高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定馬鈴薯中的α-茄堿和α-卡茄堿

◎ 陳琳珊，陳佩佩，陳 茹，吳永坤

（1.廣東省食品工業(yè)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 511442；2.廣東省食品工業(yè)研究所有限公司，廣東 廣州 511442；3.廣東省質(zhì)量監(jiān)督食品檢驗(yàn)站，廣東 廣州 511442；4.中山市小欖鎮(zhèn)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)中心，廣東 中山 528400）

茄堿是一種有害的生物堿類(lèi)物質(zhì)，主要以糖苷的形式存在，一般出現(xiàn)在茄科類(lèi)作物中，尤其是腐敗的茄科蔬菜[1]，是導(dǎo)致茄科蔬菜中毒中的常見(jiàn)毒素之一。其主要成分為α-茄堿和α-卡茄堿，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。茄堿抑制體內(nèi)膽堿酯酶的活性，從而使乙酰膽堿積聚，引起神經(jīng)興奮，胃腸肌肉痙攣，中毒時(shí)出現(xiàn)腹痛、腹瀉、惡心和嘔吐等癥狀，情況嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致脫水、發(fā)熱、昏迷，甚至呼吸衰竭[2-3]。盡管有研究表明，茄堿對(duì)前列腺、肝、乳腺等癌細(xì)胞有一定的抑制作用[4-6]，但對(duì)消費(fèi)者日常飲食的危害也不容忽視。

圖1 α-茄堿和α-卡茄堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)式圖

目前，針對(duì)茄堿的分析方法主要分為化學(xué)方法、成像技術(shù)和生物技術(shù)3大類(lèi)[7]，由于分光光度法[8]、成像技術(shù)[9]、放射免疫[10]、酶聯(lián)免疫[11]和比色法[12]等方法存在定量不準(zhǔn)確、操作煩瑣、耗時(shí)長(zhǎng)和價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)，科研工作者的研究主要集中在高效液相色譜法[13]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[14]。但高效液相色譜法需調(diào)節(jié)流動(dòng)相使目標(biāo)物有效分離，因此分析時(shí)間長(zhǎng)，且α-茄堿和α-卡茄堿吸光度較弱，因此檢測(cè)波長(zhǎng)較低，容易受雜質(zhì)干擾，影響分析結(jié)果。質(zhì)譜法具有定性定量能力強(qiáng)、分析時(shí)間短、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，適合常規(guī)實(shí)驗(yàn)室的批量化檢測(cè)。本文建立的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，具有較高靈敏度，同時(shí)回收率高，重現(xiàn)性好，可為后續(xù)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

API4000Q TRAP質(zhì)譜儀（美國(guó)AB SCIEX公司）、島津LC-20AD液相色譜系統(tǒng)（日本島津公司）、4k-15離心機(jī)（北京卓明貿(mào)易有限公司）、IKA Vortex4渦旋混勻器（廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司）、Milli-Q Advantage A10 超純水系統(tǒng)（法國(guó)Merck Millipore公司）。

α-茄堿、α-卡茄堿（純度大于98.5%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司，購(gòu)自上海安譜公司）、甲酸、甲醇、乙腈（LC-MS級(jí)，美國(guó)Thermo Fisher公司）、C18、PSA、GCB、硅膠、NH2粉、中性氧化鋁、堿性氧化鋁（分析純，購(gòu)自上海安譜公司）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別稱(chēng)取兩種茄堿適量標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并稀釋成濃度為1 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，于4 ℃下避光保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：將標(biāo)準(zhǔn)溶液用乙腈稀釋為10 mg·L-1的中間液，將馬鈴薯基質(zhì)溶液依次稀釋為10 μg·L-1、20 μg·L-1、50 μg·L-1、100 μg·L-1、200 μg·L-1、500 μg·L-1、1 000 μg·L-1制作校準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)加入法定量。

1.3 樣品前處理

馬鈴薯樣品均質(zhì)。稱(chēng)取2.5 g樣品于50 mL離心管中，加5 mL 水和20 mL 0.5%甲酸乙腈溶液（V/V），渦旋混勻，加4.0 g無(wú)水硫酸鎂和1.5 g醋酸鈉粉末，渦旋提取10 min。后置于離心機(jī)中，以10 000 r·min-1離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至25 mL比色管中，并定容混勻。取1 mL提取液用50 mg C18凈化，過(guò)膜上機(jī)。

1.4 色譜條件

色譜柱：Xbridge BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：35 ℃；流動(dòng)相A（乙腈）-B（0.1%甲酸水溶液）（V/V）；流速：0.35 mL·min-1；梯度洗脫程序：0.0～0.5 min：40%A，0.5～3.0 min：40%～90%A，3.0～3.5 min：90%A，3.5～4.0 min：90%～40%A，4.0～5.0 min：40%A。

1.5 質(zhì)譜條件

離子源電離方式：正模式；氣簾氣壓力：25 psi；電離電壓（IS）：5 500 V；離子源溫度（TEM）：550 ℃；霧化氣（GAS1）：50 psi；加熱輔助氣（GAS2）：50 psi；碰撞氣（CAD）：medium；采集模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的確定

α-茄堿和α-卡茄堿均為糖苷，由于其主體結(jié)構(gòu)上含有一個(gè)叔胺堿的N原子，在ESI源正負(fù)離子模式均有響應(yīng)。經(jīng)兩種模式對(duì)相應(yīng)的母離子掃描后發(fā)現(xiàn)，正離子模式下母離子[M+H]+比負(fù)離子模式下的[M-H]-的響應(yīng)更強(qiáng)，可能是因?yàn)橹黧w結(jié)構(gòu)上的N原子或糖苷上的O原子獲取H原子的能力比糖苷上羥基-OH失去H原子更容易發(fā)生。確定母離子后，通過(guò)調(diào)節(jié)碰撞電壓（Collision Energy，CE）獲得盡可能多的二級(jí)子離子，以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式分別對(duì)去簇電壓（Declustering Potential，DP）及子離子對(duì)應(yīng)的碰撞電壓進(jìn)行優(yōu)化，α-茄堿和α-卡茄堿的MS/MS參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方法測(cè)定α-茄堿和α-卡茄堿的MS/MS參數(shù)表

2.2 色譜柱的選擇

α-茄堿和α-卡茄堿結(jié)構(gòu)十分相似，其差異僅為糖苷位置不同和糖苷上的羥基數(shù)量不同，在化學(xué)式上的差異也僅有一個(gè)O原子的質(zhì)量數(shù)，因此其色譜行為也十分相似，在色譜中難以分離，盡管對(duì)于三重四極桿結(jié)構(gòu)來(lái)說(shuō)，可不作細(xì)致的色譜分離，但由于化學(xué)式相似，為避免α-茄堿在離子源內(nèi)裂解出m/z852.9，影響定量結(jié)果，實(shí)驗(yàn)使用了安捷倫、Waters和菲羅門(mén)公司的3款色譜柱，對(duì)2種目標(biāo)物進(jìn)行分離。如圖2所示，只有Waters公司的Xbridge BEH C18色譜柱有良好分離效果，原因可能是色譜柱的粒徑大小對(duì)分離效果有較大影響，因此選擇Xbridge BEH C18色譜柱。

2.3 固相萃取劑種類(lèi)的選擇

在實(shí)驗(yàn)初期發(fā)現(xiàn)，在乙腈中加入甲酸能提高回收率，但體積在20 mL以上時(shí)，回收率變化不大，因此在此基礎(chǔ)上對(duì)固相萃取劑種類(lèi)進(jìn)行探究。使用量為50 mg時(shí)，結(jié)果顯示C18的回收率最高，GCB和堿性氧化鋁對(duì)目標(biāo)物吸附嚴(yán)重，回收率極低。盡管PSA和硅膠能吸附糖類(lèi)或其他大極性雜質(zhì)，但回收率也低于50%，綜合考慮，選擇C18對(duì)提取液進(jìn)行凈化，詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 固相萃取劑種類(lèi)對(duì)回收率的影響圖

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

樣品含有淀粉較多，若使用針對(duì)淀粉進(jìn)行凈化的固相萃取劑，對(duì)目標(biāo)物也有嚴(yán)重吸附，因此可能存在一定的基質(zhì)效應(yīng)。為進(jìn)一步考察，實(shí)驗(yàn)使用乙腈溶液配制濃度為100 μg·L-1的單點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)溶液，取2份馬鈴薯基質(zhì)液，1份直接測(cè)定本底值，1份用于配制基質(zhì)單點(diǎn)，濃度為100 μg·L-1。以乙腈溶液配制的單點(diǎn)計(jì)算，扣除本底值后，基質(zhì)單點(diǎn)中α-茄堿和α-卡茄堿的濃度分別為43.5 μg·L-1和48.1 μg·L-1，說(shuō)明基質(zhì)效應(yīng)抑制響應(yīng)值比例為原來(lái)的45%，小于80%，需用基質(zhì)曲線進(jìn)行校正，由于沒(méi)有找到空白的基質(zhì)樣品，因此校正濃度截距后定量。

2.5 定量方程及準(zhǔn)確性

使用馬鈴薯基質(zhì)液配制曲線后測(cè)定，以峰面積（Y）對(duì)質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行線性回歸，得到的曲線的X軸截距的絕對(duì)值為該樣品含量，若要使用此曲線對(duì)其他馬鈴薯樣品進(jìn)行定量，需將X軸截距校正至原點(diǎn)。在1.2的線性范圍內(nèi)（10～1 000 μg·L-1），測(cè)定α-茄堿和α-卡茄堿的曲線方程分別為Y=88.5X+3 800和Y=157X+2 970，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 6和0.999 4。按照信噪比的3倍和10倍不斷稀釋樣品濃度后，方法檢出限均為0.1 mg·kg-1，定量限均為0.3 mg·kg-1。線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限均滿(mǎn)足一般樣品中α-茄堿和α-卡茄堿含量的測(cè)定，達(dá)到準(zhǔn)確定量。

2.6 方法學(xué)結(jié)果評(píng)價(jià)

按1.3對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，選擇含量最低的樣品平均測(cè)定6次，取其平均含量作為本底值。按照本底值附近的1倍、2倍和5倍3個(gè)水平進(jìn)行加標(biāo)。每個(gè)水平測(cè)定6次，α-茄堿和α-卡茄堿的3個(gè)添加水平的平均回收率范圍在85.7%～99.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD在1.89%～3.31%?；厥章始熬芏染苓_(dá)到定量要求，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 α-茄堿和α-卡茄堿的回收率和精密度表（n=6）

3 結(jié)論

建立HPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定馬鈴薯中α-茄堿和α-卡茄堿，使用甲酸-乙腈萃取后，鹽析離心，進(jìn)一步使用C18固相萃取劑凈化，回收率達(dá)85%以上；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式對(duì)母離子和子離子進(jìn)行掃描，優(yōu)化了質(zhì)譜參數(shù)，使方法整體檢出限和定量限達(dá)到分析定量要求；使用不同色譜柱進(jìn)行對(duì)比，在優(yōu)化的色譜條件下，α-茄堿和α-卡茄堿2 min內(nèi)完全分離，且分離度高；3水平加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果表明，該方法可作為日常馬鈴薯品質(zhì)監(jiān)控的有效手段。