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    基于體外實(shí)驗(yàn)技術(shù)評(píng)價(jià)芫花素肝毒性風(fēng)險(xiǎn)△

    2019-08-02 01:59:10汪祺王亞丹楊建波劉越文海若馬雙成
    中國(guó)現(xiàn)代中藥 2019年7期
    關(guān)鍵詞:芫花微粒體純度

    汪祺,王亞丹,楊建波,劉越,文海若,馬雙成

    中國(guó)食品藥品檢定研究院,北京 100050

    芫花Genkwa Flos為瑞香科植物芫花DaphnegenkwaSieb.et Zucc.的干燥花蕾。其性溫,味苦、辛,有毒[1]。在中國(guó)應(yīng)用較為廣泛,為傳統(tǒng)峻下逐水藥。藥理研究表明,芫花具有利尿、鎮(zhèn)咳、祛痰、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等作用[2-3]。由于其明確的抗腫瘤活性,臨床長(zhǎng)期應(yīng)用所導(dǎo)致的不良反應(yīng)屢次出現(xiàn),其中,肝損傷所占比例最為嚴(yán)重[4-7]。

    有學(xué)者通過血清生化指標(biāo)和組織病理學(xué)篩選相結(jié)合的方法,初步證明芫花所致肝毒性部位集中在乙醇提取物的三氯甲烷萃取部分,其中芫花素含量較高。另有文獻(xiàn)報(bào)道,芫花乙醇提取物中芫花素質(zhì)量分?jǐn)?shù)可高達(dá)6.06%。該實(shí)驗(yàn)同時(shí)采用體外方法證明,芫花醇提物可顯著抑制大鼠肝微粒體(RLM)和人肝微粒體(HLM)中尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UDP-glucuronosyltransferases,UGTs)活性[8],但醇提物中何種成分產(chǎn)生的抑制作用并未闡明,因此有待進(jìn)一步考察研究。

    UGTs酶是人體內(nèi)重要的Ⅱ相代謝酶系,具有可催化脂溶性化合物及內(nèi)源性物質(zhì)的作用。被催化化合物多具有羥基、巰基、胺基、羧基和烯醇基團(tuán),經(jīng)過UGTs酶系代謝后,這類物質(zhì)水溶性增加,可隨尿及膽汁外排出體外,從而防止其在體內(nèi)蓄積產(chǎn)生毒性[9-10]。UGTs家族中非常重要的一員為UDP-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1(UGT1A1酶),該酶是內(nèi)源性物質(zhì)膽紅素的唯一代謝酶。膽紅素是人體內(nèi)一種非常重要的內(nèi)源性物質(zhì),是血紅細(xì)胞的代謝產(chǎn)物,在臨床上是判定黃疸的重要依據(jù),同時(shí)也是肝功能和肝損害的重要生物標(biāo)志物。因此通過考察藥物對(duì)UGT1A1介導(dǎo)的膽紅素葡萄糖醛酸結(jié)合的影響可用于預(yù)測(cè)該藥物對(duì)肝臟是否具有潛在毒性作用。本實(shí)驗(yàn)擬在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,首先采用計(jì)算機(jī)分子對(duì)接手段初步預(yù)測(cè)芫花中主要單體成分芫花素對(duì)UGT1A1酶的活性影響,此外同時(shí)采用體外人肝微粒體溫孵體系,評(píng)價(jià)其對(duì)UGT1A1酶的抑制作用,綜合兩部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)其潛在毒性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。由于前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)考察了芫花醇提物對(duì)不同種屬中UGT1A1酶的抑制作用,并未見明顯差異,因此本研究?jī)H采用HLM進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究[8]。

    1 儀器與試藥

    1.1 儀器

    Waters AcquityTMUltra Performance LC超高效液相色譜儀(Waters公司,美國(guó)),節(jié)能型職能恒溫槽SDC-6(寧波新芝生物科技股份有限公司),METTLER TOLEDO AE240型電子天平(梅特勒-托利多公司,瑞士),Thermo 17R型高速低溫離心機(jī)(Thermo公司,日本)。

    1.2 材料與試劑

    人肝微粒體(human liver microsome,HLM,50 donors)購(gòu)自美國(guó)BD Gentest公司;磷酸鉀(純度≥98%)、抗壞血酸(純度≥98%)、氯化鎂(純度≥98%)、三羥甲基氨基甲烷(Tris,純度≥98%)、膽紅素(純度≥98%)均購(gòu)自百靈威科技有限公司,丙甲菌素(純度≥98%)、葡萄糖二酸單內(nèi)酯(純度≥98%)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDPGA,純度≥98%)、二甲基亞砜(DMSO,純度≥98%)均購(gòu)自Sigma Aldrich公司,芫花素(批號(hào):111899-201202,純度:94.9%)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。甲酸、鹽酸均為分析純(北京化學(xué)試劑廠),乙腈、甲醇均為色譜純(Fisher公司)。

    2 方法

    2.1 同源模建

    UGT1A1(Uniprot/P25101)是由534個(gè)氨基酸殘基組成的Ⅱ相代謝酶,由于目前尚未確定UGT1A1的N-末端結(jié)構(gòu)域,前期實(shí)驗(yàn)采用Discovery Studio 2.5 BLAST Search模塊進(jìn)行序列比對(duì),分析其同源性、相似性高低,選擇相似性最高的4種蛋白作為模板進(jìn)行同源模建。實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Modeller 9.13程序,首先基于逐級(jí)能量最小化方法采用最陡下降法和共軛梯度法進(jìn)行優(yōu)化,約束所有重原子,優(yōu)化氫原子、側(cè)鏈及Loop區(qū)。其次基于拉氏圖和Profile-3D分析對(duì)同源模建蛋白進(jìn)行評(píng)價(jià),最終構(gòu)建出UGT1A1酶蛋白結(jié)構(gòu)[11]。

    2.2 分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)

    利用Discovery Studio 2.5的From Receptor Cavities模塊對(duì)蛋白空腔進(jìn)行自動(dòng)識(shí)別,并利用活性值與打分值的相關(guān)性系數(shù)對(duì)活性口袋進(jìn)行評(píng)價(jià),分析待測(cè)單體芫花素與UGT1A1酶蛋白的作用方式,同時(shí)計(jì)算二者復(fù)合物結(jié)合自由能,用以判斷親和作用強(qiáng)弱。

    2.3 人肝微粒體體外抑制實(shí)驗(yàn)

    2.3.1 色譜條件 Acquity UPLC HSS C18(2.1 mm×100 mm,1.8 μm);預(yù)柱:Acquity UPLC HSS C18VanGuard Pre-column(2.1 mm×5 mm,1.8 μm);流動(dòng)相:乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B),梯度洗脫(0~2.1 min,40%A→75%A;2.1~4.2 min,75%A→95%A;4.2~8.0 min,95%A;8.0~8.5 min,95%A→40%A;8.5~12.5 min,40%A);流速:0.4 mL·min-1;柱溫:35 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng):450 nm;進(jìn)樣量:10 μL[12]。

    2.3.2 UDPGA-發(fā)生系統(tǒng)的制備 精密稱取丙甲菌素、氯化鎂、葡糖二酸單內(nèi)酯、UDPGA適量,加Tris-HCl緩沖液使溶解(Tris-HCl緩沖液:取Tris 121.1 g,加入去離子水800 mL,加濃鹽酸調(diào)pH至7.4,去離子水定容至1000 mL),其中含氯化鎂5 mmol·L-1,丙甲菌素25 μg·mL-1,葡糖二酸單內(nèi)酯5 mmol·L-1,UDPGA 5mmol·L-1,即得[12]。

    2.3.3 孵育體系溶液的制備 采用人肝微粒體孵育體系(HLM),以表觀抑制常數(shù)Ki為評(píng)價(jià)指標(biāo),測(cè)定芫花素對(duì)UGT1A1酶的抑制作用。取蛋白質(zhì)量濃度為0.5 mg·L-1的HLM 30 μL放至室溫復(fù)融,分別加入系列濃度的膽紅素(UGT1A1酶底物)對(duì)照品溶液(0.52~2.37 μmol·L-1)及待測(cè)單體芫花素對(duì)照品溶液(0.16~12 μmol·L-1),置37 ℃ 恒溫水浴預(yù)孵育3 min,加入新鮮配制的UDPGA-發(fā)生系統(tǒng)溶液68 μL啟動(dòng)反應(yīng)。反應(yīng)10 min后立即加入600 μL冰乙腈-甲醇(2∶1,含抗壞血酸濃度為200 μmol·L-1)沉淀蛋白終止反應(yīng),渦旋1 min后于13 000 r·min-1離心25 min,取上清液進(jìn)行測(cè)定[DMSO總用量不超過1%(V/V)][13-14]。

    3 結(jié)果

    3.1 UGT1A1酶蛋白活性區(qū)確定

    利用Discovery Studio 2.5的From Receptor Cavities模塊對(duì)UGT1A1蛋白空腔進(jìn)行自動(dòng)識(shí)別,共獲得9個(gè)口袋(A-I活性口袋),坐標(biāo)及半徑如表1所示。

    表1 結(jié)合位點(diǎn)信息表

    3.2 分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    將單體芫花素(結(jié)構(gòu)見圖1)與UGT1A1酶蛋白進(jìn)行對(duì)接,選擇能夠接納化合物且相關(guān)系數(shù)相反數(shù)最大的口袋作為活性口袋。對(duì)接結(jié)果顯示,芫花素在site F的打分值為81.643 7,高于其他活性位點(diǎn)的打分值,因此芫花素的結(jié)合口袋確定為site F(對(duì)接模式見圖2)。

    圖1 芫花素結(jié)構(gòu)圖

    圖2 芫花素與UGT1A1酶對(duì)接模式圖

    在確定芫花素對(duì)接區(qū)域后,采用Discovery Studio 2.5中CDOCKER打分功能,對(duì)其與靶標(biāo)蛋白UGT1A1的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行結(jié)合自由能(IE,kcal·mol-1)分析,IE值絕對(duì)值越大,代表體系能量越穩(wěn)定,結(jié)合能力更強(qiáng)。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,芫花素與UGT1A1的 IE 值為31.303 4 kcal·mol-1,證明其與酶的結(jié)合能力較強(qiáng);同時(shí),前期實(shí)驗(yàn)[11]表明膽紅素結(jié)合活性區(qū)為F區(qū),與芫花素存在競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的可能,因此進(jìn)一步提示芫花素對(duì)于UGT1A1酶結(jié)合底物膽紅素存在較大影響,具有一定的安全性風(fēng)險(xiǎn)。

    3.3 人肝微粒體體外抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    分別以膽紅素總代謝產(chǎn)物(單葡萄糖醛酸膽紅素及雙葡萄糖醛酸膽紅素)生成量對(duì)底物膽紅素濃度做圖,以米氏方程雙倒數(shù)做圖法進(jìn)行計(jì)算測(cè)定,橫坐標(biāo)為膽紅素濃度的倒數(shù)(1/S),縱坐標(biāo)為加入芫花素后膽紅素代謝反應(yīng)速率的倒數(shù)(1/V);加入不同濃度芫花素對(duì)應(yīng)不同曲線,將不同曲線的斜率對(duì)應(yīng)相應(yīng)底物膽紅素濃度繪制slop圖(圖3),求得抑制常數(shù)Ki[12,15]。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,芫花素的Ki值為27.0 μmol·L-1,對(duì)UGT1A1酶表現(xiàn)為中強(qiáng)抑制作用,由圖3可知抑制類型為競(jìng)爭(zhēng)型抑制,證明芫花素可與底物膽紅素競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合UGT1A1酶,繼而抑制其酶活性,體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果與計(jì)算機(jī)對(duì)接結(jié)果相一致。

    注:A.米氏方程雙倒數(shù)圖;B.slop斜率圖。圖3 芫花素對(duì)UGT1A1酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響

    4 討論

    內(nèi)源性物質(zhì)膽紅素在人體內(nèi)的代謝及調(diào)節(jié)為一復(fù)雜生理過程[16],任何環(huán)節(jié)發(fā)生病理改變均可導(dǎo)致膽紅素代謝受阻、蓄積,繼而引發(fā)肝毒性反應(yīng)。目前已知UGT1A1酶為膽紅素在體內(nèi)的唯一代謝酶,因此本實(shí)驗(yàn)以此為切入點(diǎn),從UGT1A1代謝酶抑制可引發(fā)潛在肝毒性反應(yīng)為出發(fā)點(diǎn),考察芫花中主要單體成分芫花素致肝毒性風(fēng)險(xiǎn)。

    實(shí)驗(yàn)首先通過分子對(duì)接技術(shù)構(gòu)建UGT1A1酶蛋白結(jié)構(gòu),將待測(cè)單體芫花素與UGT1A1酶蛋白對(duì)接,明確二者結(jié)合靶點(diǎn)以及結(jié)合強(qiáng)弱,初步推測(cè)芫花素與UGT1A1酶的結(jié)合位點(diǎn)為活性區(qū)F,與其底物膽紅素活性位點(diǎn)重合,且芫花素與UGT1A1酶親和性較強(qiáng),因此提示芫花素可競(jìng)爭(zhēng)型抑制UGT1A1酶代謝底物膽紅素的酶活性,具有潛在肝毒性風(fēng)險(xiǎn)。另一方面,體外人肝微粒體實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,芫花素對(duì)人源UGT1A1酶具有中強(qiáng)抑制作用,抑制類型為競(jìng)爭(zhēng)型抑制,與計(jì)算機(jī)分子對(duì)接結(jié)果相一致。

    綜上所述,本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的UGT1A1酶蛋白模型可用于藥物的初期安全性評(píng)價(jià)篩選,可有效預(yù)測(cè)藥物的潛在用藥風(fēng)險(xiǎn)。計(jì)算機(jī)分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)及體外人肝微粒體抑制實(shí)驗(yàn)均提示芫花素對(duì)UGT1A1酶存在抑制作用,可與其底物膽紅素產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)型抑制,繼而引發(fā)肝毒性。本研究將計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)應(yīng)用于預(yù)測(cè)藥物潛在肝毒性風(fēng)險(xiǎn)的嘗試,為中藥安全性評(píng)價(jià)提供了新的思路。

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