03%)、c.95A>G(15.38%)、c.1024C>T(13.85%)和c.1376G>T(13.85%)，這5種突變類型共占89.23%，未檢出c.1360C>T(表2)。

3 討論

G6PD缺乏癥屬X連鎖不完全顯性遺傳，其基因定位于Xq28。當(dāng)女性兩條染色體都帶有致病基因，稱為純合子；僅一條X染色體帶有致病基因，稱之為雜合子。男性僅有一條X染色體，攜帶者稱為半合子。女性純合子和男性半合子常伴有嚴(yán)重的G6PD酶缺乏，癥狀較為嚴(yán)重，而女性雜合子的酶活性異質(zhì)性較大，臨床表現(xiàn)輕重不一。我國南方地區(qū)是G6PD缺乏癥的高發(fā)區(qū)，但不同地區(qū)和人群的攜帶率差別較大。文獻(xiàn)報(bào)道廣東和廣西的攜帶率分別為4.2%[2-3]和11.34%[4-5]，部分地區(qū)高達(dá)16%。本研究結(jié)果顯示貴陽地區(qū)孕婦人群的G6PD基因攜帶率為3.35%(184/5 486)，低于貴州荔波苗族(7.68%)[6]、西江苗族(6.5%)[7]，江口土家族(7.49%)[8]和從江縣侗族(6.49%)[9]的基因突變攜帶率，說明貴州少數(shù)民族的G6PD缺乏癥發(fā)生率更高。目前，國內(nèi)報(bào)道的G6PD基因突變類型有30多種，其中最常見的是c.1388G>A、c.95A>G和c.1376G>T。本研究的5種常見突變類型依次是c.1388G>A、c.519C>T、c.95A>G、c.1024C>T和c.1376G>T，占所有突變類型的89.23%，說明不同地區(qū)的常見突變類型有所差異。

表1 184例孕婦G6PD突變基因型Tab.1 G6PD mutant genotype in 184 pregnant women

表2 12種G6PD基因突變類型Tab.2 Gene mutation types of 12 kinds of G6PD

由于部分女性雜合子酶活性降低不明顯，臨床上常用的酶活性檢測(cè)不能篩查出所有的女性純合子，因此，采用分子篩查方法可有效檢測(cè)出女性雜合子。本研究采用多色探針熒光PCR熔解曲線法可同時(shí)檢出12種G6PD基因突變類型，由于其他少見和未知突變類型不在本方法的檢測(cè)范圍內(nèi)，臨床上仍然需要與酶活性檢測(cè)相結(jié)合，并采用序列分析方法提高陽性檢出率，或是采用高通量測(cè)序法對(duì)G6PD基因全長序列進(jìn)行分析，避免少見和未知突變的漏檢[10-11]。

文獻(xiàn)報(bào)道，G6PD缺乏癥的新生兒病理性黃疸發(fā)生率為33.3%，是正常新生兒的3.8倍[12]，尤其是女性純合子和男性半合子發(fā)生率更高。在配偶正常的情況下，雜合子孕婦的新生兒中男性有50%是半合子，女性有50%是雜合子；純合子孕婦的新生兒中男性全是半合子，女性全是雜合子。本研究篩查出雜合子孕婦173例、純合子(包括復(fù)合突變型和純合突變型)孕婦11例。對(duì)這些G6PD基因突變陽性的孕婦應(yīng)及時(shí)提供遺傳咨詢和預(yù)防措施，并對(duì)新生兒及早進(jìn)行酶活性或基因檢測(cè)，可有效減輕 G6PD 缺乏癥對(duì)新生兒造成的危害[13-14]。

本研究獲得了貴陽地區(qū)孕婦人群G6PD 缺乏癥的發(fā)生率和基因突變譜，為本地G6PD 缺乏癥的遺傳咨詢和防控計(jì)劃提供了有價(jià)值的遺傳學(xué)資料。