魚源無乳鏈球菌的血清型及分子分型研究

張雨薇耿 毅余澤輝汪開毓陳德芳向正剛李亞軍郭坤寧牟維豪

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院, 溫江 611130; 2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)系, 溫江 611130)

魚源無乳鏈球菌的血清型及分子分型研究

張雨薇1耿 毅1余澤輝1汪開毓1陳德芳2向正剛1李亞軍1郭坤寧1牟維豪1

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院, 溫江 611130; 2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)系, 溫江 611130)

為了解不同魚源無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)分子分型特征, 分析菌株之間的相關(guān)性和同源性,研究在采用S.agalactiae特異性cfb基因?qū)Ψ蛛x菌株鑒定的基礎(chǔ)上, 對26株不同魚源S.agalactiae進行了莢膜多糖血清型(CPS)多重PCR鑒定, 同時采用多位點序列分型(MLST)和脈沖場凝膠電泳(PFGE)進行分子特征比較與同源性分析。結(jié)果顯示, 26株菌CPS型存在Ia (n=22)和III型(n=4)兩種類型, 其中黃河裸裂尻魚源和羅非魚源菌株均為Ia血清型, 齊口裂腹魚源菌株存在Ia (n=2)和III (n=4)型兩種CPS型; 多位點序列分型共得到3種STs序列型(ST-891、ST-103、ST-19), 其中黃河裸裂尻魚源和羅非魚源菌株均為新的序列型ST-891, 齊口裂腹魚源菌株存在ST-103和ST-19兩種STs型; PFGE聚類分析可分為16個PFGE譜型(A-P), 其中優(yōu)勢帶型為P型(n=9)。相同莢膜多糖血清型—MLST分型菌株在PFGE帶型中呈現(xiàn)高度聚集。CPS分型與MLST分型、PFGE分型有很好的相關(guān)性, 而CPS型、STs序列型、PFGE帶型與宿主的來源沒有明顯的相關(guān)性。不同魚源S.agalactiae分子特征的相似性, 提示其存在交叉感染的可能性, 而齊口裂腹魚源S.agalactiae分子特征的多樣性, 提示其存在遺傳變異的情況。

無乳鏈球菌; 莢膜多糖血清分型; 多位點序列分型; 脈沖場凝膠電泳

無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae), 屬于鏈球菌科(Streptococcace), 鏈球菌屬(Streptococcus),也稱B群鏈球菌(Group B Streptococcus, GBS), 是兼性厭氧G+的鏈狀球菌。在自然情況下無乳鏈球菌可感染海鯛(Sparus auratus)[1]、銀鯧(Pampus argenteus)[2]、羅非魚(Orechromis niloticus)[3]、齊口裂腹魚(Schizothotax prenanti)[4]、寶石鱸(Scrotum barcoo)[5]、紅尾皇冠魚(Aequidens rivulatus)[6]等野生或養(yǎng)殖的淡海水魚類, 每年給世界水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重的損失[7]。莢膜多糖是無乳鏈球菌最主要的毒力因子之一, 莢膜多糖血清分型(CPS)被廣泛應(yīng)用于無乳鏈球菌分子流行病學(xué)中, 其重復(fù)性好、特異性強且易于操作[8]。根據(jù)莢膜多糖基因簇的差異, 無乳鏈球菌可分為10種血清型(Ia、Ib、IIIX型)[9], 其中Ia和III型是魚源無乳鏈球菌的主要流行血清型[3]。Chen等[10]報道人源Ia、III和V血清型無乳鏈球菌能夠感染羅非魚, 但在不同魚源無乳鏈球菌之間是否存在交叉感染情況還有待進一步的研究。

目前有很多分子分型的方法被應(yīng)用于無乳鏈球菌的流行病學(xué)監(jiān)控[11], 其中就包括多位點序列分型(Multilocus Sequence Typing, MLST)和脈沖場凝膠電泳(Pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)技術(shù)。Lusiastuti等[12]運用MLST方法對魚源和牛源無乳鏈球菌進行分子分型研究發(fā)現(xiàn)二者屬于不同的STs型, 推測無交叉感染的可能性。Kayansamruaj等[13]也通過RAPD、血清分型和MLST分析分子差異性, 認為魚源無乳鏈球菌和人源、牛源無乳鏈球菌無相關(guān)性, 但也有報道推測人源和牛源無乳鏈球菌能夠感染羅非魚[14], 而羅非魚源無乳鏈球菌能夠感染其他的魚類[1]。目前, 對于我國不同魚源無乳鏈球菌間分子分型的比較研究還未見報道, 本研究對26株不同魚源的無乳鏈球菌進行了CPS血清型的鑒定, 同時采用MLST和PFGE技術(shù)對其進行分子分型研究, 目的在于掌握目前我國不同魚源無乳鏈球菌的分子特征, 為我國魚類無乳鏈球菌感染的有效防控措施的制訂提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

不同魚源無乳鏈球菌菌株由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)魚病研究中心在2006—2015年分離并保存(表 1), 菌株總數(shù)為27株, 其中齊口裂腹魚源6株、黃河裸裂尻魚源10株、羅非魚源10株及無乳鏈球菌標準菌株(ATCC51487)1株。

1.2 試驗材料與設(shè)備儀器

腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)購自杭州微生物試劑有限公司, 無乳鏈球菌標準菌株ATCC51487購自美國菌種保藏中心, 細菌DNA抽提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司, DNA Marker和蛋白酶K購自大連TaKaRa公司, Sma I和溶菌酶購自生工生物工程(上海)股份有限公司, Sigma1-15普通離心機購自Sigma公司, GelDoc2000凝膠成像分析系統(tǒng)、Pulsed Field Certified Agarose、Quantity One?軟件和CHEF Mapper?XA系統(tǒng)均購自Bio-Rad公司。

1.3 菌株的復(fù)蘇與PCR特異性檢測

將保存于–80℃無乳鏈球菌的保存液取出, 于常溫下解凍復(fù)蘇。在無菌條件下, 用移液槍吸取10 μL保菌液劃線于BHI平板上, 28℃恒溫培養(yǎng)48h后, 革蘭氏染色觀察細菌形態(tài)特征。對復(fù)蘇無乳鏈球菌菌株的特異性鑒定參照王鈞等[15]的方法進行PCR檢測, cfb基因特異性引物(F: 5′-AAGTACATG CTGATCAAGT-3′, R: 5′-TCTTGATCAACTTGTTG TAC-3′)由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進行合成, 預(yù)期擴增片段600 bp。25 μL的PCR反應(yīng)體系: PCR Master Mix (2×)12.5 μL、10 μmol/L的上下游引物各1 μL, 2 μL模板DNA, 加ddH2O至25 μL。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果并拍照記錄。

表 1 無乳鏈球菌菌株相關(guān)信息Tab.1 The relevant information of S.agalactiae

1.4 莢膜多糖分子血清分型

采用文獻[16]的莢膜多糖差異建立的多重PCR方法鑒別不同動物源性無乳鏈球菌的莢膜多糖血清型。25 μL的PCR反應(yīng)體系為: PCR Master Mix (2×)共12.5 μL, 2 μL模板DNA, 10 μmol/L的cpsG上下游引物各0.5 μL, 10 μmol/L的cpsL上下游引物各1 μL, 7.5 μL的ddH2O。反應(yīng)條件: 首先95℃ 5min使變性;隨后95℃ 60s、54℃ 60s、72℃ 2min, 15個循環(huán); 接著95℃ 60s、56℃ 60s、72℃ 2min, 25個循環(huán); 最后72℃ 10min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果并拍照記錄。

1.5 無乳鏈球菌的MLST基因分型分析

多位點序列分型的PCR擴增引物序列參照文獻[17], 選取7個管家基因adhP、pheS、atr、glnA、sdhA、glcK、tkt進行PCR擴增, 相應(yīng)引物(表 2)由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。25 μL的PCR反應(yīng)體系: PCR Master Mix (2×)共12.5 μL, 10 μmol/L的上下游引物各1 μL, 2 μL模板DNA, 8.5 μL的ddH2O。反應(yīng)條件：95℃ 5min；94℃ 45s、55℃45s、72℃ 45min, 33個循環(huán)；72℃ 10min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測, 產(chǎn)物送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序。測序結(jié)果提交至MLST數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站(http://pubmlst.org/)進行BLAST分析, 獲得菌株的等位基因編號及序列型(Sequence types, STs), 未能成功BLAST出菌株序列型的則提交菌株的7個等位基因編號及菌株具體信息至MLST網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫獲得新的序列編號。Clustal1.83將每株菌的7個管家基因的片段進行拼接后, 結(jié)果用MEGA5.02制作Neighbor-Joining種系進化樹。

1.6 無乳鏈球菌PFGE分型分析

參照文獻[18]中的試驗方法操作, 主要步驟: 無乳鏈球菌接種于BHI, 28℃培養(yǎng)48h后, 用無菌接種環(huán)挑取單菌落溶于TE緩沖液(100 mmol/L Tris、100 mmol/L EDTA, pH為7.6)中, 制成細菌懸濁液;用10 mg/mL的溶菌酶、20 mg/mL的蛋白酶K和1 mg/mL的變?nèi)芫叵毦? 將細菌懸濁液與凝膠溶液(每23.5 mL 0.5×TBE緩沖液中加入0.35 g低熔點瓊脂糖)混合制成膠塊。用50 U的Sma I限制性內(nèi)切酶對膠塊DNA進行酶切。在CHEF Mapper? XA進行電泳。電泳程序為: 電壓為6 V/cm, 脈沖時間為10—45s, 電泳夾角為120°, 電泳時間為18h, 電泳溫度保持在14℃。PFGE圖像用Quantity One 4.6.2軟件進行建樹, 采用非加權(quán)組平均法(UPGMA)對PFGE圖像進行聚類分析, 以相似性系數(shù)(F)>85%作為同類株的判斷標準[19]。

表 2 無乳鏈球菌管家基因位點的相關(guān)試驗參數(shù)Tab.2 The parameters of the housekeeping gene locus of S.agalactiae

2 結(jié)果

2.1 菌株復(fù)蘇與基于cfb基因的特異性檢測

26株不同魚源無乳鏈球菌在28℃培養(yǎng)48h, 則在BHI上形成表面光滑、微隆起、邊緣整齊的乳白色圓形菌落。革蘭氏染色鏡檢發(fā)現(xiàn)所有無乳鏈球菌均為球形, 單個、成雙或鏈狀排列。使用引物cfb-F和cfb-R分別擴增26株無乳鏈球菌及ATCC51487標準菌株的cfb基因均可獲得長度約為600 bp的清晰條帶。

2.2 莢膜多糖血清分型結(jié)果

26株菌血清型PCR鑒定結(jié)果顯示擴增出272和688 bp兩個片段為血清型Ia型菌株, 共22株。擴增出352和688 bp兩個片段為血清型III型菌株, 共4株。齊口裂腹魚源無乳鏈球菌中存在Ia (n=2, n指代數(shù)量)和III(n=4)型兩種血清型, 黃河裸裂尻魚源和羅非魚源無乳鏈球菌均只有Ia型一種血清型。

2.3 MLST的結(jié)果分析

26株無乳鏈球菌 AdhP、PheS、atr、glnA、sdhA、glcK和tkt7個管家基因PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后, 獲得與預(yù)期結(jié)果相一致、清晰的條帶。26株無乳鏈球菌中共出現(xiàn)了3種序列型(表 3), 其中ST-891(n=20, 76.9%)為優(yōu)勢血清型別, ST-19(n=4, 15.4%), ST-103(n=2, 7.7%), 同時ST-891為本次實驗獲得的新型序列號。圖 1進化樹結(jié)果表明STs與宿主的來源沒有明顯的相關(guān)性, 同一個ST-891序列型種既包含羅非魚源無乳鏈球菌, 又包含黃河裸裂尻魚源無乳鏈球菌; 同時齊口裂腹魚源無乳鏈球菌則分布于不同的STs型中(ST-19與ST-103)。

2.4 無乳鏈球菌PFGE分型分析

經(jīng)SmaⅠ酶切電泳后, 26株魚源無乳鏈球菌(黃河裸裂尻魚n=10, 羅非魚n=10, 齊口裂腹魚n=6)聚類分析可分為16個PFGE譜型(A-P)(圖 2)。其中優(yōu)勢帶型為P型9株, M型3株, 其余帶型各1株。在Cluster P中包含了3株羅非魚源無乳鏈球菌和6株黃河裸裂尻魚源無乳鏈球菌。UPGMA聚類分析結(jié)果顯示, 相同CPS血清型—STs型的無乳鏈球菌菌株在PFGE中呈現(xiàn)高度聚集。

3 討論

表 3 無乳鏈球菌測序菌株的等位基因型Tab.3 The alleles type of the sequencing bacterial strain of S.agalactiae

目前我國對于無乳鏈球菌的研究主要集中于耐藥性[20]、毒力因子[21]和疫苗研究[22]等方面, 而對于不同魚源無乳鏈球菌種間分子特征比較及其同源性分析的報道還很缺乏。莢膜多糖(Capsular polysaccharides, CPS)是特異性多糖, 無乳鏈球菌的主要毒力因子之一, 其血清型是由莢膜區(qū)域的血清特異基因決定[23]。傳統(tǒng)的血清型鑒定方法包括協(xié)同凝集試驗、免疫沉淀、酶免疫測定等, 但這些方法必須有特異性血清抗體且工作量較大[24], 已經(jīng)無法滿足無乳鏈球菌的分子流行病學(xué)研究。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和無乳鏈球菌全基因組測序完成,基于PCR[25]鑒定莢膜區(qū)域血清型特異性基因的檢測方法得到發(fā)展和完善, 該類方法在普通實驗室條件下即可完成, 分辨率高、重復(fù)性好且分析結(jié)果準確可靠。本研究中26株不同魚源無乳鏈球菌共鑒定出Ia (n=22)和III(n=4)型2種血清型, 其中黃河裸裂尻魚源和羅非魚源無乳鏈球菌均為Ia型, 齊口裂腹魚源無乳鏈球菌存在Ia (n=2)和III(n=4)型2 種血清型。血清分型結(jié)果與諸多已報道的魚源無乳鏈球菌大多為Ia和III型血清型結(jié)果相符[26,27], 表明我國魚源無乳鏈球菌的莢膜多糖血清型較為穩(wěn)定。

圖 1 不同魚源無乳鏈球菌的MLST的分子分型情況Fig.1 The molecular typing profiles of MLST of S.agalactiae isolated from fish

血清型分析僅是基于無乳鏈球菌的莢膜多糖進行的差異比較, 因此有必要結(jié)合更為準確、分辨率更高的基因分型方法, 如MLST和PFGE, 獲得更細微的基因差異信息, 同時與血清型進行比較分析,掌握更完整的無乳鏈球菌流行病學(xué)信息, 為追溯無乳鏈球菌的感染源及疾病的防治提供參考。MLST是無乳鏈球菌分子流行病學(xué)檢測的重要工具, 其優(yōu)勢在于操作簡單, 是標準化的核苷酸測序技術(shù), 且獲得的數(shù)據(jù)易于保存分析。本研究中共鑒定出3種STs型, 其中ST-891(n=20)為優(yōu)勢序列型且為新獲得的序列編號, 同時發(fā)現(xiàn)MLST分型與CPS血清型有很好的相關(guān)性, 黃河裸裂尻魚源和羅非魚源無乳鏈球菌CPS血清型均為Ia型且MLST分型均為ST-891; 齊口裂腹魚源無乳鏈球菌中CPS血清型為Ia型的MLST分型為ST-103(n=2), CPS血清型為III型的MLST分型為ST-19(n=4), 表明齊口裂腹魚源菌株分子分型具有多樣性, 提示其存在遺傳變異的情況。

PFGE分型技術(shù)對于流行性疾病的調(diào)查研究具有很高的辨識能力[28,29], 在實際應(yīng)用中常和MLST分型技術(shù)聯(lián)合監(jiān)測細菌的分子流行病學(xué)信息[30,31]。PFGE中采用限制性內(nèi)切酶Sma Ⅰ對無乳鏈球菌進行酶切分析, 并根據(jù)其條帶的差異性將其分型, 以相似性系數(shù)(F)>85%作為同類株的判斷標準共劃分為A-P16個譜型, 其中作為優(yōu)勢帶型的Cluster P包含了9株菌(羅非魚源n=3, 黃河裸裂尻魚源n=6)。且發(fā)現(xiàn)相同CPS–STs型菌株在PFGE脈沖場帶型中呈現(xiàn)高度聚集現(xiàn)象。但2種分子分型方法相比較發(fā)現(xiàn)PFGE具有更高的辨識度, 能分辨出的基因差異更大, 而MLST的數(shù)據(jù)可操控能力更強, 數(shù)據(jù)可重復(fù)利用率高, 能將不同實驗室之間的數(shù)據(jù)進行比較研究。因此, 這2種方法的結(jié)合將更為全面的展示不同魚源無乳鏈球菌的分子特征差異性。不同魚源無乳鏈球菌間分子特征的相似性提示其存在交叉感染的可能性, 而同種魚源無乳鏈球菌間分子特征的多樣性提示其發(fā)生了遺傳變異。雖然在本研究中還沒有探討人源、魚源和畜源無乳鏈球菌間分子特征的差異性, 但已有報道稱人源的無乳鏈球菌能夠感染魚類[32]。因此, 在將來有必要進一步開展人、畜與魚等不同動物源性無乳鏈球菌間的分子特征差異性研究, 分析菌株間的相關(guān)性和同源性,并追溯感染來源, 從而為無乳鏈球菌感染這種人獸共患病更科學(xué)有效的防治方案的制訂提供依據(jù)。

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SEROTYPES AND MOLECULAR TYPING OF STREPTOCOCCUS AGALACTIAE ISOLATED FROM FISH

ZHANG Yu-Wei1, GENG Yi1, YU Ze-Hui1, WANG Kai-Yu1, CHENG De-Fang2, XIANG Zheng-Gang1, LI Ya-Jun1, GUO Kun-Ning1and MOU Wei-Hao1
(1.Veterinary Medicine of Sichuan Agricultural University, Wenjiang 611130, China; 2.Aquaculture System of Sichuan Agricultural University, Wenjiang 611130, China)

To analyze molecular typing characteristics of Streptococcus agalactiae isolated from different fish sources and understand the correlation and homology between the strains, this study identified capsular polysaccharide serotype (CPS) with multiplex PCR for 26 S.agalactiae.Multilocus sequence typing (MLST) and pulsed field gel electrophoresis (PFGE) were adopted to study the molecular characteristics and homology based on the specific cfb gene of S.agalactiae.The results showed that CPS type had Ia (n=22) and III (n=4) two types, of which S.agalactiae isolated from Schizopygopsis pylzovi and tilapia were Ia, and S.agalactiae isolated from Schizothorax prenati existed Ia (n=2) and III (n=4) two types.Multilocus sequence typing

three STs sequence types (ST-891、ST-103、ST-19), among which the sequence types of S.agalactiae isolated from Schizopygopsis pylzovi and tilapia were new sequence type ST-891, and S.agalactiae isolated from Schizothorax prenati existed ST-19 and ST-103 two sequence types.PFGE cluster analysis created 16 banding patterns (A-P), and the cluster P was the preponderant type.Similar capsular polysaccharide serotype—MLST type strains presented high concentration in the PFGE type.CPS types, MLST types and PFGE types were correlated, but CPS types, STs sequence types and PFGE banding types had no obvious correlation with the host’s sources.The similarity of molecular characteristics of S.agalactiae isolated from different fish sources suggests the possibility of cross infection, and the diversity of molecular characteristics of Schizothorax prenati suggest the existence of heritable variation.

Streptococcus agalactiae; Capsular polysaccharide serotype; Multilocus sequence typing; Pulsed Field Gel Electrophoresis

S941.41

A

1000-3207(2017)04-0800-07

10.7541/2017.100

2016-07-10;

2016-11-04

四川省淡水魚產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團隊建設(shè)項目資助 [Supported by Sichuan Province Freshwater Fish Industry System Innovation Building Project Funding]

張雨薇(1992—), 女, 四川成都人; 碩士研究生; 研究方向為動物病原學(xué)與分子生物學(xué)。E-mail: 463714019@qq.com

耿毅(1974—), 男, 四川安岳人; 教授; 主要從事動物病原學(xué)與病理學(xué)的教學(xué)與研究工作。E-mail: gengyisicau@126.com