衰老小鼠肝臟、脾臟和骨髓中Blm解旋酶表達(dá)水平*

鄭藝， 楊爽， 黃晏軍， 湯長寧， 劉杰麟**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 免疫學(xué)教研室, 貴州 貴陽 550025； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 組織工程與干細(xì)胞中心, 貴州 貴陽 550004)

近年來，發(fā)現(xiàn)了多種衰老相關(guān)疾病基因，其中人類早老癥相關(guān)基因研究進(jìn)展最為突出。研究發(fā)現(xiàn)，解旋酶基因突變是早老癥主要病因，RecQ解旋酶家族在核酸代謝過程中起了關(guān)鍵的作用，這一家族參與DNA復(fù)制、修復(fù)、重組、轉(zhuǎn)錄和維持端粒穩(wěn)定[1]。Blm解旋酶是RecQ家族DNA解旋酶中的重要成員，在維持染色體的穩(wěn)定性中具有重要作用，Blm解旋酶的缺失可導(dǎo)致Blm綜合征(bloom’s syndrome，BS)[2]。Blm綜合征是一種罕見的常染色體隱性遺傳病，其臨床特征為生長遲緩、學(xué)習(xí)障礙、免疫缺陷等，Blm綜合征患者突出表現(xiàn)為特征性骨改變，包括骨質(zhì)疏松癥、手指關(guān)節(jié)變硬、鎖骨的重吸收和纖維化、趾骨末端的重吸收等明顯的早老特征，這類患者可伴發(fā)惡性腫瘤。Blm綜合征患者常見免疫球蛋白M(immunoglobulin M，IgM)和免疫球蛋白 A(immunoglobulin A,IgA)低下或免疫功能缺陷。將Blm患者的淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，可發(fā)現(xiàn)高比率的染色體畸變，染色體有變脆、易斷裂傾向[3]。已有研究發(fā)現(xiàn)，Blm解旋酶的低表達(dá)可以上調(diào)P53蛋白的表達(dá)，而P53是腫瘤抑制基因之一[4]。Blm基因定位于染色體15q26.1，編碼蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為159 kDa，是由1 417個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，在DNA重組中Blm可促進(jìn)同源重組中間物質(zhì)的溶解及阻止鏈的交叉，在DNA修復(fù)中Blm主要在細(xì)胞S期感知并應(yīng)對(duì)DNA損傷[5]。本文通過制備衰老小鼠模型，檢測(cè)衰老小鼠造血系統(tǒng)中Blm蛋白含量，并與正常發(fā)育小鼠比較，探討B(tài)lm解旋酶在衰老小鼠中的變化。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑及儀器

C57BL/6小鼠由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心外購后提供，合格證號(hào)SCXK-(軍、PF級(jí)、8周齡、體質(zhì)量18～22 g。D-半乳糖(D-gal)、蘇木素-伊紅(H-E)染色試劑盒、高效RIPA組織/細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、封閉血清等均購自北京索萊寶科技有限公司,總超氧化物歧化酶(T-SOD)測(cè)試盒及丙二醛(MDA)測(cè)試盒購自南京建成生物工程研究所,兔抗人Bax多克隆抗體及兔抗人β-actin單克隆抗體購自美國Abcam公司,兔抗人Blm多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司,辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(二抗)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)，5810-R型臺(tái)式冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf Germany公司)，電泳儀、垂直電泳槽、電轉(zhuǎn)移槽(美國Bio-Rad公司)，曝光機(jī)(美國Bio-Rad公司)，電熱恒溫水浴鍋(上海醫(yī)療器械五廠)，LEICA-RM2200切片機(jī),LEICA-EG1150石蠟包埋機(jī)，顯微鏡(德國徠卡公司)。

1.2 方法

1.2.1分組及小鼠衰老模型構(gòu)建 20只小鼠均分為正常對(duì)照組和衰老組，雌雄各半，衰老組小鼠構(gòu)建衰老模型。將D-半乳糖粉末1 g溶于10 mL的無菌生理鹽水中，使藥物濃度達(dá)到100 g/L，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌，4 ℃冰箱保存。造模時(shí)間共49 d，每天按 0.5 mg/g的劑量頸后部皮下注射D-半乳糖溶液；對(duì)照組按同樣方法注射等量的生理鹽水。

1.2.2小鼠一般情況、脾臟和胸腺組織形態(tài)觀察 逐日觀察兩組小鼠的狀態(tài)、進(jìn)食量及飲水量,造模期間每6 d記錄1次小鼠體質(zhì)量，共記錄10次小鼠體質(zhì)量。連續(xù)注射7周后，頸椎脫臼處死小鼠，打開腹腔和胸腔暴露脾臟和胸腺，小心剝離出完整的脾臟和胸腺，利用蘇木素-伊紅(H-E)染色的方法做小鼠脾臟和胸腺組織切片。

1.2.3血清超氧化物氣化酶及丙二醛水平檢測(cè) 連續(xù)注射7周后，頸椎脫臼處死小鼠，摘眼球取血將小鼠血液收集到干燥清潔的EPP管中，做好標(biāo)記，4 ℃靜置2 h，低溫離心(4 ℃，1 500 rpm/min，8 min)，吸取上層血清至新的EPP管中。利用黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)小鼠血清中SOD含量，采用硫代巴比妥酸(TBA)法測(cè)定小鼠血清中MDA含量。

1.2.4Western blot檢測(cè)小鼠肝臟、脾臟和骨髓Blm蛋白表達(dá)水平 連續(xù)注射7周后，分別取對(duì)照組和衰老組小鼠的肝臟、脾臟和骨髓，提取總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。取20 μg蛋白上樣，8% SDS-PAGE 電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上、將PVDF膜浸入封閉液，室溫封閉2 h，吸出封閉液后分別加入一抗BLM(1∶200)及β-actin 抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜、洗膜(洗3次，每次10 min)，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶5 000)，室溫孵育2 h，洗膜，加入ECL發(fā)光液，曝光。用Graphpad Prism軟件對(duì)曝光條帶進(jìn)行分析，目標(biāo)蛋白半定量用該蛋白與β-actin的吸光度比值表示。

1.2.5免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)小鼠肝臟、脾臟和骨髓的Blm蛋白表達(dá) 造模完成后分別取對(duì)照組和衰老組小鼠的肝臟、脾臟和股骨，股骨經(jīng)脫鈣處理后與肝臟和脾臟一起脫水、透明、浸蠟、包埋、切片。石蠟切片常規(guī)脫蠟，DEPC抗原熱修復(fù)(95 ℃，5 min)，室溫下過氧化氫封閉10 min，消除內(nèi)源性過氧化氫酶，加入山羊血清，37 ℃孵育30 min，滴加Blm抗體(1∶200)，4 ℃濕盒過夜。復(fù)溫，PBS沖洗5 min×3次，滴加二抗，37 ℃下孵育30 min。PBS沖洗5 min×3次，將玻片浸入DAB溶液中顯色，蘇木精復(fù)染，脫水封片。在400倍顯微鏡下觀察小鼠各組織切片的組織學(xué)改變。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

各組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，所有數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。計(jì)量資料以均數(shù)(標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 衰老小鼠模型的鑒定

2.1.1一般情況 造模末期對(duì)照組小鼠皮膚彈性好，毛發(fā)細(xì)密不易脫落，反應(yīng)靈敏、進(jìn)食正常；衰老組小鼠皮膚松弛、毛發(fā)粗糙失去光澤且易脫落，精神萎靡，喜蜷縮，脊椎逐漸隆起，體形消瘦、進(jìn)食少，見圖1。對(duì)照組小鼠的初始平均體質(zhì)量為(20.1±0.19)g，造模結(jié)束時(shí)的平均體質(zhì)量為(30.1±0.24)g，小鼠平均體質(zhì)量的增長為10.0 g；衰老組小鼠的初始平均體質(zhì)量為(20.2±0.07)g，造模結(jié)束時(shí)的平均體質(zhì)量為(28.6±0.11)g，小鼠平均體質(zhì)量的增長為8.4 g。衰老組小鼠和外觀形態(tài)特征、生存狀態(tài)和體質(zhì)量的改變，初步證明D-半乳糖衰老小鼠模型構(gòu)建成功。

2.1.2血清SOD和MDA含量 衰老小鼠模型制備完成后，衰老組小鼠血清SOD含量[(105.3±4.8)U/mL]較對(duì)照組小鼠 [(174±5.4)U/mL]明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);衰老組小鼠MDA含量[13.3±0.31(μmol/L)]較對(duì)照組小鼠[(4.72±0.42) μmol/L]明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.1.3肝組織中Bax蛋白表達(dá) 衰老組小鼠的肝臟切片中Bax蛋白的陽性表達(dá)(棕褐色顆粒)高于對(duì)照組小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖1。

圖1 兩組小鼠肝組織Bax蛋白表達(dá)(SP，×400)Fig.1 Bax protein expression of mice in the two groups

2.1.4脾臟和胸腺組織學(xué) 對(duì)照組小鼠脾臟結(jié)構(gòu)完整，白髓和紅髓清晰，脾小梁沒有增生，脾臟中淋巴細(xì)胞數(shù)目眾多且形態(tài)正常，淋巴細(xì)胞核呈紫藍(lán)色，色澤均一穩(wěn)定；衰老組小鼠白髓和紅髓不清，脾小梁明顯增生，淋巴細(xì)胞數(shù)目明顯減少，細(xì)胞形狀不規(guī)則，細(xì)胞核發(fā)生固縮，表明淋巴細(xì)胞壞死增多。對(duì)照組小鼠胸腺包膜完整，皮質(zhì)和髓質(zhì)清晰；衰老組小鼠胸腺結(jié)構(gòu)分散，胸腺細(xì)胞分布稀疏，皮質(zhì)和髓質(zhì)不清，說明D-半乳糖衰老小鼠模型構(gòu)建成功。見圖2。

2.2 Blm基因在小鼠肝臟、脾臟和骨髓中的表達(dá)

免疫組織化學(xué)染色和蛋白質(zhì)印記兩種方法都表明，衰老小鼠肝臟、脾臟和骨髓的Blm表達(dá)量低于對(duì)照組小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。圖3、4。

3 討論

近年來，世界人口老齡化程度日益加深，隨著科學(xué)水平的不斷發(fā)展，許多學(xué)者希望能夠探索更多的衰老相關(guān)機(jī)制。建立適合的衰老動(dòng)物模型是確保研究準(zhǔn)確、高效進(jìn)行的前提。研究證實(shí)，通過D-gal致衰老的造模方法所制備的衰老動(dòng)物模型與自然衰老動(dòng)物有較高相似性。D-半乳糖是一種小分子單糖，在體內(nèi)的量正常時(shí)是一種生理營養(yǎng)成分，可被氧化為葡萄糖，為機(jī)體提供能量[6-7]，但是，當(dāng)機(jī)體中D-半乳糖量過高時(shí)，氧化反應(yīng)會(huì)使D-半乳糖被氧化成醛糖和過氧化氫，產(chǎn)生超氧陰離子和氧自由基，從而導(dǎo)致機(jī)體生理功能發(fā)生改變。表現(xiàn)出與衰老相似的癥狀[8]。相關(guān)研究表明機(jī)體細(xì)胞內(nèi)半乳糖濃度升高，在酶的催化下還原成半乳糖醇，半乳糖醇不能被細(xì)胞代謝而堆積在細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞滲透壓發(fā)生改變，細(xì)胞出現(xiàn)功能障礙，加速衰老和凋亡[9]。

注：A為對(duì)照組小鼠脾臟，B為衰老組小鼠脾臟，C為對(duì)照組小鼠胸腺，D為衰老組小鼠胸腺圖2 兩組小鼠脾臟和胸腺組織學(xué)(SP，×400)Fig.2 Histology of spleen and thymus of mice in the two groups

注：A、B分別為衰老組和對(duì)照組小鼠肝臟Blm表達(dá)，C、D分別為衰老組和對(duì)照組小鼠脾臟Blm表達(dá)，E、F分別為衰老組和對(duì)照組小鼠骨髓Blm表達(dá)圖3 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)小鼠肝臟、脾臟和骨髓中組織Blm的表達(dá)(SP，×400)Fig.3 The expressions of Blm protein in the liver, spleen and bone marrow of mice detected by immunohistochemistry

人類RecQ解旋酶基因家族包括RecQL1、RecQL5、Blm、Wrn及RecQL4 5個(gè)成員，后三者的突變均導(dǎo)致了相關(guān)的疾病，依次為Bloom綜合征、Werner 綜合征和RTS綜合征[10-11]。Sharma等[12]發(fā)現(xiàn)，Blm解旋酶具有促進(jìn)細(xì)胞DNA復(fù)制、修復(fù)、重組以及維持基因組穩(wěn)定性的功能。對(duì)秀麗隱桿線蟲的研究發(fā)現(xiàn)，基因確實(shí)可以影響生物的衰老及壽命，衰老的發(fā)生機(jī)制并非由單一基因決定，可能是一個(gè)基因群[13]。細(xì)胞衰老是生物衰老的基本單位，是老年病發(fā)病的共同基礎(chǔ)，細(xì)胞衰老與機(jī)體衰老直接相關(guān)。中老年癌癥發(fā)病率較高，癌癥是一種與衰老有關(guān)的疾病，衰老生物學(xué)與癌癥生物學(xué)存在著許多相似之處，癌癥與衰老的分子學(xué)機(jī)制又有著相互重疊的方面。因此，有關(guān)衰老的細(xì)胞及分子生物學(xué)機(jī)制的研究對(duì)于癌癥的發(fā)生機(jī)制和抗腫瘤研究均具有重要價(jià)值。Blm解旋酶在與衰老有關(guān)的DNA損傷修復(fù)、端粒維護(hù)及線粒體功能障礙等方面發(fā)揮了重要作用[14-15]。因此，Blm可能在癌癥和衰老中發(fā)揮橋梁作用。孟惠惠等[16]發(fā)現(xiàn)，3 株腫瘤細(xì)胞株中均高度表達(dá)Blm mRNA及蛋白。Wang 等[15]發(fā)現(xiàn)，在腫瘤中Blm表達(dá)高于正常組織。Yan 等[11]研究表明，食管鱗癌細(xì)胞中BLM 表達(dá)上調(diào)2.927 倍，提示Blm的高表達(dá)與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。

注：A為小鼠肝臟，B為小鼠脾臟，C為小鼠骨髓；(1)與對(duì)照組比較，P<0.05圖4 各組小鼠肝臟、脾臟和骨髓組織中Blm表達(dá)(Western Bolt)Fig.4 The expressions of Blm protein in the liver, spleen and bone marrow of mice detected by Western Bolt

SOD是體內(nèi)的抗氧化酶，可清除體內(nèi)氧自由基，SOD活力下降，不能消除過多的活性氧自由基(ROS)，ROS堆積過多后引起細(xì)胞損傷甚至凋亡，小鼠體內(nèi)SOD的含量可反應(yīng)小鼠的衰老程度。衰老小鼠血清中脂質(zhì)過氧化物丙二醛MDA的含量明顯增高，MDA能夠間接反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度和細(xì)胞損傷的程度。本研究通過連續(xù)注射D-半乳糖，制造衰老小鼠模型，并通過檢測(cè)衰老模型組小鼠的生存狀態(tài)、體重變化、血清中SOD、MDA含量、Bax蛋白表達(dá)量、脾臟和胸腺組織形態(tài)學(xué)切片的觀察和檢測(cè)，與對(duì)照組小鼠比較，確定小鼠衰老模型構(gòu)建成功。獲得衰老小鼠模型后，采用石蠟切片免疫組織化學(xué)染色和蛋白印跡兩種方法分別對(duì)模型組小鼠和對(duì)照組小鼠的肝臟、脾臟和骨髓做了Blm表達(dá)的定位、定性、半定量對(duì)比分析，最終得出結(jié)論，衰老小鼠體內(nèi)Blm的表達(dá)低于正常對(duì)照組小鼠。綜上所述，Blm解旋酶含量的改變可能與衰老發(fā)生的機(jī)制相關(guān)。