lncRNA MEG3通過調(diào)控miR-543/PTEN分子軸抑制胰腺癌細胞增殖及轉(zhuǎn)移的機制

成鑒曉，江月萍，任琳琳，鞏芮寧，章程

0 引言

雖然胰腺癌的診斷和治療已經(jīng)取得了明顯的進步，但胰腺癌高侵襲性和易轉(zhuǎn)移性，造成患者高死亡率和極差的預后。為此，尋找可用于胰腺癌早期診斷及預后判斷的生物標志物具有重要的臨床意義。近年來，長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA, lncRNA）已被證實在多種腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[1-2]。母系表達基因3（maternally expressed gene 3, MEG3）作為腫瘤的抑癌基因[3]參與調(diào)控宮頸癌[4]、結直腸癌[5]、慢性髓系白血病[6]、胰腺癌[7]等多種惡性腫瘤細胞增殖和侵襲。同時，多項研究發(fā)現(xiàn)，lncRNAs與miR-NAs的相互作用在癌癥發(fā)生過程中起重要作用，而miRNAs能夠通過調(diào)控其下游蛋白介導腫瘤發(fā)展進程[8]。這預示lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡有望成為胰腺癌診斷和治療的分子標志物。本研究通過檢測MEG3在胰腺癌臨床組織樣本及細胞系中的表達，再經(jīng)細胞實驗進一步驗證MEG3通過調(diào)控miR-543/PTEN分子軸介導胰腺癌PANC-1細胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用機制。

1 材料與方法

1.1 樣本收集、細胞和主要試劑

收集2012年4月至2017年12月間青島大學附屬醫(yī)院收治的資料完整的胰腺癌30例，所有研究對象對本研究均簽署知情同意書。本研究經(jīng)青島大學附屬醫(yī)院倫理委員會批準。人胰腺癌細胞株（PANC-1, Capan-1, BaxPC-3和SW1990）和人胰腺導管上皮細胞株（HPDE6-C7）均購自中科院上海細胞研究所。DMEM和胎牛血清購自美國Gibco公司；Lipofectamine 2000和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司；CCK-8試劑盒購自南京建成生物工程研究所；Transwell小室購自美國康寧公司；高純總RNA快速提取試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司；蛋白提取試劑盒和SDS-PAGE凝膠快速制備試劑盒購自美國Bio-Rad公司；雙熒光素酶報告基因試劑盒和報告基因載體購自索萊寶科技公司；免疫印跡一抗（抗PTEN抗體、抗E-cadherin抗體、抗N-cadherin抗體和抗Vimentin抗體）和二抗（IgG（H+L））均購自美國CST公司。

1.2 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

人胰腺癌細胞株和人胰腺導管上皮細胞采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

選取對數(shù)生長期的胰腺癌（PANC-1）細胞，胰酶消化后，利用DMEM培養(yǎng)基調(diào)整濃度細胞為每毫升1×105個。將細胞接種到6孔板，每孔添加2 ml細胞懸液，并于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，進行pcDNA-MEG3、MEG3 shRNA、miR-543 mimics/inhibitor和PTEN siRNA轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染方法參考Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書，轉(zhuǎn)染48 h后于熒光顯微鏡下觀察細胞轉(zhuǎn)染效果。

1.3 實驗方法

1.3.1 qRT-PCR法檢測MEG3、miR-543和PTEN的表達 收集臨床樣本及轉(zhuǎn)染后48 h的胰腺癌細胞，并采用TRIzol一步法分別提取組織和培養(yǎng)好的細胞中總RNA。NanoDrop檢測RNA的濃度及純度，并反轉(zhuǎn)錄制備cDNA。取2 μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行PCR檢測。按試劑盒說明建立終體積為20 μl的PCR反應體系：2 μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、10 μl SYBR Green Mix、上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μl，并采用ddH2O補足至20 μl。PCR熱循環(huán)參數(shù)為： 95℃5 min，然后3步反應：94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸60 s，45個循環(huán)。引物序列如下，U6:F: 5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，R: 5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。GAPDH: F: 5’-GGTCTCCTCTGACTTCAACA-3’，R: 5’-GTGAGGGTCTCTCTCTTCCT-3’。MEG3:F: 5’-CAGCCAAGCTTCTTGAAAGG-3’，R:5’-TTCCACGGAGTAGAGCGAGT-3’。miR-543: F:5’-GGGGAAACATTCGCGGTGCA-3’，R: 5’-TGCGTGTCGTGGAGTC-3’。檢測結果采用2-ΔΔCt法進行計算。實驗重復3次。

1.3.2 Western blot檢測PANC-1細胞中PTEN和EMT相關蛋白的表達 收集轉(zhuǎn)染48 h的細胞，使用RIPA蛋白裂解液提取各組細胞總蛋白，BCA檢測蛋白濃度。使用10%SDS-PAGE進行電泳分離目的蛋白，電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上，封閉后加入相應一抗4℃過夜孵育，洗滌后HRP標記二抗37℃孵育1 h，使用ECL化學發(fā)光劑顯色，最后在凝膠成像儀上掃描分析，采用Image J軟件分析靶帶的灰度水平。實驗重復3次。

1.3.3 CCK-8實驗檢測PANC-1細胞增殖活力 將處于對數(shù)生長期的胰腺癌PANC-1細胞接種于96孔板，每孔含細胞1×105個，每孔含培養(yǎng)基100 μl。待檢測前1 h向每孔加入10 μl CCK-8溶液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4 h。用酶標儀測定450 nm處的吸光度。實驗重復3次。

1.3.4 Transwell實驗檢測PANC-1細胞侵襲能力 選擇轉(zhuǎn)染細胞為實驗組，未轉(zhuǎn)染細胞為對照組。分別將各處理組細胞用胰酶消化處理后接種于Transwell小室24孔板內(nèi)，上室加100 μl（密度為1×105個/毫升）細胞懸液，下室加250 μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，取出小室，棉簽擦去微孔膜上室的細胞，PBS小心沖洗小室2遍，4%多聚甲醛固定侵襲并黏附到小室微孔膜下面的細胞15 min，結晶紫染色15 min，PBS沖洗小室，干燥后置于100倍的倒置顯微鏡下觀察。每組實驗重復3次。

1.3.5 雙熒光素酶報告基因驗證MEG3、miR-543和PTEN的靶向關系 利用生物信息分析軟件預測MEG3與miR-543以及miR-543與PTEN的結合片段，PCR分別擴增MEG3和PTEN與miR-543的結合片段。擴增產(chǎn)物插入到pGL3-Promoter質(zhì)粒載體中，構建MEG3和PTEN野生型（WT）質(zhì)粒；利用基因突變技術將結合片段定點突變，構建MEG3和PTEN突變型（MUT）質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒分別與miR-543、miR-NC共同轉(zhuǎn)染293T細胞。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細胞。熒光素酶檢測按照雙熒光素酶報告基因試劑盒說明書，采用酶標儀檢測螢火蟲和海腎熒光值，并以海腎熒光值作為內(nèi)參。

1.4 統(tǒng)計學方法

圖1 MEG3在胰腺癌組織及細胞系中的表達水平Figure1 Expression of MEG3 in pancreatic cancer tissues and cell lines

圖2 過表達MEG3對胰腺癌細胞增殖、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響Figure2 Effect of MEG3 overexpression on proliferation, invasion and epithelial mesenchymal transition (EMT) of pancreatic cancer cells

2 結果

2.1 MEG3在胰腺癌組織及細胞系中的表達

qRT-PCR檢測結果顯示，MEG3在胰腺癌組織中的表達水平明顯低于癌旁組織（t=2.585,P=0.006），見圖1A。同時，采用Kaplan-Meier生存曲線分析發(fā)現(xiàn)，MEG3表達下調(diào)的胰腺癌患者預后較差，生存率顯著低于MEG3高表達的患者（P=0.002），見圖1B。此外，MEG3在胰腺癌細胞系（PANC-1、Capan-1、BaxPC-3和SW1990）中的表達水平顯著低于人胰腺導管上皮細胞（HPDE6-C7）（F=20.717, P=0.003），且PANC-1細胞中MEG3的表達水平明顯低于Capan-1、BaxPC-3和SW1990（F=7.011, P=0.045），見圖1C，故選擇該PANC-1細胞進行后續(xù)實驗。由此可知，MEG3的異常表達可能與胰腺癌發(fā)生發(fā)展有關聯(lián)。

2.2 過表達MEG3對胰腺癌細胞增殖、侵襲和凋亡的影響

qRT-PCR檢測結果證實，過表達MEG3可穩(wěn)定上調(diào)PANC-1細胞中MEG3的表達水平（t=16.645,P=0.002），見圖2A。CCK-8檢測結果證實，過表達MEG3可顯著抑制PANC-1細胞增殖活力（t=4.530,P=0.005），見圖2B。同時，Transwell檢測結果顯示，過表達MEG3后PANC-1細胞侵襲能力明顯受到抑制（t=13.197, P=0.003），見圖2C。Western blot檢測結果表明，相比于對照組，過表達MEG3顯著促進了PANC-1細胞上皮細胞標志物E-cadherin的表達（t=10.040,P=0.005），明顯下調(diào)了間質(zhì)細胞標志物N-cadherin和Vimentin的表達水平（t1=3.904, P=0.030, t2=5.349,P=0.017），見圖2D。由此可知，過表達MEG3顯著抑制了PANC-1細胞增殖、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）能力。

圖3 MEG3對miR-543表達的調(diào)控作用Figure3 Effect of MEG3 on miR-543 expression

圖4 miR-543對PTEN表達的調(diào)控作用Figure4 Effect of miR-543 on PTEN expression

2.3 MEG3對miR-543表達的調(diào)控作用

生物信息學數(shù)據(jù)庫StarBase預測發(fā)現(xiàn)，miR-543是MEG3的靶基因，其預測序列如圖3A所示。雙熒光素酶報告基因驗證結果顯示，過表達miR-543可以使熒光素酶活性顯著下降（t=6.254, P=0.002），見圖3B，而共轉(zhuǎn)染miR-543 mimics和靶向位點發(fā)生突變的pmirGLO-MEG3-mut載體，miR-543對熒光素酶活性的抑制作用喪失。進一步，qRT-PCR分析結果表明，過表達MEG3后顯著抑制了miR-543的表達（t=7.080, P=0.009），見圖3C。此外，通過對30例胰腺癌組織進行檢測發(fā)現(xiàn)，MEG3與miR-543的表達呈負相關（r=-0.717, P＜0.0001），見圖3D。由此可知，miR-543是MEG3的直接靶基因，且MEG3可負調(diào)控miR-543的表達。

2.4 miR-543對PTEN表達的調(diào)控作用

進一步，通過生物信息學數(shù)據(jù)庫TargetScan對miR-543的靶基因進行預測，發(fā)現(xiàn)PTEN是miR-543的候選靶基因，其預測結合序列見圖4A。隨后，雙熒光素酶報告基因驗證實驗發(fā)現(xiàn)，相比于野生型PTEN序列質(zhì)粒，過表達miR-543和野生型PTEN質(zhì)?？娠@著下調(diào)熒光素酶活性（t=4.789,P=0.020），轉(zhuǎn)染miR-543 mimic和突變型PTEN序列質(zhì)粒與單獨轉(zhuǎn)染突變型PTEN序列質(zhì)粒相比，熒光素酶活性無明顯變化（t=0.188, P=0.434），見圖4B。同時，Western blot檢測結果顯示，相比于對照組，miR-543過表達后可顯著下調(diào)PTEN蛋白的表達水平（t=5.145, P=0.018，圖4C）。此外，通過對30例胰腺癌組織樣本檢測發(fā)現(xiàn)，miR-543與PTEN的表達呈負相關（r=-0.892, P＜0.0001，圖4D）。由此可知，PTEN是miR-543的靶基因，并且miR-543可負調(diào)控PTEN的表達。

2.5 MEG3通過miR-543/PTEN分子軸對PANC-1細胞生物學行為產(chǎn)生影響

為了進一步明確MEG3通過靶向下調(diào)miR-543并上調(diào)PTEN對PANC-1細胞增殖、侵襲和EMT的作用機制，本實驗進一步觀察了細胞的生物學行為。qRT-PCR檢測結果證實，相比于對照組，敲降miR-543可顯著下調(diào)PANC-1細胞中miR-543的表達水平（t=9.009, P=0.006），而同時敲降MEG3或PTEN對miR-543的表達與對照組差異沒有統(tǒng)計學意義（t1=1.546, P=0.131, t2=1.359, P=0.154），見圖5A。Western blot檢測結果表明，相比于對照組，敲降miR-543顯著上調(diào)了PTEN的表達水平（t=11.559, P=0.004），而同時敲降MEG3或PTEN對PTEN的表達與對照組差異無統(tǒng)計學意義（t1=0.198, P=0.431； t2=0.918, P=0.228），見圖5B。隨后，CCK-8和Transwell檢測結果共同證實，敲降miR-543后顯著抑制了PANC-1細胞增殖及侵襲能力（t1=3.751, P=0.010； t2=8.150, P=0.007），而同時敲降MEG3或PTEN則減弱了敲降miR-543的抑制作用（t1=11.715, P=0.004, t2=7.695, P=0.008,F=59.744, P=0.004），見圖5C～E。此外，Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，敲降miR-543可顯著下調(diào)PANC-1細胞中N-cadherin和Vimentin的表達（t1=7.809,P=0.008； t2=10.780, P=0.004），而E-cadherin的表達則明顯上調(diào)（t=8.480, P=0.007），同時敲降MEG3或PTEN則恢復了敲降miR-543對EMT相關蛋白的調(diào)控作用（F1=52.574, P=0.005； F2=39.994, P=0.007；F3=63.480, P=0.004），見圖5F。結果表明，MEG3通過靶向下調(diào)miR-543對PTEN的抑制作用，進而抑制PANC-1細胞增殖、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

圖5 MEG3通過miR-543/PTEN分子軸對PANC-1細胞生物學行為的影響Figure5 MEG3 modulated biological behavior of pancreatic cancer cells via regulating miR-543/PTEN axis

3 討論

多項研究顯示，非編碼RNA在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色，其中l(wèi)ncRNAs生物學功能包括參與表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、miRNA調(diào)控、細胞分化及發(fā)育，其重要機制之一是通過對其周圍的相關編碼基因的選擇性表達發(fā)揮調(diào)控作用[9]。例如，MEG3在胰腺癌細胞中低表達，過表達MEG3可抑制胰腺癌增殖和轉(zhuǎn)移[10]。同時，過表達MEG3也被報道可顯著抑制膽囊癌[11]、宮頸癌[12]和骨肉瘤[13]細胞增殖和侵襲。同時，本研究也發(fā)現(xiàn)，MEG3在胰腺癌組織和細胞系中低表達，過表達MEG3可明顯抑制胰腺癌PANC-1細胞增殖、侵襲和EMT，再次證實MEG3對胰腺癌進程具有重要的調(diào)控作用。

為了進一步探索MEG3參與調(diào)控胰腺癌發(fā)生發(fā)展的作用機制而進行的功能研究表明，MEG3作為多種惡性腫瘤的抑癌基因，通過靶向結合下游miRNA并介導mRNA參與多種腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移。例如，Li等研究發(fā)現(xiàn)，MEG3通過靶向下調(diào)miR-184抑制慢性髓系白血病細胞增殖和轉(zhuǎn)移[14]。Long等證實，MEG3靶向下調(diào)miR-499-5p對CYLD表達起抑制作用，進而抑制黑色素瘤細胞增殖和侵襲[15]。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)，MEG3通過調(diào)控miR-421/E-cadherin抑制乳腺癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程[16]。Zheng等研究顯示，MEG3通過阻斷PKM2/β-catenin及上調(diào)PTEN的表達，進而抑制肝癌發(fā)展進程[17]。本研究通過StarBase數(shù)據(jù)庫分析可能與MEG3結合的miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-543是MEG3潛在的靶向作用基因。同時，大量研究證實，miR-543作為促癌基因，并在許多惡性腫瘤中高表達，比如前列腺癌[18]、非小細胞肺癌[19]、腎細胞癌[20]以及胃癌[21]。Yang等研究證實，過表達miR-543可顯著促進腎透明細胞癌細胞增殖和侵襲[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-543在胰腺癌組織中的表達明顯上調(diào)，且與胰腺癌細胞增殖、侵襲和EMT相關。同時，Zhao等研究證實，miR-543通過靶向下調(diào)PLA2G4A促進食管癌細胞增殖、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[23]。進一步，生物信息學數(shù)據(jù)庫TargetScan預測miR-543的靶基因可能為PTEN。大量研究證實，PTEN作為抑癌基因，其對癌細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡具有重要調(diào)控作用，且其在腫瘤中低表達[24]。Sun等研究發(fā)現(xiàn)，miR-543通過靶向下調(diào)PTEN促進結直腸癌細胞增殖、侵襲和遷移[25]。本研究證實，沉默miR-543是通過上調(diào)PTEN的表達來抑制PANC-1細胞增殖、侵襲和EMT。

綜上所述，本研究通過細胞實驗和臨床樣本充分證實，過表達MEG3通過下調(diào)miR-543對PTEN的抑制作用，進而抑制胰腺癌細胞增殖、侵襲和EMT，從而下調(diào)胰腺癌發(fā)生發(fā)展進程。