• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    黨參毛狀根誘導(dǎo)條件研究

    2017-05-30 08:39:23薛雯心劉立業(yè)袁金月劉琪魏鐵鎖鄭彥杰李秀霞
    安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年10期
    關(guān)鍵詞:黨參

    薛雯心 劉立業(yè) 袁金月 劉琪 魏鐵鎖 鄭彥杰 李秀霞

    摘要[目的]研究黨參毛狀根的誘導(dǎo)條件。[方法]利用發(fā)根農(nóng)桿菌A4、C58C1和A1476進行毛狀根誘導(dǎo),探討發(fā)根農(nóng)桿菌種類、外植體類型、菌液濃度、侵染時間和共培養(yǎng)天數(shù)等因素對黨參毛狀根誘導(dǎo)的影響。[結(jié)果]3種發(fā)根農(nóng)桿菌中A4誘導(dǎo)率最高;莖段的誘導(dǎo)率最高;發(fā)根農(nóng)桿菌濃度在OD600為0.4時誘導(dǎo)效果較好;較佳侵染時間為5 min;共培養(yǎng)時間為2 d時誘導(dǎo)率較高;頭孢噻肟鈉濃度為300 mg/L時除菌效果較好。[結(jié)論]該試驗為大量生產(chǎn)毛狀根以及毛狀根的后續(xù)研究提供試驗基礎(chǔ)。

    關(guān)鍵詞黨參;毛狀根;誘導(dǎo)條件;發(fā)根農(nóng)桿菌

    中圖分類號S567.5+3文獻標識碼A文章編號0517-6611(2017)10-0121-03

    Study on the Induction Condition of Hairy Roots of Codonopsis pilosula

    XUE Wenxin,LIU Liye,YUAN Jinyue,LI Xiuxia* et al

    (College of Life Science, Jiamusi University, Jiamusi,Heilongjiang 154007)

    Abstract[Objective] The research aimed to study the induction condition of hairy roots of Codonopsis pilosula.[Method] The hairy roots were induced by Agrobacterium rhizogenes strains of A4, C58C1 and A1476,the effects of Agrobacterium rhizogenes species, explants types, concentration of bacterium,infection time, cocultivation period on hairy roots inductivity of Codonopsis pilosula were discussed.[Result] Among the three Agrobacterium rhizogenes,the induction rate of A4 was the highest.The induction rate of stem was the highest.The inductivity at OD600 0.4 was better performing.Better infection time was five minutes.The inductivity was higher when the time of cocultivation was two days. When the concentration of cefotaxime sodium was 300 mg/L, the sterilization effect was better.[Conclusion] This test provides experimental basis for the mass production of hairy roots and followup study of the hairy roots.

    Key wordsCodonopsis pilosula;Hairy roots;Inducement condition;Agrobacterium rhizogenes

    黨參[Codonopsis pilosula(Franch.)Nannf.]屬桔??浦参颷1],多年生草質(zhì)藤本,以干燥根入藥[2],為我國常用大宗藥材之一[3]。我國是黨參屬藥材的主要產(chǎn)區(qū)和資源分布中心,全世界有黨參屬植物40 多種,我國就有39 種之多[4],主產(chǎn)于山西、陜西、甘肅等地[5]。幾十年來,在原有研究基礎(chǔ)上,國內(nèi)外對黨參化學(xué)成分進行了深入研究[6]。黨參屬藥用植物所含化學(xué)成分相似,主要有聚炔類、萜及三萜皂苷類、苯丙素類、茲醇、生物堿、倍半萜內(nèi)酯、香豆素等多種類型的化學(xué)成分。從黨參中還分離得到多糖類、甾類、揮發(fā)油成分、多種氨基酸和微量元素[7]。

    現(xiàn)代藥理研究表明,黨參具有調(diào)節(jié)血糖、促進造血、降壓、抗缺氧、耐疲勞、增強機體免疫力、調(diào)節(jié)胃腸收縮及抗?jié)兊榷嘀刈饔肹8],并常作為人參的替代品[9]。

    發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)是一種根瘤菌科的革蘭氏陰性菌[10],其侵染植物后,會使植物產(chǎn)生大量的不定根,這些不定根不斷分支,表現(xiàn)出毛狀,稱之為毛狀根(Hairy Roots)[11]。毛狀根具有遺傳性能穩(wěn)定、生長速度快、能夠合成該植物特征的次生代謝產(chǎn)物等特點。到1982年才報道發(fā)根農(nóng)桿菌侵染植物產(chǎn)生發(fā)狀根的機理,現(xiàn)已獲得了300多種植物的毛狀根體系[12],如王不留行[13]、南藥巴戟天[14]、太子參[15]、新疆紫草[16]等均有研究報道。毛狀根生產(chǎn)藥用植物有效成分已經(jīng)顯示出較好的應(yīng)用潛力,必將帶來可觀的社會效益和經(jīng)濟效益。因此,研究黨參毛狀根誘導(dǎo)及后續(xù)的大量培養(yǎng)等問題具有重要意義和廣闊的應(yīng)用發(fā)展前景。筆者利用發(fā)根農(nóng)桿菌A4、C58C1和A1476進行毛狀根誘導(dǎo),探討發(fā)根農(nóng)桿菌種類、外植體類型、菌液濃度、侵染時間和共培養(yǎng)天數(shù)等因素對黨參毛狀根誘導(dǎo)的影響。

    1材料與方法

    1.1材料

    外植體取自佳木斯大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實驗室培育的黨參無菌苗,發(fā)根農(nóng)桿菌A4、C58C1和 A1476由佳木斯大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院經(jīng)濟植物研究所提供。 預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基:MS,pH 5.8;共培養(yǎng)培養(yǎng)基:1/2MS+乙酰丁香酮(AS,100 mg/L);除菌培養(yǎng)基:MS+300 mg/L頭孢噻肟鈉,pH 5.8;菌種活化培養(yǎng)基:YEB培養(yǎng)基,pH 7.0;毛狀根繼代培養(yǎng)基:1/2MS,pH 5.8。

    1.2設(shè)備

    752N凌光紫外可見分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司制造);

    DZTW調(diào)溫電熱套(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司);

    恒溫振蕩器(中外合資深圳天南海北有限公司);

    150G振蕩培養(yǎng)箱(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司);

    SPX-250B-G型光照培養(yǎng)箱(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);

    JA1003電子天平(上海舜寧恒平科學(xué)儀器有限公司);

    SZ-97自動三重水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)。

    1.3試驗方法

    1.3.1無菌苗的培養(yǎng)。

    將種子去掉邊緣種翅,在自來水下沖洗30 min,75%乙醇消毒20 s,2%次氯酸鈉溶液滅菌20 min,無菌水清洗5~6次,用無菌濾紙吸去多余水分,然后在無菌工作臺上接種到MS培養(yǎng)基中,最后放在培養(yǎng)室內(nèi)進行培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為(25±1)℃,光照強度2 000~2 500 lx,光照時間12 h/d。

    1.3.2菌種的活化。

    挑取保存在-80 ℃滅菌甘油中的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株A4、C58C1和A1476,于YEB固體培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)后,轉(zhuǎn)接到Y(jié)EB液體培養(yǎng)基中,28 ℃、160 r/min振蕩暗培養(yǎng)。將處于對數(shù)生長期的菌液用于接種感染黨參外植體。

    1.3.3外植體的轉(zhuǎn)化方法。

    1.3.3.1外植體的預(yù)培養(yǎng)。

    選取生長健壯的無菌苗,在超凈工作臺上,將黨參葉片切成0.5 cm2的小塊,葉柄和莖段切成長為0.5 cm的小段,接種于MS培養(yǎng)基中,(25±1)℃暗處培養(yǎng)2 d。

    1.3.3.2侵染與共培養(yǎng)。

    將外植體浸入已活化好的菌液中5 min,侵染結(jié)束后取出外植體,先用無菌濾紙吸干菌液,然后接種到含乙酰丁香酮(100 μmol/L)的固體1/2MS培養(yǎng)基上,黑暗條件下培養(yǎng)2 d。

    1.3.3.3

    毛狀根誘導(dǎo)及除菌培養(yǎng)。

    共培養(yǎng)后,將外植體用無菌水清洗5次,用無菌濾紙吸干外植體表面的水分,然后轉(zhuǎn)接至含有300 mg/L頭孢噻肟鈉的除菌培養(yǎng)基上進行除菌培養(yǎng),每隔7 d繼代1次,經(jīng)反復(fù)除菌至培養(yǎng)基看不到菌斑。將長到2 cm左右的毛狀根剪下,轉(zhuǎn)入到含有IAA(1.0 mg/L)的1/2MS培養(yǎng)基上進行繼代培養(yǎng)。

    1.3.4各試驗條件梯度的設(shè)置。

    試驗所用發(fā)根農(nóng)桿菌種類為A4、C58C1和A1476;外植體的種類為莖段、葉片、葉柄;菌液濃度OD600的值設(shè)置為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8;侵染時間設(shè)置為5、10、20、30 min;共培養(yǎng)時間設(shè)置為1、2、3、4、5 d;頭孢噻肟鈉濃度設(shè)置為200、300、400、500 mg/L。

    2結(jié)果與分析

    2.1不同菌種的發(fā)根農(nóng)桿菌對黨參毛狀根誘導(dǎo)率的影響

    試驗結(jié)果表明(表1),A4和C58C1這2種菌株均能誘導(dǎo)出毛狀根,發(fā)根農(nóng)桿菌A1476沒有成功誘導(dǎo)出毛狀根。A4和C58C1菌株對黨參葉片的誘導(dǎo)率分別為56%和16%,可見A4和C58C1這2種菌株對黨參毛狀根的誘導(dǎo)能力有顯著的差別(圖1),A4的誘導(dǎo)能力明顯大于C58C1。

    表2.2不同外植體對黨參毛狀根誘導(dǎo)率的影響

    以A4菌株作為試驗菌株,結(jié)果表明(表2),外植體的類型對黨參毛狀根的誘導(dǎo)率存在一定影響,在除菌培養(yǎng)基中褐化最嚴重的是葉柄,葉片其次,莖段相對較好。莖段的毛狀根誘導(dǎo)率為48%,誘導(dǎo)率高,生根早;葉片誘導(dǎo)率次之,為30%;葉柄誘導(dǎo)率最低,為4%。通過A4菌液的侵染,莖段、葉片和葉柄都可以長出毛狀根,但不同類型的受體每一外植體生根的長度和數(shù)量也是不同的。因此,莖段為誘導(dǎo)毛狀根的最佳外植體。

    2.3菌液濃度對黨參毛狀根誘導(dǎo)率的影響

    以A4菌株作為試驗菌株,結(jié)果表明(表3),菌液濃度不同毛狀根的誘導(dǎo)率也不同。菌液濃度過高或過低均不利于提升轉(zhuǎn)化頻率,菌液濃度OD600為0.1~0.8,毛狀根的誘導(dǎo)率隨著菌液濃度的增加出現(xiàn)先增加后減小的趨勢。在菌液濃度OD600為0.4時,毛狀根的誘導(dǎo)率最高,為52%。當(dāng)菌液濃度OD600為0.8時,由于菌液濃度過高,導(dǎo)致外植體褐化嚴重,部分外植體已喪失生根能力。因此,誘導(dǎo)毛狀根的最佳菌液濃度OD600是0.4。

    2.4侵染時間對黨參毛狀根誘導(dǎo)率的影響

    由表4可知,侵染時間的長短對黨參毛狀根的誘導(dǎo)率有一定的影響,隨著侵染時間的延長,誘導(dǎo)率反而降低。其中侵染時間為5 min時,誘導(dǎo)率最高,為54%;當(dāng)侵染時間為10 min時,誘導(dǎo)率為18%,與侵染5 min的誘導(dǎo)率差別較大,誘導(dǎo)率的降低是因為侵染時間過長使后期菌株生長迅速,造成除菌困難;當(dāng)侵染時間為20 min時,多數(shù)外植體失去生命力而喪失誘發(fā)毛狀根的能力;當(dāng)侵染時間為30 min時,外植體褐化非常嚴重,24 h后已完全喪失生命力,生根率為0。表明當(dāng)侵染時間為5 min時侵染的效果最佳。

    2.5侵染后共培養(yǎng)時間對黨參毛狀根誘導(dǎo)率的影響

    以A4菌株作為試驗菌株,結(jié)果表明(表5),共培養(yǎng)時間對黨參毛狀根的誘導(dǎo)率有顯著的影響。共培養(yǎng)時間為2 d時,誘導(dǎo)率最高,為50%;共培養(yǎng)時間為1和3 d時誘導(dǎo)率相差不大,分別為36%和38%;共培養(yǎng)時間為4 d時,誘導(dǎo)率下降,為22%;當(dāng)共培養(yǎng)時間為5 d時,由于共培養(yǎng)時間過長,外植體周圍長滿了農(nóng)桿菌,造成除菌困難,誘導(dǎo)率僅為2%。因此,誘導(dǎo)毛狀根的最佳共培養(yǎng)時間為2 d。

    3小結(jié)與討論

    不同的植物對不同發(fā)根農(nóng)桿菌的敏感程度是不同的。該試驗選取了A4、C58C1和A1476 3種發(fā)根農(nóng)桿菌作為侵染菌種,試驗結(jié)果表明,3種發(fā)根農(nóng)桿菌僅A4和C58C1能使黨參誘導(dǎo)出毛狀根,其中A4誘導(dǎo)率較高。說明不同菌株具有不同的致根能力,可能是A4和C58C1對黨參比較敏感。

    選擇合適的外植體是建立誘導(dǎo)體系的重要任務(wù),以往研究表明,子葉、莖、葉及果實是使用較多的外植體,不同的植物最適外植體也存在較明顯的差異[17]。此試驗選取了黨參幼苗的莖段、葉片和葉柄作為轉(zhuǎn)化材料。試驗中觀察到,用莖段作為感染材料誘導(dǎo)率最高,葉片的誘導(dǎo)率其次,葉柄的誘導(dǎo)率最低。因此,莖段為誘導(dǎo)毛狀根的最佳外植體。

    菌液濃度對黨參毛狀根的誘導(dǎo)率有一定的影響。菌液濃度OD600為0.1~0.3時,誘導(dǎo)率隨濃度呈正相關(guān),菌液濃度OD600為0.8時,傷口處的細胞褐化非常嚴重,很快就失去了生命力。試驗結(jié)果表明,菌液濃度以O(shè)D600為0.4誘導(dǎo)率最高。除了菌液濃度之外,侵染時間也影響毛狀根的誘導(dǎo)率。在5 min時誘導(dǎo)率最高,10~20 min誘導(dǎo)率逐漸降低,30 min時生根率為0,因為侵染時間過長使后期菌株生長迅速,造成除菌困難,多數(shù)外植體失去生命力而喪失誘發(fā)毛狀根的能力。表明誘導(dǎo)毛狀根最佳的侵染時間為5 min。

    共培養(yǎng)時間是一個重要的因素。共培養(yǎng)時間過長時,外植體周圍長滿了農(nóng)桿菌,造成除菌困難,最終導(dǎo)致外植體褐化嚴重而喪失生根能力。如果共培養(yǎng)時間不足,則不能完成T-DNA轉(zhuǎn)移與整合,毛狀根的轉(zhuǎn)化不能實現(xiàn)。因此,較適宜的共培養(yǎng)時間為2 d,這樣既有效地提高了轉(zhuǎn)化率又不會讓農(nóng)桿菌大量繁殖,而且毛狀根多分枝,生長十分旺盛。

    試驗結(jié)果表明,在除菌培養(yǎng)基中添加不同濃度的頭孢噻肟鈉對黨參毛狀根的誘導(dǎo)率有顯著的影響。合適的頭孢噻肟鈉濃度不僅能起到很好的抑菌效果,而且對毛狀根的生長影響也較小。當(dāng)頭孢噻肟鈉濃度為200 mg/L時,培養(yǎng)基上有菌落出現(xiàn);當(dāng)頭孢噻肟鈉濃度為500 mg/L時,毛狀根完全不能生長;當(dāng)頭孢噻肟鈉濃度為300 mg/L時,毛狀根的生長情況最好。因此,選擇300 mg/L頭孢噻肟鈉作為除菌培養(yǎng)基更合適。

    45卷10期薛雯心等黨參毛狀根誘導(dǎo)條件研究

    參考文獻

    [1] 何亞杰.不同處理方法對黨參種子發(fā)芽的影響試驗[J].中藥材,2015(6):52,55.

    [2] 張延紅,高素芳,晉玲,等.黨參休眠芽離體培養(yǎng)時的叢生芽發(fā)生途徑研究[J].中藥材,2011,34(1):15-17.

    [3] 禹娟紅.不同產(chǎn)地黨參藥材質(zhì)量評價研究進展[J].中國中醫(yī)藥科技,2016,23(4):503-504.

    [4] 馬德滋,劉惠蘭,胡福秀.寧夏植物志:下卷[M].2版.銀川:寧夏人民出版社,2007:253.

    [5] 孫政華,邵晶,郭玫.黨參化學(xué)成分及藥理作用研究進展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,43(33):174-176.

    [6] 國家藥典委員會.中國藥典.2010年版(一部)[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2010:264.

    [7] 馮佩佩,李忠祥,原忠.黨參屬藥用植物化學(xué)成分和藥理研究進展[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報,2012,29(4):307-311.

    [8] 蘇寧寧,張麗萍.黨參種子真實性鑒定研究[J].中國現(xiàn)代中藥,2014,16(1):24-27.

    [9] 肖淑賢,李安平,孟瑞麗,等.黨參種子檢驗方法及質(zhì)量標準研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,42(14):4286-4290.

    [10] 王成龍,周美亮,邵繼榮,等.植物毛狀根的誘導(dǎo)及應(yīng)用[J].草業(yè)科學(xué),2015,32(5):770-779.

    猜你喜歡
    黨參
    孟河醫(yī)派黨參特色炮制品中黨參用藥品種考證
    Anticancer Properties of Lobetyolin, an Essential Component of Radix Codonopsis (Dangshen)
    復(fù)合酶輔助提取黨參中多糖工藝的優(yōu)化
    中成藥(2018年5期)2018-06-06 03:12:14
    黨參炔苷解吸-減壓內(nèi)部沸騰提取工藝的優(yōu)化
    中成藥(2018年3期)2018-05-07 13:34:21
    復(fù)方黨參口服液免疫增強作用的配伍相關(guān)性
    中成藥(2018年4期)2018-04-26 07:12:58
    黨參中二氧化硫殘留量的測定
    中成藥(2018年1期)2018-02-02 07:20:31
    HPLC法同時測定黨參固本丸中7種成分
    中成藥(2017年10期)2017-11-16 00:50:06
    黨參中黨參炔苷和蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ純化工藝優(yōu)化及抗氧化部位篩選
    中成藥(2017年6期)2017-06-13 07:30:35
    黨參水提物對D-半乳糖致衰老小鼠腎組織microRNA表達譜的影響
    黨參質(zhì)松不甜該怎么辦
    亚洲国产精品sss在线观看| 国产精品综合久久久久久久免费| av天堂在线播放| avwww免费| 精品久久国产蜜桃| 97热精品久久久久久| 可以在线观看的亚洲视频| 午夜福利成人在线免费观看| 伦精品一区二区三区| 全区人妻精品视频| 亚洲成人中文字幕在线播放| 亚洲性夜色夜夜综合| 国模一区二区三区四区视频| 人妻久久中文字幕网| 少妇的逼水好多| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 亚洲美女视频黄频| 校园人妻丝袜中文字幕| 在线看三级毛片| 亚洲在线自拍视频| 成人特级黄色片久久久久久久| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 女人被狂操c到高潮| 搡老妇女老女人老熟妇| 国内揄拍国产精品人妻在线| 午夜影院日韩av| 国产不卡一卡二| 日本 av在线| 一进一出好大好爽视频| 国产精品人妻久久久影院| 国产男靠女视频免费网站| 不卡视频在线观看欧美| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 国产高清有码在线观看视频| 日本黄色视频三级网站网址| av在线老鸭窝| 极品教师在线免费播放| 此物有八面人人有两片| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 欧美极品一区二区三区四区| а√天堂www在线а√下载| 久久亚洲精品不卡| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 女的被弄到高潮叫床怎么办 | 人妻久久中文字幕网| 午夜老司机福利剧场| 长腿黑丝高跟| 日韩精品青青久久久久久| 国产探花极品一区二区| 精品午夜福利视频在线观看一区| 亚洲黑人精品在线| 国产精品,欧美在线| av在线蜜桃| 国产精品不卡视频一区二区| 国产单亲对白刺激| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 最新中文字幕久久久久| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 欧美潮喷喷水| xxxwww97欧美| 亚洲精品久久国产高清桃花| 少妇的逼好多水| 国产一区二区三区av在线 | 在线观看美女被高潮喷水网站| 草草在线视频免费看| 两个人的视频大全免费| 波多野结衣巨乳人妻| 极品教师在线视频| 国产成人影院久久av| 99久久成人亚洲精品观看| 露出奶头的视频| 美女免费视频网站| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 免费人成在线观看视频色| 一级av片app| 久久久久九九精品影院| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 亚洲精品日韩av片在线观看| 日日撸夜夜添| 成年女人永久免费观看视频| 精品午夜福利在线看| 国产成年人精品一区二区| 少妇的逼好多水| 亚洲国产精品成人综合色| 麻豆成人午夜福利视频| 国产精品久久久久久久久免| 日本一本二区三区精品| 免费av观看视频| 国产高清不卡午夜福利| 22中文网久久字幕| 日本色播在线视频| 丰满的人妻完整版| 麻豆国产97在线/欧美| 午夜亚洲福利在线播放| 性色avwww在线观看| 在现免费观看毛片| 日本黄色片子视频| 精品一区二区三区av网在线观看| 欧美人与善性xxx| 九九在线视频观看精品| 日日啪夜夜撸| 一进一出好大好爽视频| 有码 亚洲区| videossex国产| 人妻久久中文字幕网| 色综合婷婷激情| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 国产精品无大码| 精品乱码久久久久久99久播| 欧美一区二区亚洲| 最近在线观看免费完整版| 亚洲一区高清亚洲精品| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 不卡视频在线观看欧美| 97碰自拍视频| 99热网站在线观看| 欧美一区二区亚洲| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 国产大屁股一区二区在线视频| 日韩精品中文字幕看吧| 男人舔奶头视频| 美女大奶头视频| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 性色avwww在线观看| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| av在线老鸭窝| 亚洲,欧美,日韩| 在线观看免费视频日本深夜| 91久久精品电影网| 亚洲美女黄片视频| 丰满的人妻完整版| www.色视频.com| 久久久久久久午夜电影| 国产黄色小视频在线观看| 国产精品久久久久久av不卡| 成人性生交大片免费视频hd| 国产综合懂色| 国产亚洲精品av在线| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 久久欧美精品欧美久久欧美| 国产主播在线观看一区二区| 国产精品三级大全| 美女cb高潮喷水在线观看| 久99久视频精品免费| 99热这里只有是精品在线观看| 少妇人妻精品综合一区二区 | 少妇的逼水好多| 久久香蕉精品热| 精品久久久久久久久亚洲 | 精品人妻一区二区三区麻豆 | 99精品久久久久人妻精品| 午夜爱爱视频在线播放| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 色视频www国产| 久久人妻av系列| 亚洲无线观看免费| 国产精品久久久久久久电影| 久久欧美精品欧美久久欧美| 日日撸夜夜添| 日本爱情动作片www.在线观看 | 欧美色欧美亚洲另类二区| 久久精品国产亚洲av天美| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 午夜福利成人在线免费观看| 可以在线观看毛片的网站| 12—13女人毛片做爰片一| 男女边吃奶边做爰视频| 91麻豆av在线| 免费观看在线日韩| 超碰av人人做人人爽久久| 老司机福利观看| 免费av不卡在线播放| 高清日韩中文字幕在线| 在线免费观看不下载黄p国产 | 久久久久国内视频| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 日韩精品青青久久久久久| 观看美女的网站| 亚洲人成伊人成综合网2020| 又紧又爽又黄一区二区| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 中出人妻视频一区二区| 国产视频一区二区在线看| 国产av不卡久久| xxxwww97欧美| 中文亚洲av片在线观看爽| 亚洲av成人av| 精品午夜福利视频在线观看一区| 身体一侧抽搐| 欧美日韩乱码在线| 久久久精品大字幕| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 天天躁日日操中文字幕| 99热精品在线国产| www日本黄色视频网| 中国美女看黄片| 精品久久久噜噜| 此物有八面人人有两片| 亚洲国产精品成人综合色| 国产高清三级在线| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| av在线天堂中文字幕| 女的被弄到高潮叫床怎么办 | 免费在线观看成人毛片| 欧美最新免费一区二区三区| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 精品久久久久久成人av| 久久久久久九九精品二区国产| 淫秽高清视频在线观看| 亚洲第一电影网av| 亚洲真实伦在线观看| 91久久精品国产一区二区成人| 十八禁国产超污无遮挡网站| 村上凉子中文字幕在线| 久久九九热精品免费| 看黄色毛片网站| 婷婷色综合大香蕉| bbb黄色大片| 成人永久免费在线观看视频| 亚洲av美国av| 亚洲人成伊人成综合网2020| 成人永久免费在线观看视频| 久久人人爽人人爽人人片va| 中出人妻视频一区二区| 日本黄色视频三级网站网址| 最近中文字幕高清免费大全6 | 久久精品国产自在天天线| 99久久精品国产国产毛片| 日韩在线高清观看一区二区三区 | 久久久国产成人精品二区| 国语自产精品视频在线第100页| 88av欧美| aaaaa片日本免费| 网址你懂的国产日韩在线| 国产高清视频在线观看网站| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 最新在线观看一区二区三区| 永久网站在线| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 亚洲第一电影网av| 村上凉子中文字幕在线| 久9热在线精品视频| 国产伦一二天堂av在线观看| 亚洲自偷自拍三级| 亚洲久久久久久中文字幕| 精品不卡国产一区二区三区| 亚洲av美国av| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 精品一区二区三区人妻视频| 日本a在线网址| 久久人妻av系列| 免费看a级黄色片| www.www免费av| 欧美高清成人免费视频www| 草草在线视频免费看| 亚洲人与动物交配视频| 日本成人三级电影网站| 国产黄色小视频在线观看| 亚洲人成网站高清观看| www日本黄色视频网| 最近在线观看免费完整版| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 日本精品一区二区三区蜜桃| 九九爱精品视频在线观看| 一区二区三区高清视频在线| 午夜福利在线观看吧| 中文字幕高清在线视频| 热99在线观看视频| xxxwww97欧美| 老熟妇仑乱视频hdxx| 欧美激情在线99| 免费在线观看日本一区| 国产精品av视频在线免费观看| 国产成人aa在线观看| 日韩精品中文字幕看吧| 最近视频中文字幕2019在线8| 久久久久久久久久久丰满 | 性色avwww在线观看| 在线观看舔阴道视频| 免费电影在线观看免费观看| 两人在一起打扑克的视频| 在线天堂最新版资源| 观看美女的网站| 日韩大尺度精品在线看网址| 亚洲综合色惰| 亚洲欧美激情综合另类| 国产一区二区三区视频了| 午夜亚洲福利在线播放| 免费观看精品视频网站| www日本黄色视频网| 午夜爱爱视频在线播放| 日本黄色视频三级网站网址| 极品教师在线免费播放| 免费观看精品视频网站| 国产精品一及| 午夜福利成人在线免费观看| 中文字幕av成人在线电影| 欧美成人一区二区免费高清观看| 不卡视频在线观看欧美| 舔av片在线| 国产综合懂色| 亚洲美女视频黄频| 极品教师在线视频| 免费看a级黄色片| 国产亚洲av嫩草精品影院| 搞女人的毛片| 综合色av麻豆| 十八禁国产超污无遮挡网站| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 国产中年淑女户外野战色| 日本成人三级电影网站| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 午夜视频国产福利| 亚洲av免费在线观看| 成熟少妇高潮喷水视频| 午夜福利18| 亚洲av免费高清在线观看| 欧美精品啪啪一区二区三区| 欧美一区二区亚洲| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 亚洲av.av天堂| 欧美中文日本在线观看视频| 日韩一本色道免费dvd| 97热精品久久久久久| 老司机深夜福利视频在线观看| 变态另类丝袜制服| 十八禁国产超污无遮挡网站| 色综合亚洲欧美另类图片| 国产单亲对白刺激| 国产精品乱码一区二三区的特点| 欧美精品国产亚洲| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 亚洲自拍偷在线| 熟女人妻精品中文字幕| 日本-黄色视频高清免费观看| 91久久精品国产一区二区成人| 成人欧美大片| 久久久久久久久久黄片| 国产在视频线在精品| 亚洲欧美日韩无卡精品| 韩国av在线不卡| 悠悠久久av| 夜夜爽天天搞| 国产精品99久久久久久久久| av在线天堂中文字幕| 窝窝影院91人妻| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 天堂影院成人在线观看| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 黄色女人牲交| 色av中文字幕| 亚洲美女黄片视频| 两人在一起打扑克的视频| 欧美一区二区精品小视频在线| 日韩欧美精品免费久久| 国产乱人伦免费视频| 午夜亚洲福利在线播放| 成人永久免费在线观看视频| 乱人视频在线观看| 久久久久久久久中文| 亚洲18禁久久av| 级片在线观看| 一进一出好大好爽视频| 久久久久久久久久久丰满 | 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 悠悠久久av| 亚洲欧美清纯卡通| 国产精品久久久久久久电影| 高清毛片免费观看视频网站| 国产精品亚洲一级av第二区| 亚洲精品影视一区二区三区av| 特级一级黄色大片| 极品教师在线免费播放| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 淫秽高清视频在线观看| 亚洲中文日韩欧美视频| 淫秽高清视频在线观看| 看黄色毛片网站| 床上黄色一级片| 天堂网av新在线| 免费电影在线观看免费观看| 亚洲第一电影网av| 久久久久久伊人网av| 亚洲av电影不卡..在线观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 亚洲国产色片| 两个人的视频大全免费| 亚洲国产色片| 老熟妇仑乱视频hdxx| 午夜老司机福利剧场| 午夜视频国产福利| 日韩中字成人| 床上黄色一级片| 国产成人av教育| 亚洲午夜理论影院| 亚洲av美国av| 最新在线观看一区二区三区| 午夜日韩欧美国产| 国产免费av片在线观看野外av| 三级毛片av免费| 日本黄色视频三级网站网址| 天美传媒精品一区二区| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 日韩精品青青久久久久久| 在线观看美女被高潮喷水网站| 久久国产精品人妻蜜桃| 永久网站在线| 亚洲自拍偷在线| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 精品国内亚洲2022精品成人| 91麻豆精品激情在线观看国产| 免费黄网站久久成人精品| 亚洲精品成人久久久久久| 在线免费观看不下载黄p国产 | 熟女人妻精品中文字幕| 成人国产一区最新在线观看| 一级黄片播放器| av在线蜜桃| 男人和女人高潮做爰伦理| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 岛国在线免费视频观看| 内射极品少妇av片p| a级毛片免费高清观看在线播放| 国产伦精品一区二区三区四那| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 我的老师免费观看完整版| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 久久久成人免费电影| 国产欧美日韩精品亚洲av| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 少妇丰满av| 99热这里只有精品一区| 国产高清激情床上av| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 亚洲精品日韩av片在线观看| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 男女下面进入的视频免费午夜| 午夜福利成人在线免费观看| 亚洲美女视频黄频| 老熟妇仑乱视频hdxx| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 在线a可以看的网站| 99riav亚洲国产免费| 女同久久另类99精品国产91| 午夜免费激情av| 久久香蕉精品热| 日韩高清综合在线| 精品不卡国产一区二区三区| 日本一二三区视频观看| 国产免费一级a男人的天堂| 国模一区二区三区四区视频| 欧美三级亚洲精品| 麻豆成人午夜福利视频| 亚洲av中文av极速乱 | 日日啪夜夜撸| 欧美一区二区亚洲| 欧美一级a爱片免费观看看| 久久人人爽人人爽人人片va| 美女被艹到高潮喷水动态| 精品久久久久久久久av| 国产在线男女| 黄色视频,在线免费观看| 色5月婷婷丁香| 超碰av人人做人人爽久久| 天天一区二区日本电影三级| 69人妻影院| 婷婷亚洲欧美| 一区二区三区免费毛片| 亚洲国产高清在线一区二区三| 亚洲最大成人手机在线| 亚洲成人久久性| 国产成人av教育| 午夜影院日韩av| 婷婷丁香在线五月| 少妇丰满av| 黄色丝袜av网址大全| 一进一出好大好爽视频| 国产精品一区二区免费欧美| 波多野结衣高清作品| 日日摸夜夜添夜夜添小说| a级毛片a级免费在线| 91在线观看av| 亚洲av第一区精品v没综合| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 99久久九九国产精品国产免费| 啪啪无遮挡十八禁网站| 九九在线视频观看精品| 最近在线观看免费完整版| 久久精品人妻少妇| 最新在线观看一区二区三区| 久久精品国产自在天天线| 99久久成人亚洲精品观看| 欧美黑人欧美精品刺激| 免费人成在线观看视频色| 亚洲最大成人av| 伦精品一区二区三区| 日日干狠狠操夜夜爽| 国产黄片美女视频| a在线观看视频网站| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 简卡轻食公司| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 成人性生交大片免费视频hd| 国产av在哪里看| 国产精品伦人一区二区| 男人舔女人下体高潮全视频| 国产大屁股一区二区在线视频| 99在线人妻在线中文字幕| 国产精品亚洲一级av第二区| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 日本成人三级电影网站| 在现免费观看毛片| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 日韩av在线大香蕉| 不卡视频在线观看欧美| 日韩强制内射视频| 在线国产一区二区在线| 久久精品综合一区二区三区| 99久久成人亚洲精品观看| 3wmmmm亚洲av在线观看| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 国产精品福利在线免费观看| 国产视频内射| 精品久久久久久,| 又爽又黄无遮挡网站| 日韩精品青青久久久久久| 99热6这里只有精品| 神马国产精品三级电影在线观看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 成人特级黄色片久久久久久久| 亚洲黑人精品在线| 婷婷亚洲欧美| 男女视频在线观看网站免费| 亚洲第一区二区三区不卡| 99在线视频只有这里精品首页| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 人妻久久中文字幕网| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 国产av麻豆久久久久久久| 国产黄色小视频在线观看| 欧美区成人在线视频| bbb黄色大片| 3wmmmm亚洲av在线观看| 亚洲av成人精品一区久久| 舔av片在线| 国产黄片美女视频| 久久久色成人| 欧美日本亚洲视频在线播放| 久久久久久久久久久丰满 | 国产久久久一区二区三区| 99热网站在线观看| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 在线a可以看的网站| 99在线视频只有这里精品首页| 亚洲成人精品中文字幕电影| 久久久久性生活片| 亚洲成人精品中文字幕电影| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 淫妇啪啪啪对白视频| 听说在线观看完整版免费高清| 亚洲欧美日韩东京热| 亚洲精品影视一区二区三区av| 12—13女人毛片做爰片一| 免费看日本二区| 99久久精品热视频| 日韩大尺度精品在线看网址| 午夜亚洲福利在线播放| 熟女电影av网| 午夜激情欧美在线| 男人舔女人下体高潮全视频| 成人美女网站在线观看视频| 在线观看美女被高潮喷水网站| 国内精品一区二区在线观看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 亚洲av中文av极速乱 | 亚洲精品成人久久久久久| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 国产av不卡久久| 亚洲国产精品合色在线| 久久午夜亚洲精品久久| 美女大奶头视频| 亚洲在线自拍视频| 国产伦人伦偷精品视频| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 成人鲁丝片一二三区免费| 99久久中文字幕三级久久日本| 看黄色毛片网站| videossex国产| 大型黄色视频在线免费观看| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 搡老熟女国产l中国老女人| 俺也久久电影网| 婷婷精品国产亚洲av在线| 国产精品久久电影中文字幕| 九色成人免费人妻av| 少妇熟女aⅴ在线视频| 日本欧美国产在线视频| 国产一区二区三区av在线 | 亚洲国产精品久久男人天堂| 有码 亚洲区| 国产黄片美女视频| 热99re8久久精品国产| 国产av麻豆久久久久久久| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 国产探花极品一区二区| 亚洲国产精品成人综合色| 亚洲电影在线观看av| 男人狂女人下面高潮的视频| 国产成年人精品一区二区| 日本熟妇午夜| 欧美色视频一区免费|