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    莢蒾屬植物DNA條形碼鑒定△

    2019-08-02 01:59:10吳田澤陳露肖煜強(qiáng)鄒問(wèn)汀胡心怡李宇陽(yáng)劉霞黃升
    中國(guó)現(xiàn)代中藥 2019年7期
    關(guān)鍵詞:種間條形碼置信度

    吳田澤,陳露,肖煜強(qiáng),鄒問(wèn)汀,胡心怡,李宇陽(yáng),劉霞*,黃升

    1.武漢理工大學(xué) 化學(xué)化工與生命科學(xué)學(xué)院,湖北 武漢 430070;2.湖北民族大學(xué) 林學(xué)園藝學(xué)院,湖北 恩施 445000;3.恩施冬升植物開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司,湖北 恩施 445000

    莢蒾屬ViburnumLinn.植物屬五?;艫doxaceae灌木或小喬木,分布于我國(guó)各省,尤以西南部地區(qū)種類(lèi)最多,具有相當(dāng)長(zhǎng)久的應(yīng)用觀賞歷史。同時(shí),莢蒾屬植物一直被作為民間藥用植物,具有悠久的藥用歷史。莢蒾屬植物始載于《新修本草》,具有清熱解毒、祛風(fēng)除濕、健脾消食、抗衰老、強(qiáng)身、驅(qū)蟲(chóng)等作用,臨床可用于治療小兒疳積、小兒發(fā)育不良、婦科疾病等[1-2]。目前,莢蒾屬很多物種未得到很好的開(kāi)發(fā)和利用,其中活性成分的研究仍未完全明確。因此,建立一種快速、有效的鑒別方法將為其開(kāi)發(fā)利用及活性成分的研究奠定重要基礎(chǔ)。

    中藥材的傳統(tǒng)鑒別方法主要有基原鑒定、形態(tài)鑒定、顯微鑒定和理化鑒定等,均具有不同程度的局限性。在中藥材鑒定中,DNA條形碼鑒定相比于傳統(tǒng)中藥鑒定方法有著革命性的進(jìn)步[3-4]。DNA條形碼分子鑒定法是利用基因組中一段公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)的、易擴(kuò)增且相對(duì)較短的DNA序列來(lái)進(jìn)行物種鑒定的一種分子生物學(xué)技術(shù)[5],該DNA片段具有種間的多樣性及特異性,不受生物個(gè)體發(fā)育狀況及其形態(tài)特征所限制,可克服對(duì)經(jīng)驗(yàn)鑒定的過(guò)度依賴(lài),實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化[6-7]。中藥材DNA條形碼分子鑒定是以ITS2為主體條形碼序列鑒定中藥材的方法體系,其中植物類(lèi)中藥材選用ITS2為主體序列、psbA-trnH為輔助序列,主要適用于中藥材(包括藥材、藥材粉末以及部分藥材飲片)及基原物種的鑒定[1,4],并且已在野菊[8]、霍山石斛[9]、羌活[10]、冬蟲(chóng)夏草[11]、枸杞子[12]等中藥材上得到驗(yàn)證。

    本研究旨在通過(guò)DNA條形碼分子鑒定法對(duì)莢蒾屬類(lèi)不同種類(lèi)藥用植物進(jìn)行鑒別研究,包括珊瑚樹(shù)、雞樹(shù)條、水紅木、煙管莢蒾等13種莢蒾屬藥用植物,建立該屬藥用植物鑒定的新方法,為其質(zhì)量控制、合理開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

    1 材料

    1.1 DNA條形碼鑒定材料

    本研究通過(guò)野外考察等方式收集了莢蒾屬植物13種,共32份樣品,其中水紅木Viburnumcylindricum5份,川西莢蒾V.davidii2份,細(xì)梗紅莢蒾V.erubesens1份,珍珠莢蒾V.foetidumvar.ceanothoides1份,直角莢蒾V.foetidumvar.rectangulatum1份,珊瑚樹(shù)莢蒾V.odoratissimum2份,少花莢蒾V.oliganthum1份,雞樹(shù)條V.opulusvar.calvescens3份,蝴蝶戲珠花V.plicatumvar.tomentosum2份,球核莢蒾V.propinquum5份,皺葉莢蒾V.rhytidophyllum5份,臺(tái)東莢蒾V.taitoense2份,煙管莢蒾V.utile2份,分別來(lái)自湖北、四川、云南等地。所有樣品經(jīng)中國(guó)科學(xué)院武漢植物園標(biāo)本館原館長(zhǎng)趙子恩研究員鑒定,樣品保存在武漢理工大學(xué)化學(xué)化工與生命科學(xué)學(xué)院中藥資源與分子鑒定實(shí)驗(yàn)室。詳細(xì)樣品信息見(jiàn)表1。另從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載上述13個(gè)物種ITS2序列共14條。見(jiàn)表2。

    表1 采集的莢蒾屬植物樣品信息

    表2 GenBank下載序列信息表

    1.2 儀器與試劑

    本實(shí)驗(yàn)所用儀器見(jiàn)表3,所用試劑見(jiàn)表4。

    表3 DNA條形碼研究所用儀器

    表4 DNA條形碼研究所用試劑

    2 方法

    2.1 樣品處理及DNA提取

    稱(chēng)取樣品的干燥葉或果實(shí)20~30 mg,用高通量組織研磨器研磨120 s(50 Hz),核分離液(2% PVP,20 mmol·L-1EDTA,100 mmol·L-1pH 8.0 Tris-HCl和0.7 mol·L-1NaCl)800 μL 抽提3次,56 ℃水浴過(guò)夜,然后用三氯甲烷-異戊醇(24∶1)800 μL抽提2次。利用植物基因組DNA提取試劑盒法(Tiangen Biotech Co.,China)提取總DNA[13],提取完成后,用50 μL ddH2O洗脫,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    2.2 ITS2序列擴(kuò)增和測(cè)序

    以樣品DNA為模板,對(duì)ITS2序列進(jìn)行擴(kuò)增,引物、PCR反應(yīng)條件及擴(kuò)增程序均參考陳士林研究員課題組的研究[13-14],詳細(xì)條件見(jiàn)表5。采用25 μL PCR反應(yīng)體系:Premi X TaqTM酶12.5 μL,正向引物1 μL,反向引物1 μL,滅菌雙蒸水8.5 μL,DNA模板2 μL。對(duì)擴(kuò)增后產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),在120 V電泳電壓下電泳20 min,利用DNA Marker判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小以及含量大小,并送至生工生物工程(上海)有限公司武漢分公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

    表5 擴(kuò)增引物及反應(yīng)條件

    2.3 數(shù)據(jù)處理

    測(cè)序所得DNA序列峰圖,運(yùn)用CodonCode Aligner V 6.0.2(Codon Code Co.,USA)軟件進(jìn)行質(zhì)量分析和拼接校對(duì),采用基于隱馬爾科夫模型的HMMer注釋方法去除兩端5.8S rRNA和28S rRNA區(qū)段獲得完整的ITS2序列[15]。將所有DNA序列使用MEGA5.1處理軟件進(jìn)行保守位點(diǎn)、變異位點(diǎn)等信息的分析比對(duì),同時(shí)基于K2P(Kimura 2-Parameter)模型計(jì)算遺傳距離并分析,采用鄰接法(Neighbor-Joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)聚類(lèi)樹(shù)[16],利用bootstrap(1000次重復(fù))檢驗(yàn)各分支的支持率。

    3 結(jié)果與分析

    3.1 種內(nèi)變異分析

    本研究中13種莢蒾屬藥用植物ITS2序列特征見(jiàn)表6。水紅木共6條序列,長(zhǎng)度224~254 bp,48 bp處存在T-C變異,59 bp處存在A-T變異,239 bp處存在G-A變異,246 bp處存在T-C變異;平均GC質(zhì)量分?jǐn)?shù)為65.1%。川西莢蒾共3條序列,長(zhǎng)度為223~253 bp,不存在種內(nèi)變異位點(diǎn);平均GC質(zhì)量分?jǐn)?shù)為65.8%。細(xì)梗紅莢蒾共2條序列,長(zhǎng)度為219~225 bp,不存在種內(nèi)變異位點(diǎn);平均GC質(zhì)量分?jǐn)?shù)為61.0%。珍珠莢蒾共2條序列,長(zhǎng)度為230~254 bp,不存在種內(nèi)變異位點(diǎn);平均GC質(zhì)量分?jǐn)?shù)為68.0%。直角莢蒾共2條序列,長(zhǎng)度為224~230 bp,75 bp處存在C-G變異,173 bp處存在C-T變異;平均GC質(zhì)量分?jǐn)?shù)為67.6%。珊瑚樹(shù)莢蒾共3條序列,長(zhǎng)度為219~225 bp,不存在種內(nèi)變異位點(diǎn);平均GC質(zhì)量分?jǐn)?shù)為61.0%。少花莢蒾共2條序列,長(zhǎng)度為219~225 bp,不存在種內(nèi)變異位點(diǎn);平均GC質(zhì)量分?jǐn)?shù)為61.3%。雞樹(shù)條共4條序列,長(zhǎng)度為220~251 bp,在85 bp處存在G-A變異;平均GC質(zhì)量分?jǐn)?shù)為67.2%。蝴蝶戲珠花共3條序列,長(zhǎng)度為219~249 bp,75 bp處存在C-T變異,76 bp處存在A-G變異,106 bp處存在C-T變異;平均GC質(zhì)量分?jǐn)?shù)為59.9%。球核莢蒾共6條序列,長(zhǎng)度為208~229 bp,152 bp處存在G-A變異,209 bp處存在G-A變異;平均GC質(zhì)量分?jǐn)?shù)為67.3%。皺葉莢蒾共6條序列,長(zhǎng)度為219~249 bp,在71 bp處存在T-C變異;平均GC質(zhì)量分?jǐn)?shù)為66.5%。臺(tái)東莢蒾共3條序列,長(zhǎng)度為208~249 bp,141 bp處存在C-T變異,167 bp處存在A-G變異,237 bp處存在C-T變異;平均GC質(zhì)量分?jǐn)?shù)為61.6%。煙管莢蒾共3條序列,長(zhǎng)度為219~249 bp,在70 bp處存在T-C變異;平均GC質(zhì)量分?jǐn)?shù)為67.2%。

    表6 樣品ITS2序列特征表

    3.2 K2P遺傳距離分析

    利用K2P模型計(jì)算遺傳距離,ITS2序列種內(nèi)、種間平均遺傳距離見(jiàn)表7。結(jié)果顯示,水紅木種內(nèi)最大遺傳距離為0.014 8,小于種間最小遺傳距離0.029 8;川西莢蒾種內(nèi)遺傳距離為0,小于種間最小遺傳距離0.019 8;細(xì)梗紅莢蒾種內(nèi)遺傳距離為0,小于種間最小遺傳距離0.009 8;珍珠莢蒾種內(nèi)遺傳距離為0,小于種間最小遺傳距離0.014 8;直角莢蒾種內(nèi)最大遺傳距離為0.009 8,小于種間最小遺傳距離0.014 8;珊瑚樹(shù)莢蒾種內(nèi)遺傳距離為0,小于種間最小遺傳距離0.019 7;少花莢蒾種內(nèi)遺傳距離為0,小于種間最小遺傳距離0.009 8;雞樹(shù)條種內(nèi)最大遺傳距離為0.004 9,小于種間最小遺傳距離0.030 2;蝴蝶戲珠花種內(nèi)最大遺傳距離為0.019 8,小于種間最小遺傳距離0.035 4;球核莢蒾種內(nèi)最大遺傳距離為0.009 8,小于種間最小遺傳距離0.019 8;皺葉莢蒾種內(nèi)最大遺傳距離0.004 9,小于種間最小遺傳距離0.014 7;臺(tái)東莢蒾種內(nèi)最大遺傳距離為0.014 7,小于種間最小遺傳距離0.014 9;煙管莢蒾種內(nèi)最大遺傳距離為0.004 9,小于種間最小遺傳距離0.014 7。13種莢蒾屬植物樣本種間遺傳距離均大于種內(nèi)遺傳距離,表明ITS2序列作為條形碼基本可將莢蒾屬藥用植物從種水平上分開(kāi)。各物種間遺傳距離為0.009 8~0.119 1,其中少花莢蒾與細(xì)梗紅莢蒾種間遺傳距離最近,臺(tái)東莢蒾和雞樹(shù)條種間遺傳距離最遠(yuǎn)。

    表7 13種莢蒾屬藥用植物種內(nèi)和種間遺傳距離

    3.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(NJ樹(shù))分析

    基于ITS2序列對(duì)13種莢蒾屬藥用植物構(gòu)建NJ系統(tǒng)聚類(lèi)樹(shù),利用bootstrap 1000次檢驗(yàn)各分支置信度,各分支置信度均大于50%,見(jiàn)圖1。圖中水紅木以89%置信度聚為一支;雞樹(shù)條以99%置信度聚為一支;珍珠莢蒾以85%置信度聚為一支;直角莢蒾以55%置信度聚為一支;川西莢蒾以83%置信度聚為一支;球核莢蒾以94%置信度聚為一支;煙管莢蒾以90%置信度聚為一支;皺葉莢蒾以75%置信度聚為一支;蝴蝶戲珠花以95%置信度聚為一支;少花莢蒾以66%置信度聚為一支;細(xì)梗紅莢蒾以65%置信度聚為一支;珊瑚樹(shù)莢蒾以90%置信度聚為一支;臺(tái)東莢蒾以92%置信度聚為一支。每種莢蒾屬植物均呈現(xiàn)良好的單系性,可從NJ樹(shù)得到各個(gè)物種之間的進(jìn)化和親緣關(guān)系。由此可見(jiàn),利用ITS2序列作為條形碼可將莢蒾屬植物分開(kāi)。

    4 討論

    莢蒾屬植物多為灌木或小喬木,花序?yàn)榫蹅慊ㄐ蚪M成的復(fù)傘形花序或圓錐花序,小花繁多,白色,果實(shí)成熟時(shí)為紫紅色,具有極高觀賞價(jià)值。該屬植物在全世界約230多種,亞洲、南美洲種類(lèi)較多。我國(guó)有74種,其中具有藥用價(jià)值的種類(lèi)已達(dá)43種,其中以枝入藥的有11種,以根莖入藥的有11種,以根、莖、葉入藥的有4種,以根、果入藥的有8種,以根、莖、葉及花果入藥的有9種[16]。莢蒾屬植物藥用活性成分包括綠原酸、黃酮類(lèi)、熊果酸、酚類(lèi)、乙酰膽堿酶、β-谷甾醇等,具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌抗病毒、降低血脂和血糖等功能[2,17-20]。

    4.1 ITS2序列鑒定方法

    莢蒾屬植物物種類(lèi)型多樣,由于其植物形態(tài)的相似性、遺傳關(guān)系的復(fù)雜性,因此鑒定莢蒾屬植物是一個(gè)難題。劉震等[21]對(duì)忍冬科藥用植物DNA條形碼通用序列的篩選實(shí)驗(yàn)中,利用ITS2序列成功完全區(qū)分開(kāi)6個(gè)莢蒾屬近緣種,為本實(shí)驗(yàn)莢蒾屬物種鑒別提供了一定指導(dǎo)依據(jù)。

    在本實(shí)驗(yàn)中,13種莢蒾屬植物提取到高質(zhì)量ITS2序列的成功率為100%,ITS2序列的種內(nèi)變異均較小,具有良好的穩(wěn)定性。13種莢蒾屬植物ITS2序列種內(nèi)最大遺傳距離均小于種間最小遺傳距離;將所有樣品的ITS2序列基于以鄰接法、最大簡(jiǎn)約法、最大似然法估計(jì)構(gòu)建NJ樹(shù)的結(jié)果表明,各種莢蒾屬植物均獨(dú)自聚為一支,表現(xiàn)出良好的單系性。證實(shí)ITS2條形碼序列能準(zhǔn)確鑒別莢蒾屬藥用植物。綜上所述,ITS2序列可用于莢蒾屬藥用植物的鑒定,是基于分子條形碼技術(shù)鑒定的理想序列。

    注:Bootstrap 1000次重復(fù),支上數(shù)值僅顯示自展支持率≥50%。圖1 樣品ITS2序列構(gòu)建的13種莢蒾屬植物的NJ系統(tǒng)聚類(lèi)樹(shù)

    4.2 研究展望

    本實(shí)驗(yàn)主要研究了我國(guó)分布在四川、湖北等地的川西莢蒾、皺葉莢蒾、珊瑚樹(shù)莢蒾等品種,還有許多莢蒾屬其他品種沒(méi)有進(jìn)行全面采集研究,需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣品量來(lái)驗(yàn)證鑒定體系的精密性與有效性。

    本研究通過(guò)ITS2序列鑒定,可以確切鑒定物種是否為莢蒾屬植物,并且可以初步確定被測(cè)樣品物種,為后續(xù)的莢蒾屬鑒定體系鑒定發(fā)展打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。在后續(xù)的研究中,可以在本研究采用的ITS2序列的基礎(chǔ)上,使用psbA-trnH、rbcL、matK等其他DNA條形碼序列進(jìn)行延伸研究和輔助驗(yàn)證。從而構(gòu)建更加準(zhǔn)確、快速的莢蒾屬植物DNA條形碼鑒定體系,并輔以傳統(tǒng)的鑒定方法,為莢蒾屬植物鑒定提供有力的方法。

    5 總結(jié)

    本研究通過(guò)莢蒾屬植物樣品DNA提取、ITS2序列和psbA-trnH序列擴(kuò)增、DNA條形碼測(cè)序以及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析,確定了莢蒾屬植物種間鑒定體系,不僅可以初步進(jìn)行莢蒾屬植物鑒定,為日后更加準(zhǔn)確、快速地鑒定莢蒾屬植物打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ),從而更好地進(jìn)行莢蒾屬植物的開(kāi)發(fā)與利用研究。

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