鹽酸左西替利嗪對(duì)人毛乳頭細(xì)胞生長(zhǎng)影響的初步研究

韋菊梅 溫斯健 包家娟 莊曉晟 林有坤

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科，南寧 530022

雄激素性禿發(fā)（androgenetic alopecia，AGA）是一種雄激素依賴的、多種基因和環(huán)境因素共同作用的遺傳性疾病。目前臨床上用于AGA治療最有效的藥物是非那雄胺和米諾地爾，但前者有影響男性性功能的潛在不良反應(yīng)，后者會(huì)發(fā)生多毛癥、接觸性皮炎、頭痛和低血壓等不良反應(yīng)[1]。國(guó)外的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，AGA 患者禿發(fā)區(qū)局部外用1%西替利嗪后毛發(fā)的總密度顯著增加，而毳毛的密度明顯降低[2]。前列腺素（prostaglandin，PG）具有介導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化及凋亡等多種機(jī)體生理功能，廣泛存在于各組織和體液中。在環(huán)氧化酶（COX）作用下，花生四烯酸轉(zhuǎn)變?yōu)椴环€(wěn)定的前列腺素H2，然后通過相應(yīng)的酶進(jìn)一步加工為各種有生物活性的前列腺素，包括前列腺素 D2（PGD2）、PGE2、PGF2α 和PGI2等。通過比較不同亞型的前列腺素對(duì)頭發(fā)生長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)PGE2 和PGF2α 可促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)，而PGD2則能抑制毛發(fā)生長(zhǎng)，加劇毛囊微型化的發(fā)生[3]。研究證實(shí)，鹽酸左西替利嗪通過與COX-2結(jié)合抑制其促前列腺素表達(dá)的能力[4]。我們通過研究鹽酸左西替利嗪對(duì)人毛乳頭細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖以及PG 相關(guān)信號(hào)因子表達(dá)的影響，初步探討其影響毛發(fā)生長(zhǎng)的作用及其分子機(jī)制。

材料和方法

一、主要試劑與儀器

高糖DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)gibco 公司）。鹽酸左西替利嗪原藥粉劑（重慶華邦制藥有限公司）、兔抗人α 平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）抗體（美國(guó)PTGlab公司）、Cy3標(biāo)記的山羊抗兔IgG（IgGCy3，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）、四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT，美國(guó)sigma 公司）。細(xì)胞RNA、小分子RNA、DNA 和蛋白質(zhì)共提取試劑盒（美國(guó)Magan 公司）、逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR 試劑盒（日本TAKARA公司）、BCA蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。小鼠單克隆肌動(dòng)蛋白抗體、山羊抗小鼠IgG、前列腺素D2合酶（PTGDS）兔單克隆抗體、山羊抗兔IgG（美國(guó)abcam公司）。PGD2酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）、PGD2 受體ELISA 試劑盒（江蘇晶美生物科技有限公司）。酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）、熒光定量PCR儀（瑞士Roche公司）、凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)GE公司）。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：人毛乳頭細(xì)胞（human dermal papilla cells，hDPC）系（德國(guó)Promocell 公司）解凍復(fù)蘇后加入含15%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基（簡(jiǎn)稱15% DMEM 條件培養(yǎng)基），于培養(yǎng)箱（37 ℃、5%CO2，培養(yǎng)條件下同）中培養(yǎng)24 h 后，視培養(yǎng)情況隔1 ～2 天換液1 次，細(xì)胞匯合至80%時(shí)傳代、凍存。取凍存細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)，第2代hDPC細(xì)胞消化后用于以下實(shí)驗(yàn)。

2.免疫熒光觀察hDPC 的生長(zhǎng)情況：hDPC 細(xì)胞以1.5×105/孔接種于6孔板，每孔加15%DMEM條件培養(yǎng)液2 ml，細(xì)胞貼壁后換用含有0（對(duì)照組）、1、10、100、1 000、10 000 μg/L 鹽酸左西替利嗪的15%DMEM條件培養(yǎng)液[5]培養(yǎng)48 h。細(xì)胞爬片后用含吐溫20的磷酸鹽緩沖溶液（PBST）浸洗，4%多聚甲醛固定，1%BSA封閉，兔抗人α-SMA抗體4 ℃濕盒內(nèi)過夜，PBST 浸洗，加入IgG-Cy3 室溫避光孵育1 h，DAPI染核，熒光顯微鏡下觀察。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.MTT 測(cè)定細(xì)胞增殖率：hDPC 細(xì)胞1 × 104/孔接種于96 孔板，每孔加15%DMEM 條件培養(yǎng)液200 μl，細(xì)胞貼壁后換用含有0（對(duì)照組）、1、10、50、100、250、500、1 000、10 000、100 000 μg/L鹽酸左西替利嗪的15%DMEM條件培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，設(shè)置調(diào)零孔，每濃度設(shè)5 個(gè)復(fù)孔。后予PBST 洗2 次，再加入含有MTT 的無血清DMEM 培養(yǎng)液，37 ℃孵育4 h 后，每孔加150 μl 二甲基亞砜，避光，低速振蕩10 min，于490 nm 波長(zhǎng)測(cè)吸光度（A值）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。細(xì)胞增殖率（%）=（實(shí)驗(yàn)孔A值-調(diào)零孔A值）（/對(duì)照組A值-調(diào)零孔A值）×100%。

4.實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測(cè) COX-2、PGE2、PGF2α、PTGDS、G 蛋白偶聯(lián)受體44（GPR44）、蛋白激酶B（AKT）、糖原合成激酶3β（GSK3β）mRNA 的表達(dá)：hDPC細(xì)胞以1.5×105/孔接種于6孔板，每孔加15%DMEM條件培養(yǎng)液2 ml，細(xì)胞貼壁后換用含有0（對(duì)照組）、1、10、100、1 000、10 000 μg/L鹽酸左西替利嗪的DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h。棄上清液后按細(xì)胞RNA、小分子RNA、DNA和蛋白質(zhì)共提取試劑盒操作步驟分別提取細(xì)胞總RNA和總蛋白質(zhì)。

（1）mRNA 表達(dá)水平檢測(cè)：總RNA 采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA 模板，目的基因引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列見表1。熒光定量PCR按試劑盒說明書操作，反應(yīng)體系為20 μl，95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性3 s，60 ℃退火延伸30 s，共45 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后分析擴(kuò)增曲線，以β 肌動(dòng)蛋白基因?yàn)閮?nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA 的相對(duì)表達(dá)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。實(shí)驗(yàn)組ΔCt=實(shí)驗(yàn)組Ct值 - 內(nèi)參 Ct 值，對(duì)照組 ΔCt = 對(duì)照組 Ct 值 - 內(nèi)參Ct值，ΔΔCt= 實(shí)驗(yàn)組ΔCt- 對(duì)照組ΔCt。

（2）Western印跡法檢測(cè)PTGDS的蛋白水平：取提取的總蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯膜（PVDF）。1%牛血清白蛋白（BSA）封閉1.5 h后，加入相應(yīng)的肌動(dòng)蛋白抗體、PTGDS抗體（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，加入二抗室溫孵育1 h。凝膠成像系統(tǒng)成像。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

5.ELISA 法檢測(cè) hDPC 培養(yǎng)上清液中 PGD2 和PGD2R水平：hDPC細(xì)胞以2×105/孔接種于6孔板，每孔加15%DMEM條件培養(yǎng)液2 ml，細(xì)胞貼壁后換用含有0（對(duì)照組）、1、10、100、1 000、10 000 μg/L鹽酸左西替利嗪的無血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，采集細(xì)胞培養(yǎng)液，3 000 r/min，離心5 min（離心半徑8 cm），取上清液，按試劑盒說明書操作，測(cè)定PGD2和PGD2R水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17.0 軟件，計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、免疫熒光觀察hDPC的生長(zhǎng)情況

100 μg/L 組細(xì)胞生長(zhǎng)良好，排列緊密，胞質(zhì)豐富，融合度超過90%。對(duì)照組細(xì)胞融合度約70%～80%；10 000 μg/L組細(xì)胞稀疏，數(shù)量減少，細(xì)胞間連接不緊密，融合度不到60%。見圖1。

表1 目的基因引物序列

圖1 免疫熒光觀察不同濃度鹽酸左西替利嗪對(duì)人毛乳頭細(xì)胞生長(zhǎng)的影響（α-SMA染色×40）

二、鹽酸左西替利嗪對(duì)hDPC增殖的影響

MTT 結(jié)果顯示，不同濃度鹽酸左西替利嗪組hDPC細(xì)胞的增殖率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=42.22，P＜ 0.05），10、50、100、250、500 μg/L 組高于對(duì)照組（t值分別為 5.31、12.68、28.26、32.43、13.01，均P＜0.05），1、1 000 μg/L 組與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值分別為 0.11、0.66，均P＞ 0.05），10 000、100 000 μg/L 組低于對(duì)照組（t值分別為 143.95、161.26，均P＜ 0.05）。見圖2。

圖2 鹽酸左西替利嗪對(duì)人毛乳頭細(xì)胞體外培養(yǎng)增殖的影響1 ～ 10：分別為0、1、10、50、100、250、500、1 000、10 000、100 000 μg/L鹽酸左西替利嗪。a：與對(duì)照組比較，P ＜0.05

三、鹽酸左西替利嗪對(duì)COX-2、PGE2、PGFα、PTGDS、GPR44、AKT、GSK3β mRNA 表達(dá)及PGD2、PGD2R水平的影響

不同濃度鹽酸左西替利嗪組的COX-2、PGF22、PTGDS、GPR44、AKT mRNA 表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），100 μg/L組COX-2、PTGDS、GPR44 表達(dá)低于對(duì)照組（t值分別為 1.97、2.17、2.66，均P＜ 0.05），PGF2α、AKT 的表達(dá)高于對(duì)照組（t值分別為3.66、7.32，均P＜ 0.05）。不同濃度鹽酸左西替利嗪組的PGE2、GSK3β 表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。見表2。

四、鹽酸左西替利嗪對(duì)hDPC PTGDS蛋白水平的影響

不同濃度鹽酸左西替利嗪組PTGDS 蛋白水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），各濃度組均低于對(duì)照組（t值分別為 11.58、12.54、5.67、8.42、8.16，均P＜ 0.05）。見表2、圖3。

五、鹽酸左西替利嗪對(duì)hDPC PGD2和PGD2受體分泌的影響

ELISA 法結(jié)果顯示，不同濃度鹽酸左西替利嗪組hDPC 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的PGD2 和PGD2 受體水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。10 ～10 000 μg/L 組PGD2、PGD2R 蛋白水平明顯低于對(duì)照組（t值分別為 20.75、45.07、87.09、101.62 和46.72、92.05、90.67、83.16，均P＜ 0.05），1 μg/L組與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值分別為0.26、1.72，P＞ 0.05）。見表3。

表2 不同濃度鹽酸左西替利嗪處理對(duì)人毛乳頭細(xì)胞相關(guān)基因mRNA、蛋白水平的影響（±s）

表2 不同濃度鹽酸左西替利嗪處理對(duì)人毛乳頭細(xì)胞相關(guān)基因mRNA、蛋白水平的影響（±s）

注：n=3。COX-2：環(huán)氧化酶2；PGE2：前列腺素E2；PGF2α：前列腺素F2α；PTGDS：前列腺素D2合酶；GPR44：G蛋白偶聯(lián)受體44；AKT：蛋白激酶B；GSK3β：糖原合成激酶3β。PTGDS蛋白水平檢測(cè)采用Western印跡法。a 與對(duì)照組相比，P ＜0.05

鹽酸左西替利嗪濃度0（對(duì)照組）1 μg/L 10 μg/L 100 μg/L 1 000 μg/L 10 000 μg/L F值P值mRNA水平（2-ΔΔCt）PTGDS蛋白COX-2 1 0.97±0.09 0.90±0.10 0.84±0.08a 1.05±0.11 1.13±0.09 1.97 0.028 PGE2 1 1.09±0.21 0.88±0.10 0.96±0.14 1.27±0.44 1.12±0.20 0.87 0.399 PGF2α 1 1.66±0.22a 1.65±0.14a 1.96±0.25a 1.61±0.16a 1.51±0.59 3.66 0.034 PTGDS 1 0.96±0.08 0.83±0.09a 0.81±0.10a 0.86±0.08a 0.99±0.11 2.17 0.045 GPR44 1 1.07±0.12 0.98±0.02 0.85±0.09a 1.02±0.05 1.05±0.08 2.66 0.042 AKT 1 1.35±0.09a 1.66±0.19a 1.74±0.32a 1.60±0.24a 1.78±0.11a 7.32 0.002 GSK3β 1 0.99±0.08 0.93±0.08 0.90±0.06 0.85±0.95 0.81±0.09 1.19 0.371 0.73±0.06 0.50±0.04a 0.54±0.09a 0.32±0.05a 0.43±0.05a 0.44±0.10a 11.84＜0.05

討 論

研究發(fā)現(xiàn)，位于毛囊基底部的毛乳頭細(xì)胞可誘導(dǎo)上皮細(xì)胞增殖分化形成毛囊，調(diào)控毛發(fā)生長(zhǎng)周期，在AGA 的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用[6]。Garza 等[7]證實(shí)，AGA 患者禿發(fā)區(qū) PTGDS 與 PGD2的mRNA和蛋白質(zhì)水平同時(shí)升高，尤其是當(dāng)毛囊毛發(fā)處于生長(zhǎng)期向退行期轉(zhuǎn)變時(shí)，變化更為明顯，PGD2 局部外用于移植人毛囊的小鼠，能夠抑制GPR44，使毛囊微型化，導(dǎo)致小鼠的毛發(fā)稀疏、脫落[8]。PGD2 是重要的炎癥調(diào)節(jié)分子，主要通過與PTGDR 和GPR44 相互作用而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[9-10]。作為PGD2的受體，GPR44不僅表達(dá)于毛囊外根鞘內(nèi)，還表達(dá)于外鞘區(qū)的真皮毛乳頭中[11-12]。此外，在小鼠模型上過表達(dá)COX-2，同樣會(huì)出現(xiàn)脫發(fā)的情況[13]。國(guó)外已有使用PTGDS 抑制劑治療AGA 報(bào)道[14]。這些證據(jù)提示，前列腺素參與了毛發(fā)生長(zhǎng)過程，且有可能成為脫發(fā)疾病新的靶向治療位點(diǎn)。Charlesworth 等[15]發(fā)現(xiàn)，西替利嗪不僅能抑制炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，還能明顯降低PGD2的表達(dá)。鹽酸左西替利嗪通過與COX-2結(jié)合，降低前列腺素的表達(dá)水平[3]，這些效應(yīng)與它們的抗組胺活性無關(guān)。Jeong 等[16]發(fā)現(xiàn)，PGD2 通過調(diào)控 hDPC 上的 DP2 和AKT 信號(hào)通路，引起雄激素受體活化，進(jìn)而導(dǎo)致TGFβ1、Creb、LEF1 和 IGF-1 等毛發(fā)生長(zhǎng)抑制因子的產(chǎn)生。AKT信號(hào)通路可激活下游靶蛋白基因，促進(jìn)毛囊干細(xì)胞的增殖，參與毛乳頭細(xì)胞的增殖、分化，在調(diào)控毛囊的發(fā)育和再生中發(fā)揮重要作用[17]。截止目前，尚無鹽酸左西替利嗪對(duì)毛發(fā)生長(zhǎng)調(diào)控分子機(jī)制的研究報(bào)道?；诖?，我們利用hDPC 探討了鹽酸左西替利嗪與毛發(fā)生長(zhǎng)的關(guān)系。

圖3 不同濃度（μg/L）鹽酸左西替利嗪處理人毛乳頭細(xì)胞細(xì)胞前列腺素D2合酶蛋白水平

表3 不同濃度鹽酸左西替利嗪對(duì)人毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)上清液中前列腺素D2、前列腺素D2受體水平的影響（±s,ng/L）

表3 不同濃度鹽酸左西替利嗪對(duì)人毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)上清液中前列腺素D2、前列腺素D2受體水平的影響（±s,ng/L）

注：n=3。a 與對(duì)照組相比，P ＜ 0.05

鹽酸左西替利嗪濃度0（對(duì)照組）1 μg/L 10 μg/L 100 μg/L 1 000 μg/L 10 000 μg/L F值P值前列腺素D2 180.08±6.15 178.15±2.72 158.92±2.72a 141.62±5.44a 126.23±4.57a 124.31±4.84a 66.15＜0.01前列腺素D2受體273.24±3.18 265.74±7.42 237.58±7.96a 215.08±9.55a 188.82±12.20a 181.95±13.79a 44.33＜0.01

本研究顯示，鹽酸左西替利嗪可明顯促進(jìn)hDPC 的增殖，而且在100 μg/L 濃度時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)良好、增殖率明顯升高。實(shí)時(shí)定量PCR 結(jié)果顯示，100 μg/L 鹽酸左西替利嗪能明顯抑制COX-2、PTGDS、GPR44 mRNA 的 表 達(dá) ，同 時(shí) 促 進(jìn) AKT mRNA的表達(dá)。Western印跡法及ELASA法結(jié)果同樣顯示，鹽酸左西替利嗪能降低PTGDS、PGD2及其受體的蛋白表達(dá)水平。這些結(jié)果提示，鹽酸左西替利嗪可能通過抑制PGD2-GPR44通路，激活A(yù)KT信號(hào)通路，促進(jìn)體外培養(yǎng)hDPC的生長(zhǎng)、增殖。本研究還發(fā)現(xiàn)，鹽酸左西替利嗪能促進(jìn)PGF2α 的表達(dá)，但并未對(duì)PGE2 的表達(dá)產(chǎn)生影響，二者雖同為前列腺素，但對(duì)毛發(fā)生長(zhǎng)的作用卻與PGD2的相反。2009年美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)臨床上可常規(guī)使用PGF2α 的類似物拉坦普羅斯特促進(jìn)人睫毛生長(zhǎng)[18]，PGE2 也被證實(shí)可改善經(jīng)輻射誘導(dǎo)的小鼠脫毛[19]。目前實(shí)驗(yàn)尚未涉及AKT 下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及PGF2α 調(diào)控機(jī)制的研究。而且，在活體復(fù)雜條件下，鹽酸左西替利嗪對(duì)PGD2- GPR44 的調(diào)控規(guī)律也待進(jìn)一步研究。

綜上，本實(shí)驗(yàn)以鹽酸左西替利嗪作為干預(yù)因素，證明鹽酸左西替利嗪能促進(jìn)hDPC 的生長(zhǎng)、增殖，還可明顯抑制PGD2-GPR44 通道上相關(guān)因子COX-2、PTGDS、PGD2、PGD2R、GPR44 的表達(dá)，并初步探討了AKT 信號(hào)通路在該過程中所起的作用，為鹽酸左西替利嗪治療雄激素性禿發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突